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Valutazione funzionale della barriera epiteliale gingivale del topo utilizzando traccianti fluorescenti

DOI:

10.3791/70085

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un approccio standardizzato per valutare quantitativamente l'integrità della barriera epiteliale gingivale murina applicando topicamente destranti marcati con fluorescenza di dimensioni molecolari variabili sulla superficie gengivale in vivo, seguiti da imaging ex vivo utilizzando un sistema di microscopia a fotone singolo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La barriera epiteliale gengivale funge da difesa fondamentale in prima linea nell'immunità orale e nell'omeostasi. Una barriera epiteliale intatta impedisce efficacemente la penetrazione di sostanze nocive dall'ambiente orale, mentre la sua alterazione è strettamente associata alla patogenesi di condizioni come la parodontite e il lichene plano orale. Qui, abbiamo stabilito un metodo applicativo topico per valutare l'integrità della barriera epiteliale gengivale nei topi. Per prima cosa, una miscela di destranti marcati con fluorescenze con diversi pesi molecolari (40 o 70 kDa) in un carbosilmetilcellulosa di sodio al 2% è stata applicata topicamente sulla superficie gengivale labiale della regione molare. Dopo un periodo di incubazione di 30 minuti, la mascella veniva sezionata e fissata in un supporto personalizzato per l'imaging immediato utilizzando un sistema di microscopia a fotone singolo. Questo approccio consente la visualizzazione e la quantificazione di tracce di diverse dimensioni attraverso gli strati epiteliali, fornendo una lettura funzionale dell'integrità della barriera epiteliale gengivale applicabile agli studi sull'infiammazione orale, la guarigione delle ferite e la modellazione delle malattie.

Introduction

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La barriera epiteliale gengivale costituisce un'interfaccia difensiva critica nella cavità orale, preservando l'integrità dei tessuti regolando selettivamente il trasporto delle sostanze e prevenendo l'invasionemicrobica 1. Composta da epitelio squamoso stratificato interconnesso da complessi di giunzioni strette, questa struttura dinamica controlla con precisione la permeabilità paracellulare per limitare la penetrazione non selettiva di microrganismi, macromolecole esoluti 2. Molteplici fattori possono compromettere l'integrità della barriera gengivalica. La cavità orale ospita la seconda comunità microbica più diversificata del corpo umano, con oltre 700 specie batteriche che colonizzano le superfici dei denti, le fessure gengivali e la mucosaorale 3,4. Le cellule epiteliali che rivestono i tessuti gengivali sono costantemente esposte a questo denso ambientemicrobico 5.

I fattori di virulenza secreti dai patogeni parodontali (ad esempio, Porphyromonas gingivalis), inclusi i lipopolisaccaridi, hanno dimostrato di compromettere la funzione della barriera epiteliale, scatenando così risposte infiammatorie nei tessuti gengivali e guidando una progressionepatologica 6,7. I mediatori infiammatori e i fattori di stress meccanici aggravano ulteriormente la disfunzione della barriera, aumentando la suscettibilità alle malattieorali 8. I probiotici orali possono aiutare a prevenire la malattia parodontale promuovendo la stabilità della barriera epiteliale gengivaliale. Tuttavia, le interazioni biologiche tra microrganismi e cellule epiteliali gengivali nella modulazione della funzione barriera rimangono in gran parteinesplorate. Pertanto, lo sviluppo di metodi affidabili per valutare la funzione della barriera epiteliale è di fondamentale importanza.

La microscopia laser a fotone singolo, riconosciuta per la sua alta risoluzione e il sistema di rilevamento consolidato, si è rivelata particolarmente utile per l'esame di campioni di tessuto ex vivo 10. Metodologie avanzate di imaging migliorano significativamente la valutazione delle proprietà della barriera gengivali. La natura superficiale dei tessuti gengivali, con cellule epiteliali situate a circa 100 μm dalla superficie, la rende ideale per tali approcci di imaging. La nostra ricerca ha stabilito una tecnica di valutazione ex vivo che utilizza destrani marcati con fluorescenza di peso molecolare variabile come tracciatori di permeabilità paracellulare. Combinato con la microscopia laser a fotone singolo, questo metodo consente una quantificazione accurata della funzione della barriera epiteliale gingivali, fornendo informazioni sui meccanismi della malattia parodontale e sui potenziali interventi terapeutici.

