Protocollo per lo studio della regolazione da Honokiol della segnalazione trasformante del fattore di crescita beta 1/SMAD in modelli di fotoinvecchiamento cutaneo indotti dall'ultravioletto A

Sommario

Questo protocollo indaga se l'honokiol migliori il foto-invecchiamento indotto dai raggi UVA nei fibroblasti dermici umani e nella pelle del topo attivando la via TGF-β1/Smad e riducendo l'espressione di MMP.

Abstract

L'Honokiol (HNK), un componente chiave derivato dalla Magnolia officinalis, ha il potenziale per trattare le malattie della pelle. Attualmente, l'impatto e il meccanismo d'azione dell'HNK sul fotodanno indotto dall'Ultravioletto A (UVA) nella pelle non sono chiari. Un modello di danno foto-invecchiato delle cellule HDF e della pelle di topo senza peli è stato costruito tramite induzione UVA. L'impatto dell'HNK sulla vitalità delle cellule HDF normali e delle cellule HDF indotte dalla UVA è stato esaminato attraverso il test di vitalità delle cellule. I livelli di SOD, GSH, CAT e MDA nelle celle HDF sono stati misurati utilizzando diversi kit, mentre i livelli di ROS sono stati misurati con DCFH-DA e Diidroetidio. La colorazione SA-β-galactosidasi e TUNEL ha rilevato senescenza e apoptosi nelle cellule HDF, e la citometria a flusso ha valutato la progressione del ciclo cellulare. Il danno istopatologico della pelle è stato valutato tramite colorazione patologica. Inoltre, immunofluorescenza e Western blot sono stati utilizzati per valutare i livelli di proteine associate alla via di Ki67, collagene, metalloproteinasi della matrice (MMP) e TGF-β1/Smad pathway. Il trattamento con HNK (2,5-10 μM) non ha avuto effetti negativi sulla normale vitalità delle cellule HDF, ma ha attenuato i danni cellulari HDF indotti dai raggi UVA, riducendo lo stress ossidativo e l'apopttosi. I radi UVA hanno indotto la senescenza delle cellule HDF, indotto arresto della fase S, ridimensionato Ki67, ridotto il contenuto di collagene e aumentato l'espressione di MMP, mentre HNK ha efficacemente attenuato queste anomalie indotte dagli UVA. Inoltre, i radi UVA causavano rughe più profonde, una diminuzione del contenuto di acqua e di collagene, e un aumento dello spessore epiteliale nella pelle del topo, mentre l'iniezione sottocutanea di HNK attenuava i danni patologici ai tessuti cutanei e aumentava il contenuto di acqua e collagene. Inoltre, l'HNK ha attivato la via TGF-β1/Smad, e l'inibitore TGF-β1 SB431542 compromesso l'effetto protettivo dell'HNK contro i danni da foto-invecchiamento nelle cellule HDF. In conclusione, HNK ha il potenziale di essere un farmaco per mitigare i danni da foto-invecchiamento riducendo l'espressione di MMP tramite l'attivazione della via TGF-β1/Smad, inibendo così il foto-invecchiamento indotto dagli UVA nelle cellule HDF e nella pelle del topo.

