Questo studio dimostra che il Tanshinone IIA (Tan IIA) mitiga la fibrosi post-infarto miocardico, probabilmente tramite modulazione IL-33/ST2, come mostrato nei modelli animali e nel docking molecolare, e validato da ELISA e Western blot.
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Articolo di ricerca
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Questo studio dimostra che il Tanshinone IIA (Tan IIA) mitiga la fibrosi post-infarto miocardico, probabilmente tramite modulazione IL-33/ST2, come mostrato nei modelli animali e nel docking molecolare, e validato da ELISA e Western blot.
L'infarto miocardico (IM), una forma grave di malattia coronarica, spesso provoca fibrosi miocardica, un fattore chiave che contribuisce alla disfunzione cardiaca e all'insufficienza cardiaca. Il tessuto adiposo epicardico (EAT) è sempre più implicato nella patologia cardiovascolare attraverso la modulazione della funzione cardiaca mediata da citochine. Tanshinone IIA (TanIIA), un composto lipofilo derivato dalla Salvia miltiorrhiza, presenta proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e antifibrotiche. Questo studio mirava a valutare il potenziale terapeutico di TanIIA nell'attenuare la fibrosi miocardica post-MI ed esplorarne i meccanismi sottostanti utilizzando un approccio integrativo che combina esperimenti in vivo e analisi in silico . È stato stabilito un modello MI murino e l'aggancio molecolare è stato impiegato per valutare il legame di TanIIA ai componenti chiave della via di segnalazione del gene 2 espresso interleuchina-33/stimolazione della crescita 2 (IL-33/ST2). I nostri risultati hanno mostrato che il trattamento con TanIIA ha migliorato significativamente la funzione cardiaca, ridotto la lesione istologica e mitigato la fibrosi miocardica, insieme alla riduzione dei livelli sierici di peptide natriuretico pro-cerebrale N-terminale (NT-proBNP) e troponina cardiaca ad alta sensibilità (hs-cTnI). TanIIA ha inoltre attenuato le risposte infiammatorie e lo stress ossidativo nel siero, nel miocardio e nell'EAT. Meccanicamente, TanIIA ha ridotto l'espressione di IL-33 e ST2, ha soppresso la via del fattore di differenziazione mieloide 88 (MyD88)/fattore nucleare kappa-B (NF-κB) e ridotto i livelli del fattore di crescita trasformante-β1 (TGF-β1). Le analisi in silico hanno inoltre rivelato che TanIIA mostrava forti affinità di legame per IL-33, ST2, MyD88 e NF-κB p65, con l'interazione più stabile prevista per ST2. Collettivamente, questi risultati indicano che TanIIA allevia la fibrosi miocardica indotta dal MI modulando l'infiammazione e lo stress ossidativo associati all'EAT, potenzialmente tramite inibizione multi-bersaglio dell'asse IL-33/ST2. Questi risultati supportano TanIIA come candidato terapeutico promettente per la gestione della fibrosi miocardica post-infarto.
L'infarto miocardico, patologicamente definito come morte cardiomiocitaria dovuta a ischemia prolungata, rimane un evento cardiovascolare potenzialmenteletale. Nonostante i notevoli progressi nelle strategie di reperfusione e nella farmacoterapia, l'IM continua a essere una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale 2,3,4,5,6. Una conseguenza patofisiologica chiave dell'IM è la fibrosi miocardica, ovvero l'eccessiva deposizione di proteine della matrice extracellulare, che è un fattore determinante importante per gli esiti clinici avversisuccessivi 7. Questa cicatrizzazione fibrotica, pur essendo essenziale per prevenire la rottura della parete ventricolare, spesso diventa un processo di riparazione disadattivo avviato da complesse vie infiammatorie e intercellulari 5,7,8,9,10. Sostituendo il miocardio funzionale con tessuto cicatriziale non contrattile, la fibrosi disattiva porta a un aumento della rigidità ventricolare, disfunzione cardiaca progressiva e, infine, insufficienzacardiaca 9,11. Pertanto, indagare nuovi trattamenti farmacologici che mirino specificamente e attenuino la fibrosi post-infarto è un obiettivo terapeutico fondamentale per migliorare la morbilità e la mortalità a lungo termine dei pazienti.