Il protocollo stabilito in questo studio, che combina la somministrazione localizzata di tracce a base di gel con imaging ex vivo tridimensionale, è specificamente ottimizzato per affrontare le sfide uniche della valutazione della barriera epiteliale gengivali. Innanzitutto, gli approcci esistenti di iniezione intravenosa di traccianti (Tabella 1) non sono in grado di valutare con precisione la permeabilità dei siti epiteliali minuscoli localizzati agli agentiesterni 11. In secondo luogo, gli approcci istologici tradizionali richiedono la decalcificazione e la sezione, che disturbano l'architettura tissutale e sono laboriosi e richiedono molto tempo 12,13,14. Al contrario, il nostro protocollo utilizza un gel altamente adesivo per ottenere una ritenzione efficace dei tracanti sulla complessa superficie locale. Inoltre, attraverso un'immagine 3D, garantisce una quantificazione precisa e non distruttiva della profondità e distribuzione della penetrazione del tracciatore all'interno dell'epitelio gingivali, preservando così completamente l'architettura spaziale del tessuto. Di conseguenza, questo metodo è particolarmente adatto per la valutazione spaziotemporale ad alta risoluzione della funzione della barriera epiteliale gengivale all'interno dell'ambiente orale complesso e confinato.

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Protocol

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Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico per la Ricerca sugli Animali, Centro di Scienze della Salute dell'Università di Pechino, e conformi alla Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (Pubblicazione NIH n. 85-23, revisionata nel 1996). Durante il processo, gli animali sperimentali sono stati trattati con cura per minimizzare il dolore e il disagio.

I dettagli di ogni fase di lavoro per la valutazione della permeabilità in vivo negli epitelli gengivali del topo sono descritti di seguito (Figura 1A). Qui, abbiamo fornito un esempio di rilevamento della funzione della barriera epiteliale sia in modelli murini indotti da ligatura che da Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). Tutto il personale ricevette una formazione completa sul benessere degli animali da laboratorio e sulla tecnica asettica.