Introduzione

Il processo di invecchiamento della pelle è complesso e si divide in due forme principali: invecchiamento naturale e foto-invecchiamento¹. Gli studi indicano che fino all'80-90% dell'invecchiamento cutaneo è causato da fattori esogeni nell'ambiente (ad esempio, raggi ultravioletti, inquinamento atmosferico), tra cui l'invecchiamento fotografico indotto dalle radiazioni ultraviolette a lungo termine ha gli effetti più^{gravi 2,3}. La radiazione ultravioletta è suddivisa in UVC, UVB e UVA. Poiché l'UVC non può penetrare lo strato di ozono, le ricerche attuali sull'invecchiamento fotografico si concentrano sugli UVA (320-400 nm) e UVB (280-320 nm)^4,5,6. Rispetto agli UVB, i radi UVA hanno energia più bassa, ma sono più penetranti, attraversano l'epidermide e arrivano in profondità nel derma, che è una causa importante dell'invecchiamento grave^{della pelle.} Studi precedenti hanno dimostrato che il danno causato dall'irradiazione UVB di 57 mJ^{/cm 2} e 20 UVA J^{/cm 2} alle cellule HaCaT è^{comparabile di 8}. L'invecchiamento fotografico della pelle provoca cambiamenti nella funzione e nella struttura della pelle, manifestati specificamente come abbassamento del tessuto superficiale, approfondimento delle rughe, perdita di collagene e l'apparizione di un colore grigio della pelle visibile a occhio nudo; nei casi gravi, possono verificarsi una varietà di lesioni benigne e precancerose^e tumori ^9,10. Insieme all'aumento della ricerca sull'invecchiamento e l'anti-invecchiamento, i rischi per la salute derivanti dal fotoinvecchiamento sono diventati una delle preoccupazioni più importanti a livello mondiale. Pertanto, è fondamentale indagare i processi fisiopatologici alla base del danno da foto-invecchiamento indotti dai raggi UVA, con l'obiettivo di sviluppare nuove opzioni terapeutiche per il trattamento.

Estratto dalla Magnolia officinalis, una tradizionale erba medicinale cinese, l'Honokiol (HNK) è un composto bioattivo significativo con formula chimica di C₁₈H₁₈O₂¹¹. HNK presenta varie attività farmacologiche e il suo gruppo fenolico idrossile è altamente suscettibile all'ossidazione e presenta forti effetti antiossidanti e di recupero dei radicali^{liberi 12}. Inoltre, l'HNK ha effetti farmacologici antibatterici, antinfiammatori, antivirali, antitumorali, antidepressivi, neuroprotettivi e anti-insufficienza ovarica^precoce 13,14,15,16. L'HNK orale è stato ritenuto essenzialmente sicuro negli studi sugli animali e clinici, e non sono stati identificati effetti avversi^{significativi} 17,18,19. Studi recenti hanno rilevato che l'HNK previene il cancro della pelle indotto da^{UVB 20} e inibisce la risposta infiammatoria cutanea indotta dagli UVB e l'ipermetilazione^{del DNA 21}, suggerendo il suo potenziale utilizzo nel trattamento di condizioni cutanee. Rispetto agli agenti anti-foto-invecchiamento ampiamente utilizzati, tra cui vitamina C e resveratrolo, l'HNK possiede proprietà distinte e superiori: la sua struttura lipofila conferisce una migliore permeabilità transdermica rispetto alla vitamina^{C idrofila 22}; e mostra una fotostabilità e una biodisponibilità in vivo superiori rispetto al^{resveratrolo 23}. Questi risultati preclinici supportano l'idea che l'HNK abbia un promettente potenziale traslazionale come candidato sicuro ed efficace per prodotti per la cura della pelle e interventi clinici contro il fotodanno cutaneo indotto dagli ultravioletti. Tuttavia, l'impatto del trattamento HNK sui danni cutanei da fotoinvecchiamento causati dai raggi UVA non è ancora stato riportato.

Il fattore di crescita trasformante-β1 (TGF-β1) è una citochina multifunzionale cruciale per la crescita e lo sviluppo cellulare, la riparazione e rigenerazione dei tessuti, nonché la crescita e lo sviluppo di cellule, tessuti e organi^24,25. È stato dimostrato che TGF-β1 segnala alla cellula principalmente attraverso membri della famiglia proteica Smad, portando alla regolazione specifica della trascrizione dei geni bersaglio a valle. Quando la segnalazione TGF-β1 viene attivata, si traduce in fosforilazione di Smad2 e Smad3^26,27. Studi recenti hanno mostrato una forte connessione tra la via TGF-β1/Smad e la fibrosi cutanea e il foto-invecchiamento^28,29. È stato riportato che il bersaglio mammifero della rapamicina attiva la via TGF-β1/Smad nei tessuti cutanei dei ratti, che a sua volta favorisce la sintesi delle ceramidi, importanti per trattenere l'umidità cutanea e mantenere la barriera^{cutanea 30}. In particolare, è stato riportato che l'HNK ha modulato la via TGF-β1/Smad nelle cellule stellate epatiche, il che, a sua volta, ha migliorato la fibrosi^{epatica 31}. Pertanto, sono stati stabiliti modelli cellulari e murini di lesioni da foto-invecchiamento indotte dai raggi UVA, con trattamento HNK da 2,5–10 μM nelle cellule HDF e intervento HNK da 5 mg/kg o 10 mg/kg nei topi senza pelo, per esplorare gli effetti dell'HNK sui danni da foto-invecchiamento e il suo potenziale ruolo nella modulazione della via TGF-β1/Smad. Questo studio mirava a sviluppare nuove strategie terapeutiche per il fotodanno cutaneo indotto dai raggi UVA.