La Salvia miltiorrhiza (Danshen), una medicina tradizionale cinese, e le sue varie preparazioni sono ampiamente impiegate per la gestione delle malattie cardiovascolari. Il Tanshinone IIA, suo principale costituente lipofilo, è attribuito a molteplici proprietà cardioprotettive, tra cui effetti antiaterosclerotici, ischemici anti-miocardicie antiossidanti 12,13,14,15. Meccanicamente, TanIIA esercita i suoi effetti antinfiammatori e antifibrotici modulando i diversi percorsi disegnalazione 13,14,15,16,17. In particolare, è stato dimostrato che TanIIA colpisce direttamente gli adipociti, sopprimendo le loro risposte infiammatorie e migliorando così la disfunzionecellulare 18. Tuttavia, resta da chiarire se questi effetti protettivi di TanIIA si estendano al tessuto adiposo epicardico.
Il tessuto adiposo epicardico, un deposito viscerale adiposo unico, è fortemente implicato nella patogenesi della malattia coronarica (CAD), della fibrillazione atriale (FA) e dell'insufficienza cardiaca. Situata anatomicamente tra il miocardio e lo strato viscerale dell'epicardio senza uno strato fasciale intermedio, l'EAT facilita la comunicazione paracrina diretta con le strutture cardiacheadiacenti 19,20,21,22. Nel suo stato fisiologico, l'EAT è cardioprotettivo, fornendo supporto metabolico e rilasciando adipochine antinfiammatorie e antiossidanti 20,21,23,24,25,26. Al contrario, durante condizioni patologiche, l'EAT diventa una fonte di mediatori pro-infiammatori, pro-ossidatori e pro-fibrotici che guidano un rimodellamento cardiacoavverso 27,28,29,30. Di conseguenza, è stata formulata l'ipotesi che TanIIA possa inibire la fibrosi miocardica attenuando le risposte infiammatorie e lo stress ossidativo nel grasso epicardico, potenzialmente tramite una nuova via di segnalazione.
L'interleucina-33, membro della famiglia di citochineIL-1 31, è riconosciuta per le sue potenti proprietà anti-ipertrofiche e anti-fibrotiche nel sistemacardiovascolare 25. I suoi effetti biologici sono mediati da un complesso recettore distinto, ST2, che esiste in due isoforme: un recettore transmembrana (ST2L) che avvia la segnalazione e un recettore esca solubile (sST2) che sequestra IL-33-32. Clinicamente, i livelli sierici di sST2 sono fortemente elevati dopo l'infarto miocardico (MI) e rappresentano un marcatore prognostico robusto per esiti avversi in insufficienza cardiaca emiocardite 33,34,35,36. La cascata canonica di segnalazione IL-33/ST2L prevede il reclutamento della proteina adattatrice MyD88 e la successiva attivazione di TRAF6, portando alla fosforilazione e degradazione dell'inibitore NF-κB (IκB) e alla conseguente traslocazione nucleare di NF-κB37,38. Questa via è strettamente collegata ad altre citochine infiammatorie chiave; ad esempio, la segnalazione di IL-33/MyD88 può favorire la secrezione della citochina antinfiammatoria IL-1039, mentre la citochina pro-infiammatoria TNF-α può, a sua volta, amplificare la risposta infiammatoria attivando NF-κB per indurre l'espressione diIL-33 40,41. È importante sottolineare che sia IL-33 che ST2 sono espresse nel tessuto adiposo, dove si ritiene esercitino effetti antinfiammatori locali 31,42,43. Tuttavia, resta inesplorato se gli effetti cardioprotettivi di TanIIA coinvolgano la modulazione dell'asse IL-33/ST2.
Pertanto, il presente studio è stato progettato per testare l'ipotesi centrale secondo cui TanIIA previene la fibrosi miocardica mitigando l'infiammazione e lo stress ossidativo derivanti dal tessuto adiposo epicardico tramite la modulazione della via IL-33/ST2. In particolare, abbiamo ipotizzato che questa azione terapeutica sia guidata dall'ingaggio diretto e multi-bersaglio di TanIIA con proteine chiave in questa cascata di segnalazione. Per confermare ciò, abbiamo adottato un approccio duale. Per prima cosa, è stato utilizzato un modello ratto di infarto miocardico per confermare l'efficacia in vivo di TanIIA nell'attenuare il rimodellamento cardiaco avverso. In secondo luogo, per fornire una base molecolare diretta a queste osservazioni, è stato impiegato un docking computazionale per caratterizzare il potenziale legame di TanIIA a quattro nodi chiave del percorso—IL-33, ST2, MyD88 e NF-κB p65. Indagando il meccanismo dal livello tissutale fino a specifici eventi di legame molecolare, questo studio mira a stabilire un nuovo quadro meccanicistico per gli effetti cardioprotettivi della TanIIA.