1. Gestione degli animali

  1. Durante tutto lo studio, gli animali in condizioni standard specifiche prive di patogeni (SPF) con un ciclo di 12 ore luce/scure e forniscono cibo e acqua ad libitum.
  2. Preparazione e somministrazione di anestetici e traccianti
    1. Mantieni condizioni sterili durante tutto il protocollo e utilizza strumenti puliti con etanolo al 75%.
    2. Utilizzare topi maschi selvatici (WT) C57BL/6J nel gruppo adulto maturo di 8-10 settimane per l'esperimento. Dividere i topi in tre gruppi: un gruppo di controllo (non trattato) e due gruppi sperimentali (modelli di parodontite murina indotta da legatura e P. gingivalis).
      NOTA: Nel raggruppamento, dovrebbero essere selezionati topi con peso corporeo e una settimana di età simili per ridurre l'influenza di età e peso sulla permeabilità epiteliale gengivaliale. I modelli di parodontite murina indotta da legatura e indotta da P. gingivalis rappresentano modelli murini comunemente usati di parodontite. Per protocolli di modellizzazione dettagliati, si riferisce alla letteratura sui modelli di parodontitemurino 15 indotti da legatura e16 indotti da P. gingivalis.
    3. Selezionare traccianti fluorescenti con spettri non sovrapposti, come il destrano marcato FITC (40 kDa; FD40) e dextrano marcato con rodamina B (70 kDa; RD70), per garantire un rilevamento distinto del segnale utilizzando i corrispondenti filtri FITC e rodaminga.
    4. Diluire i traccianti. Per seguire questo protocollo, miscela FD40 (1 g/L) e RD70 (1 g/L) in un gel di carbossilcellulosa al 2% e conserva a 4 °C.
    5. Iniettare intraperitonealmente 1,25% di tribromoetanolo (200 mg/kg di peso corporeo, 15-17 μL/g di peso corporeo) per anestetizzare i topi.
      NOTA: Le soluzioni di tribromoetanolo sono fotosensibili. L'alcol tert-amilico è un solvente organico infiammabile, volatile e irritante. Tutte le procedure che coinvolgono preparazione, maneggevolezza e somministrazione devono essere eseguite in una cappa chimica o in un'area estremamente ben ventilata, strettamente lontana da qualsiasi fonte di accensione. Il personale deve indossare l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata, inclusi guanti, occhiali antispruzzo chimici e camice da laboratorio. Smaltimento dei rifiuti: Soluzione di tribromoetanolo di scarto, alcol tert-amilico e tutte le forniture contaminate (ad esempio, siringhe, punte di pipetta, guanti) devono essere raccolti e smaltiti come rifiuti chimici pericolosi in rigorosa conformità con le normative e i protocolli della tua istituzione per la salute e la sicurezza ambientale (EHS) per sostanze chimiche infiammabili e tossiche.
  3. Durante l'anestesia, mantenere la temperatura corporea centrale a 37 ± 0,5 °C utilizzando un cuscinetto riscaldante controllato a feedback. Applica la pomata per gli occhi con eritromicina per prevenire la secchezza corneale.
    NOTA: Fornire cure adeguate a tutti gli animali durante tutto lo studio.
  4. Dopo le procedure chirurgiche, assicurati che gli animali siano sistemati da soli su una morbida lettiera in una gabbia di recupero calda e silenziosa fino a quando non sono completamente deambulativi. Monitorare gli animali due volte al giorno per 48 ore e reintrodurli nella gabbia di casa solo dopo un recupero completo, come valutato dalla postura, attività e comportamento alimentare normali.
  5. Tenere aperta la cavità orale con un bavaglio bucale e applicare una miscela da 5 μL a 50 μL di due o più tracce di permeabilità paracellulare con diversi pesi molecolari topicamente alla superficie gengivale labiale della regione molare (Figura 1B). Lascia andare per 30 minuti. Se l'animale ingoia la miscela, riapplicala.
  6. Isolamento del mascellare
    1. Dopo 30 minuti di applicazione dei traccianti di permeabilità, fissa i topi su cartone, mettili in posizione supina e fissa gli arti con nastro adesivo.
    2. Dopo la fissazione, si apri la cavità orale per isolare la mascella. Rimuovi delicatamente i tessuti circostanti e risciacqua accuratamente il campione con PBS.
    3. Posizionare la mascella su un vetrino di vetro, con argilla da modellare posizionata su entrambi i lati per facilitare il montaggio sicuro di un copertore coperto sopra il campione.

2. Configurazione del microscopio a fotone singolo

  1. Posizionare con cura la mascella del topo dissezionato sul portacampioni progettato su misura, assicurando una posizione stabile per l'immagini.
  2. Acquisire immagini utilizzando un microscopio verticale a fotone singolo dotato di un obiettivo di immersione in acqua 25×/NA 1.0, focalizzandosi sulla regione di supporto montata sotto la mascella.
    NOTA: I segnali di fluorescenza dovrebbero essere visibili immediatamente dopo la rimozione del gel tracciante.

3. Imaging mascellare

  1. Inizia l'imaging immediatamente dopo aver selezionato la regione di interesse sulla superficie buccale del secondo molare del mascellare.
  2. Acquisire immagini Z-stack con una dimensione di passo di 1 μm, partendo dalla superficie gengivale mascellare fino a una profondità di 100-200 μm, per una ricostruzione tridimensionale (3D).
  3. Eseguire immagini in serie Z per valutare la permeabilità della barriera epiteliale nel mascellare. Configura i parametri del software nel software di riferimento come segue:
    1. Nel menu File , crea una nuova cartella e assegnale un nome descrittivo per il dataset.
    2. Nella scheda Acquisizione, imposta il formato XY su 512 × 512 con una risoluzione di 0,99 μm/pixel.
    3. Imposta il fattore Zoom a 1.
    4. Imposta le lunghezze d'onda di eccitazione a 488 nm (FD40) e 561 nm (RD70), con finestre di emissione rispettivamente di 500-550 nm e 570-620 nm.
      NOTA: I valori di guadagno sono stati impostati rispettivamente a 50 (488 nm) e 60 (561 nm).
    5. Per la serie Z e l'imaging 3D, seleziona la modalità ND Acquisition. Imposta Z-step a 1 μm (regola secondo necessità).
  4. Una volta configurati i parametri, seleziona la modalità Live per visualizzare l'area gengivale sia nei singoli canali di fluorescenza che in quelli fusi all'interno della finestra di immagini.
  5. Clicca su Esegui ora per iniziare l'acquisizione dopo la configurazione dei parametri.