Protocollo

Tutti gli esperimenti di coltura cellulare sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali sulla biosicurezza e condotti secondo condizioni di laboratorio di Biosafety Level 2 (BSL-2). Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti dopo l'approvazione del Comitato Etico Animale del 988° Ospedale della Forza Congiunta di Supporto Logistico dell'Esercito Popolare di Liberazione Cinese (numero di approvazione: 2023-089).

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in rigorosa conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Al termine dell'esperimento, i topi sono stati soppressi tramite un'overdose di pentobarbital sodico (100 mg/kg, iniezione intraperitoneale). Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare la sofferenza animale durante le procedure di alloggio, trattamento e campionamento. I reagenti, i prodotti chimici, le attrezzature e i software utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare e lavorazione

1. Coltivare fibroblasti dermici umani (HDF) in mezzo di coltura di fibroblasti. Mantenere le colture a 37 °C in un ambiente saturo di umidità con il 5% di_CO2.
2. Sostituire il mezzo di coltura ogni 3 giorni e far passare l'HDF con un rapporto di 1:3 quando è confluente.
3. Irradiare HDF con lampade UVA (spettro di emissione: 320-400 nm) a una dose di 5 J/^{cm 2}.
4. Rifornisci con substrato fresco subito dopo 30 minuti di irradiazione UVA. Ripeti l'irradiazione UVA una volta al giorno per 8 giorni^{consecutivi e 32}.
5. Trattare l'HDF con 2,5, 5, 10, 20 o 40 μM HNK per 24 ore o 48 ore negli esperimenti di dosaggio³³. Trattare l'HDF con 2,5, 5 o 10 μM HNK per 24 ore, seguita da irradiazione UVA (5 J/^{cm 2}) negli esperimenti successivi.
6. Esporre l'HDF a 10 μM di HNK per 4 ore, poi incubare con un inibitore TGF-β1 a 10 μM SB431542 per 24 ore, e infine irradiare con UVA (5 J/cm²) nel gruppo HNK+SB431542.

2. Valutazione della vitalità cellulare

1. Inoculare l'HDF in piastre di coltura cellulare a 96 pozzi a una densità di 1×10⁴ cellule/pozzo.
2. Dopo diversi trattamenti, si aggiungono 10 μL di reagente salino tetrazoliale al 10% solubile in acqua a ciascun pozzo fino a un volume finale di 100 μL per pozzo, e si incubano le cellule a 37°C per 1,5 ore al buio.
3. Misura i valori OD450 delle celle utilizzando un lettore di micropiastre.

3. Determinazione dei livelli di superossido dismutasi (SOD), malondialdeide (MDA), catalasi (CAT) e glutatione (GSH)

1. Lavare l'HDF con 1 mL di PBS pre-raffreddato (0,01 M, pH 7,4), aggiungere 200 μL di soluzione per preparare il campione SOD (dal kit di analisi SOD) per lisare le celle sul ghiaccio per 15 minuti.
2. Centrifugare il lisato a 8000 × g per 5 minuti a 4 °C e raccogliere il soprantantante come campione per il saggio.
3. Utilizzare un kit di analisi proteica BCA (Acido Bicinconinico) per determinare la concentrazione proteica del surnadante e regolare il campione a 50 μg di proteina totale in un volume di 50 μL.
4. Mescola il campione proteico da 50 μg con il tampone SOD per ottenere un volume di reazione finale di 200 μL, incuba la miscela a 37 °C per 30 minuti al buio, quindi misura il valore OD450.
5. Prendi lo stesso soprantato di lisato cellulare usato per il test SOD, misura i livelli di CAT, GSH e MDA utilizzando i rispettivi kit di analisi.