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Tutte le procedure sperimentali e le pratiche di benessere animale sono state condotte in stretta conformità con il Regolamento Etico sulla Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio del Comitato Etico per gli Animali dell'Università di Medicina Cinese del Jiangxi (n. JZLLSC2023-0702), Cina.
Simulazioni di aggancio molecolare
È stato impiegato un approccio di aggancio molecolare in silico per esplorare le interazioni dirette tra TanIIA e IL-33, ST2L, MyD88 e NF-κB p65. Le coordinate 3D di TanIIA sono state ottenute dal database PubChem e il file SDF iniziale è stato successivamente convertito in formato PDB. La struttura cristallina di IL-33 (PDB ID: 4KC3), ST2L (PDB ID: 4KC3), MyD88 (PDB ID: 7L6W) e NF-κB p65 (PDB ID: 1NFI) è stata ricavata dal database delle proteine. L'elaborazione iniziale del recettore è stata effettuata in PyMOL (v2.3.4), dove molecole d'acqua e liganti originali sono state rimosse, seguita da ulteriori preparazioni in AutoDockTools per l'aggiunta di idrogeno e l'assegnazione della carica. Entrambe le molecole sono state infine convertite nel formato PDBQT. AutoDock Vina (v1.1.2) è stato utilizzato per eseguire la simulazione di attracco all'interno di una griglia definita centrata sul sito attivo. La posizione ottimale del legame è stata selezionata in base all'energia di legame più bassa e sono state identificate interazioni dettagliate utilizzando lo strumento web PLIP. La conformazione finale di attracco è stata visualizzata utilizzando PyMOL (v2.3.4).
Animali
Maschi di ratti Sprague-Dawley (SD), classe SPF, di età 6 settimane e con un peso di 200 ± 20g (certificato n. SCXK(Su)2023-0009). I ratti venivano mantenuti in condizioni standardizzate, inclusi un ciclo di 12 ore di luce e scuro e una temperatura di 22 °C ± 2 °C. Durante l'esperimento agli animali fu concesso un accesso illimitato sia al cibo che all'acqua.
Protocollo sperimentale
Un modello ratto di infarto miocardico è stato stabilito legando l'arteria coronarica sinistra anteriore discendente (LAD). I ratti operati da simulazione hanno subito le stesse procedure chirurgiche senza legatura LAD. Per un breve periodo, i ratti sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio all'1% (50 mg/kg), seguita da intubazione endotracheale e ventilazione. È stata eseguita una toracotomia sinistra per esporre il cuore. Il LAD è stato quindi legato con una sutura 4-0 non assorbibile. L'induzione miofardica riuscita è stata confermata dall'elevazione del segmento ST in un elettrocardiogramma continuo e dall'evidente sbiancamento della parete anteriore del ventricolo sinistro. Dopo l'intervento, i ratti ricevevano cefoxitin sodio (200 mg/kg/d, i.p.) per tre giorni. Ventiquattro ore dopo l'intervento, i ratti sopravvissuti sono stati assegnati casualmente a sei gruppi (n = 10 per gruppo):
Gruppo fittizio: ricevette iniezioni intraperitoneali di soluzione salina (1 mL·kg-1·giorno-1).
Gruppo MI: ha ricevuto iniezioni intraperitoneali di soluzione fisiologica (1 mL·kg-1·giorno-1).
Gruppo TanIIA-L (basso dosaggio): ha ricevuto iniezioni intraperitoneali di TanIIA (7,5 mg·kg-1·giorno-1).
Gruppo TanIIA-M (dose media): ha ricevuto iniezioni intraperitoneali di TanIIA (15 mg·kg-1·giorno-1).
Gruppo TanIIA-H (dosaggio elevato): ha ricevuto iniezioni intraperitoneali di TanIIA (30 mg·kg-1·giorno-1).
Gruppo XST (controllo positivo): ricevuto gavage orale di valsartan (30 mg·kg-1·giorno-1).
Tutti i trattamenti sono stati somministrati quotidianamente per 28 giorni consecutivi. Le dosi di TanIIA e XST sono state selezionate sulla base di studi precedenti e dei nostri dati preliminari nonpubblicati 44,45.