4. Misurazione della permeabilità

  1. Dividere l'intensità di fluorescenza di FD40 e RD70 in canali diversi. Non è richiesta alcuna sottrazione di background; unire le fette dell'asse Z. Successivamente, si utilizza il software ImageJ per calcolare l'intensità di fluorescenza e valutare la permeabilità e indicare la funzione della barriera epiteliale.
    1. Clicca su File e seleziona Apri per aprire l'immagine mascellare scattata al microscopio a fotone singolo.
    2. Vai al menu Immagine e cambia il tipo di immagine in formato a 8 bit per l'analisi.
      NOTA: Le immagini catturate da microscopi a fluorescenza e sistemi confocali sono generalmente in formato RGB e non possono essere utilizzate direttamente per la misurazione dell'intensità di fluorescenza. Devono essere divisi in canali individuali oppure le immagini monocromatiche dovrebbero essere importate direttamente.
    3. Apri il menu Analizza, scegli Imposta Misure e seleziona Area, Media e IntDen. Conferma cliccando OK.
    4. Seleziona il canale da analizzare e regola la soglia: Vai a Immagine | Modifica | Soglia. Il sistema applicherà automaticamente un valore e un algoritmo predefiniti, tipicamente usando il rosso per indicare le regioni selezionate.
      NOTA: Poiché le immagini fluorescenti di solito presentano sfondi neri, seleziona anche l'opzione Sfondo Scuro .
    5. Imposta parametri di misurazione: vai su Analizza e seleziona Imposta Misurazioni. Nella finestra di dialogo, seleziona Valore grigio medio e Limite alla soglia. Infine, clicca OK.
      NOTA: Si consiglia di controllare l'etichetta di visualizzazione affinché il nome dell'immagine appaia nella tabella dei risultati, facilitando così l'identificazione del gruppo sperimentale.
    6. Esegui la misurazione: seleziona lo strumento Selezione a mano libera . Usa il cursore per tracciare manualmente e con precisione il contorno della regione del segnale fluorescente sul lato del tessuto gengivali. Clicca su Analizza | Misura. Apparirà la tabella dei risultati, dove IntDen rappresenta l'intensità di fluorescenza.
  2. Copia i risultati in un foglio di calcolo per i calcoli e importali per la realizzazione grafica.
  3. Calcolo dell'intensità relativa di fluorescenza: innanzitutto, calcola l'intensità media di fluorescenza del gruppo di controllo. Successivamente, si divide il valore di intensità di fluorescenza di ciascun gruppo sperimentale per la media del gruppo di controllo per ottenere l'intensità relativa di fluorescenza.

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Results

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Secondo il protocollo standardizzato, il mascello del topo contenente i tessuti gengivali era montato su un supporto progettato su misura (Figura 1C). L'esame microscopico ha rivelato segnali di fluorescenza verdi (FD40) e rossi (FD70) nella gengiva, che hanno mostrato la permeazione dei tracce attraverso la barriera epiteliale. Dopo aver identificato la regione di interesse sotto la lente oculare, le immagini venivano acquisite utilizzando il software. Nel ...

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Discussion

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L'epitelio gengivale funge da barriera fisica essenziale contro l'invasione batterica, mentre i microrganismi orali mostrano una doppia capacità regolatoria, interrompendo l'integrità della barriera con fattori di virulenza o promuovendone il mantenimento. Queste interazioni biologiche determinano in ultima analisi l'omeostasi tissutale o la progressione dellamalattia 17,18. Sulla base di queste fondamenta, abbiamo sviluppato un ...

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgements

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Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 32030010, 31972908, 81991500, 81991502).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40 kDa FITC-labeled dextranSigma Aldrich78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextranSigma AldrichR9379
Blunt tissue separation nickelBejinghuabo CompanyNZW28
CarboximethylcellulosaMREDAM049898
Siringa sterile monousoZhiyu Company1 mL
Software ImageJNational Institutes of Health
MicrotubiAxygenMCT-150-C1,5 mL
Software NIS-Elements AR ImageNikon
Soluzione salina tamponata ai fosfati 1xServicebioG4207-500
Microscopio a fotone singolo Nikon A1 MP+Nikon
Forbici per tessutiBejinghuabo CompanyM286-05

References

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