4. Misurazione dei livelli cellulari di ROS

1. Trattare le cellule HDF con condizioni diverse, risciacquare due volte con PBS da 500 μL e mescolare bene con una sonda fluorescente da 500 μL di specie reattive a ossigeno da 10 μM e incubare a 37 °C per 20 minuti lontano dalla luce.
2. Centrifugare a 1000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le celle, poi risciacquare due volte con PBS da 500 μL.
3. Risospendere le cellule in un mezzo di coltura cellulare da 500 μL, poi analizzare la colorazione tramite citometria a flusso.
4. Registra l'intensità di fluorescenza usando software di analisi di citometria a flusso, e poi calcola i livelli ROS basandosi sull'intensità di fluorescenza che un ROS più alto corrisponde a una fluorescenza verde più forte.

5. Colorazione β-galactosidasi (SA-β-galactosidasi) associata alla senescenza

1. Seminare HDF in piastre di coltura cellulare a 6 pozzi con una densità di 1×10⁶ cellule/pozzo e coltura fino all'adesione. Dopo diversi trattamenti, lava una volta l'HDF con 2 mL PBS.
2. Aggiungi 1 mL di fissativo per la colorazione di β-galactosidasi in ciascun pozzo e incuba le cellule a temperatura ambiente con il fissativo per 15 minuti.
3. Lava le cellule 3 volte con 2 mL di PBS, aggiungi 1 mL di soluzione lavorativa per la colorazione in ciascun pozzo e poi incuba a 37°C durante la notte al buio.
4. Osserva e fotografa le cellule con un microscopio lucico (le cellule senescenti appaiono blu).

6. Analisi del ciclo cellulare

1. Seminare HDF in piastre a 6 pozzi a 1×10⁶ celle/pozzo; dopo trattamenti diversi, risciacquare due volte le cellule con 2 mL di PBS.
2. Centrifugare a 1000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le cellule, aggiungere 1 mL di etanolo al 70% (fissativo per cellule) e mescolare delicatamente tramite pipetta. Posiziona le celle fissate in un frigorifero a 4°C per 12 ore.
3. Preparare 500 μL per campione di soluzione di colorazione cellulare mescolando iodio propidio (PI, concentrazione finale 50 μg/mL) e RNaseA (concentrazione finale 200 μg/mL) in PBS. Esponi le cellule a 500 μL di soluzione colorante, incuba al buio a 37°C per 30 minuti.
4. Valutare l'intensità della fluorescenza utilizzando la citometria a flusso. Eseguire l'analisi del ciclo cellulare utilizzando un citometro a flusso.

7. Colorazione TUNEL

1. Esporre cellule HDF di diversi gruppi di trattamento a 1 mL di paraformaldeide al 4% e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Aggiungi 1 mL di PBS contenente 0,3% di Triton X-100 alle cellule e incuba a temperatura ambiente per 5 minuti.
3. Lavare le cellule due volte con PBS, poi aggiungere una soluzione di 500 μL per il test TUNEL a goccia per coprire uniformmente le cellule. Incubare a 37°C al buio per 1,5 ore.
4. Aggiungi 200 μL di soluzione di colorazione DAPI per coprire le cellule e incuba lontano dalla luce per 10 minuti a 25 °C.
5. Sigilla le cellule con un mezzo di montaggio per la conservazione del segnale di fluorescenza, poi osservale e fotografale con un microscopio a fluorescenza (le cellule TUNEL-positive mostrano fluorescenza verde).