Elettrocardiogramma (ECG) ed ecocardiografia
Dopo 28 giorni di trattamento, la funzione cardiaca è stata valutata tramite ecocardiografia transtoracica. Sotto anestesia isoflurana al 2% (modalità movimento), sono state acquisite immagini in modalità M per determinare i diametri della diastolice/sistolica del ventricolo sinistro (LVIDd/s). La frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) e l'accorciamento frazionario (LVFS) sono stati successivamente calcolati da una media di tre cicli cardiaci consecutivi. Inoltre, sono stati registrati elettrocardiogrammi prima dell'intervento, 15 minuti dopo la legatura e al punto finale sperimentale per monitorare l'attività elettrica cardiaca.
Campionamento e colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
Il sangue dell'aorta addominale è stato centrifugato a 1370 × g per 15 minuti per isolare il siero, che è stato conservato a -80 °C. Il cuore e il tessuto adiposo epicardico sono stati rapidamente estirpati e pesati. Per le analisi molecolari, i tessuti della zona di confine dell'EAT e dell'infarto sono stati congelati a colpo in azoto liquido e conservati a -80 °C. Altri campioni di tessuto sono stati fissati con paraformaldeide al 4% per l'esame istologico. Inoltre, cuori selezionati sono stati congelati a -20 °C, sezionati e colorati con la concezione per valutare la dimensione dell'infarto. Materiali e tessuti animali vengono utilizzati e maneggiati in conformità con le normative di sicurezza di laboratorio.
Esame istologico
Per la valutazione istopatologica, le sezioni con paraffina sono state sottoposte a colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) per osservare la morfologia miocardica. La colorazione tricroma di Masson è stata utilizzata per valutare l'entità della fibrosi miocardica e la dimensione degli adipociti epicardici, con la frazione volumetrica del collagene (CVF) quantificata. Inoltre, il rapporto tra collagene di tipo I e tipo III nell'area non infarttata è stato determinato tramite colorazione di rosso picrosirio (PSR). Tutte le sezioni sono state digitalizzate per l'analisi quantitativa.
Immunoistochimica
Le sezioni miocardiche incastonate con paraffina sono state deparaffinizzate e reidratate. Il prelievo dell'antigene è stato eseguito utilizzando un tampone di citrato (pH 6,0). Le sezioni sono state bloccate con BSA al 3%, poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro collagene I, collagene III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65 e TGF-β1. Successivamente, le sezioni sono state incubate con un anticorpo secondario marcato con HRP per 1 ora a temperatura ambiente. La colorazione è stata visualizzata con DAB e i nuclei sono stati controcolorati con ematossilina. Le immagini venivano catturate con uno scanner digitale e analizzate con software di analisi delle immagini per quantificare la densità ottica integrata (IOD) della colorazione positiva.
Saggio immunoenzimatico legato agli enzimi
Le concentrazioni di hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33 e ST2 sono state quantificate nei campioni di sierico. Inoltre, i livelli di IL-10 e TNF-α sono stati misurati nel siero, negli omogeneati miocardici e nei lisati del tessuto adiposo epicardico. Tutti i test sono stati eseguiti utilizzando kit ELISA (immunosorbenti legati a enzimi) disponibili in commercio secondo i protocolli del produttore.
Western blotting
La proteina totale è stata estratta da omogeneati tissutali e le concentrazioni sono state determinate tramite analisi dell'acido bicinchoninico (BCA). Quantità uguali di proteine sono state separate tramite elettroforesi in gel dodecil di sodio–poliacrilamide (SDS-PAGE) e trasferite nelle membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF). Dopo il blocco con latte scremato al 5%, le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro IL-10, fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1 e GAPDH (1:1000). Successivamente, le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario coniugato con HRP (1:5000) e visualizzate utilizzando un reagente ECL. Le intensità delle bande sono state quantificate tramite software e i livelli proteici sono stati normalizzati in GAPDH come controllo interno.
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando software di statistica medica. I dati sono presentati come la media ± l'errore standard della media. Per confronti tra due gruppi indipendenti, è stato utilizzato un test t. Nel caso di gruppi multipli, è stato applicato un ANOVA unidirezionale o bidirezionale seguito da un test post hoc di Tukey. Per tutte le analisi, un P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Effetti di TanIIA sulla funzione cardiaca nei ratti con infarto miocardico (Figura 1)
Condizioni di salute e cambiamenti nel peso corporeo: i ratti del gruppo MI hanno mostrato condizioni generali scarse, con distensione addominale, mentre i ratti dei gruppi TanIIA hanno mostrato un miglioramento dello stato di salute, un aumento dell'assunzione di cibo e acqua e una maggiore attività. Dopo 4 settimane, è...