8. Colorazione immunofluorescenza

1. Seminare cellule HDF di diversi gruppi di trattamento in piastre a 12 pozzi. Quando la densità cellulare raggiunge il 50%-60%, espone le cellule a 1 mL di paraformaldeide al 4% e incuba a temperatura ambiente per 25 minuti.
2. Aggiungi 1 mL di albumina sirica bovina al 5% (BSA) a goccia per bloccare la superficie cellulare, e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
3. Aggiungere 500 μL di anticorpi primari Ki67 (1:300), collagene I (1:100), metalloproteinasi della matrice (MMP)-1 (1:50) o MMP-3 (1:100) a goccia, e incubare a 4°C durante la notte.
4. Il giorno seguente, incubare le cellule con 500 μL di anticorpo secondario marcato con fluoresceina isotiocianato (FITC) (1:100) a 37°C lontano dalla luce per 1 ora.
5. Aggiungere 200 μL di soluzione di colorazione DAPI per coprire le cellule, incubare lontano dalla luce per 10 minuti, osservare con un microscopio a fluorescenza e analizzare con software di analisi delle immagini (le cellule positive al collagene I e MMP-1 mostrano fluorescenza rossa, quelle positive a Ki67 e MMP-3 mostrano fluorescenza verde).

9. ELISA

1. Aggiungere 100 μL di soprantantante di coltura cellulare HDF ai pozzi delle piastre kit MMP-1 o MMP-3 ELISA, e incubare a 37°C per 2 ore.
2. Lavare i pozzi 3 volte con 200 μL di PBS, poi aggiungere 100 μL dell'anticorpo corrispondente a ciascun pozzo e incubare a 37 °C al buio per 1 ora.
3. Risciacquare i pozzi 3 volte con 200 μL di tampone di lavaggio (fornito nel kit), scuotere la soluzione in eccesso e incubare i campioni con 100 μL di streptavidina-HRP per 30 minuti a 37°C al buio.
4. Dopo aver sciacquato con PBS, aggiungi 100 μL di substrati A e B secondo le istruzioni del kit e incuba a 37°C al buio per 10 minuti.
5. Aggiungere 50 μL di soluzione di terminazione, mescolare bene, valutare il valore OD₄₅₀ usando un lettore di micropiastre e calcolare la concentrazione.

10. Costruzione del modello murino da danni da foto-invecchiamento

1. Femmine di maschera SKH1 di grado SPF domestico (15-20 g, 4-5 settimane) a 22 °C con umidità del 55%-60% e permettono un accesso autonomo a cibo e acqua. Disinfettare regolarmente le strutture, inclusi contenitori per il cibo, bottiglie d'acqua e beccchi per l'acqua.
2. Assegnare casualmente i topi al gruppo di controllo (n=6) e al gruppo modello (n=18). Topi del gruppo modello irradiato con UVA a 0,35 J/^{cm 2} per 8 settimane³⁴; topi del gruppo di controllo domestico nello stesso ambiente senza irradiazione UVA.
3. Dividere i topi del gruppo modello in modo equo in 3 sottogruppi (n=6 ciascuno).
4. Somministrare iniezioni sottocutanee di HNK a 5 mg/kg o 10 mg/kg in volume da 100 μL due volte a settimana a due sottogruppi durante l'irradiazione UVA (registrato rispettivamente come gruppo HNK 5 mg/kg e gruppo HNK 10 mg/kg). Somministrare iniezioni sottocutanee di soluzione fisiologica da 100 μL due volte a settimana al terzo sottogruppo durante l'irradiazione UVA (registrato come gruppo UVA).
5. Valutare la formazione delle rughe e il contenuto d'acqua della pelle dopo una modellazione^{riuscita 35}.
6. Eutanasiare i topi con pentobarbital sodico (100 mg/kg) intraperitoneale, poi raccogliere tessuti cutanei dorsali per ulteriori esperimenti.