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Il presente studio indaga gli effetti di TanIIA sulla fibrosi miocardica dopo un infarto miocardico, insieme ai meccanismi sottostanti coinvolti. I risultati principali sono i seguenti: (1) TanIIA attenua la rimodellazione cardiaca avversa e migliora la funzione cardiaca inibendo la fibrosi cardiaca. (2) Il TanIIA è stato riscontrato di inibire la fibrosi miocardica attenuando le risposte infiammatorie e lo stress ossidativo nel grasso epicardico. (3) TanIIA media gli effetti antifibroti...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o relazioni personali note che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.
La ricerca è stata supportata dalla Top Discipline della Provincia di Jiangxi, Disciplina di Medicina Integrativa Cinese e Occidentale, Università di Medicina Cinese del Jiangxi (zxyylxk20220103). Ulteriori finanziamenti sono stati ottenuti da molteplici iniziative supportate da Xiaomin Wang, tra cui il Science and Technology Research Project del Dipartimento dell'Istruzione della Provincia del Jiangxi (GJJ2200940), il Progetto del Team di Insegnamento Universitario di Alto Livello del Jiangxi (2020008), il Progetto di Riforma dell'Insegnamento Postgraduate del Jiangxi (JXYJG2019117), i Corsi di Qualità per Studenti Laureati nella Provincia del Jiangxi (2020041) e il Progetto di Innovazione per Studenti Universitari dell'Università di Medicina Cinese del Jiangxi (2023091). Il finanziatore ha partecipato alla progettazione dello studio, alla decisione di pubblicazione e alla preparazione dei manoscritti.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di quantificazione delle proteine BCA | Thermo Fisher Corporation | PICPI23223 | |
| Kit GATTO | Biotecnologia del collegamento enzimatico di Shanghai | 202211202 | |
| Anticorpo del collagene I | Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd | GB114197 | |
| Anticorpo del collagene III | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL03186 | |
| Anticorpo GAPDH | Corporazione per la Tecnologia di Segnalazione Cellulare | #5174 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Corporation | Versione 9.0 | |
| Kit GSH | Biotecnologia del collegamento enzimatico di Shanghai | 202211131 | |
| H& Soluzione di colorazione E | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | H8070; G1100 | |
| Anticorpo anti-coniglio anti-coniglio marcato HRP | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | SE134 | |
| Hs-cTnI Kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 20220808 | |
| Anticorpo IL-10 | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL03088 | |
| IL-10 Kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211172 | |
| IL-33 Kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211192 | |
| Anticorpo IL-33 | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL04438 | |
| Software ImageJ | Istituti Nazionali di Salute | versione Fiji | |
| Image-Pro | Media Cybernetics, USA | Versione 6.0 | |
| Maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) | Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd | SCXK(Su)2023-0009 | |
| Kit per la tintura in massone | Wuhan Bolf Biotechnology Co., Ltd | 20221218 | |
| Kit MDA | Biotecnologia del collegamento enzimatico di Shanghai | 202211171 | |
| Anticorpo MyD88 | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL02494 | |
| NT-proBNP Kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 20220805 | |
| Fattore nucleare kappa-B(NF-& kappa; B)(p65) anticorpi | Abmart Corporation | TP56372 | |
| Open Babel | Progetto di toolkit di cheminformatica open-source | Versione 2.3.2 | |
| Membrane al fluoruro di polivinilidene (PVDF) | Merck Millipore | R9M2784 | |
| Soluzione PSR | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | G1472 | |
| Kit SOD | Biotecnologia del collegamento enzimatico di Shanghai | 202211201 | |
| Anticorpo ST2 | Proteintech Group Corporation | 11920-1-AP | |
| Kit ST2 | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211183 | |
| Soluzioni statistiche di prodotto e servizio (SPSS) | IBM Corporation | Versione 26.0 | |
| Iniezione di Sulfotanshinone Sodio | Shanghai Pharmaceutical First Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd | 2012303 | |
| Reagente di luminescenza ECL super sensibile | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MA0186 | |
| TGF-& beta; 1 Anticorpo | ABclonal Corporation | A2124 | |
| Capsula Titanvin Valsartan | Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co., Ltd | 211120 | |
| TNF-α Kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211202 | |
| TNF-α Anticorpo | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL01581 | |
| Soluzione TTC | Fuzhou Phygene Biotechnology Co., Ltd | 20210620 | |
| Sistema di imaging ultrasonico per piccoli animali ad alta risoluzione | VEVOcompany | Vevo 2100 |