11. Misurazione del contenuto di collagene I della pelle

1. Raccogli 50 mg di tessuto cutaneo dorsale del topo, macinali accuratamente in azoto liquido e lisciali usando 500 μL di tampone di lisi RIPA pre-raffreddato per 30 minuti sul ghiaccio.
2. Centrifugare il lisato a 8000 × g per 5 minuti a 4 °C, raccogliere il soprandante e misurare il contenuto di collagene utilizzando un kit di test peptidico pro-collagene I C secondo le istruzioni del produttore.

12. Colorazione di ematossilina ed eosina (HE)

1. Fissare i tessuti della pelle del topo in 10 mL di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 24 ore, disidratare in etanolo gradiente (50%, 75%, 95%, 100%, ciascuno per 5 minuti), incorporare nella paraffina e sezionare in fette da 4 μm.
2. Cuocere le fette a 65°C per 8 ore, deparaffinare nello xilene due volte per 10 minuti ciascuna e reidratare con etanolo gradiente a temperatura ambiente.
3. Tingi le fette con soluzione di ematossilina per 8 minuti, risciacqua con acqua del rubinetto corrente per 1 minuto, differenzia con soluzione differenziante per 30 secondi e tingi con eosina per 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Disidratare le fette colorate in etanolo gradiente, trasparente in xilene, sigillare con un mezzo di montaggio e osservare al microscopio (il nucleo cellulare appare blu-violaceo, mentre il citoplasma, le fibre di collagene e gli eritrociti appaiono rosa in misura variabile).

13. Colorazione di massone

1. Tingi le sezioni di paraffina dei tessuti cutanei del topo usando il kit di colorazione Masson^{trichrome 36}. Deparafinizza le sezioni di paraffina nello xilene due volte per 10 minuti ciascuna, aggiungi la soluzione di colorazione per ferro Weigert e colora per 10 minuti.
2. Differenzia con soluzione di differenziazione a etanolo acido per 30 secondi, risciacqua con acqua del rubinetto corrente per 5 minuti, poi tingi con la soluzione di colorazione Ponceau-fucsina goccia a goccia per 10 minuti a temperatura ambiente. Esegui il bluing inverso con la soluzione blu di Masson e poi risciacqua con acqua distillata per 1 minuto.
3. Preparare una soluzione di lavoro con acido debole in un rapporto di acqua distillata: soluzione acida debole (fornita nel kit) = 2:1; Aggiungi 1 mL di soluzione acida debole a goccia e lava per 30 secondi a temperatura ambiente.
4. Versa via il liquido in eccesso, aggiungi 1 mL di soluzione acida fosfomolilobdica a goccia e tratta per 2 minuti a temperatura ambiente. Aggiungi 1 mL della soluzione acida debole a gocce, poi lava per 30 secondi.
5. Versa via l'eccesso di liquido, aggiungi 1 mL di soluzione per colorare il blu di anilina a goccia e tingi per 1 minuto. Aggiungi 1 mL di soluzione acida debole a goccia e lava per 30 secondi.
6. Disidrata rapidamente con etanolo al 95% per 2 secondi. Disidrata in etanolo assoluto due volte, 10 secondi ogni volta.
7. Dopo l'asciugatura, pulire le sezioni con xilene e montare con gomma neutra. Osserva la distribuzione delle fibre di collagene in ciascun gruppo al microscopio (le fibre di collagene appaiono blu, mentre le fibre muscolari, il citoplasma e gli eritrociti sono di un rosso brillante, e i nuclei cellulari appaiono nettamente blu-neri).

14. Misurazione dei livelli di ROS del tessuto cutaneo

1. Prendi sezioni congelate di tessuto cutaneo del topo (preparate entro 1 ora dall'escissione), distribuisci 1 mL di soluzione detergente a goccia su tutta la superficie della sezione e lascia riposare a temperatura ambiente per 10 minuti.
2. Scuotere via la soluzione di lavaggio, poi aggiungere 1 mL di sonda a goccia per le specie reattive di ossigeno da 10 μM per coprire uniformemente le sezioni; Incubare a 37 °C lontano dalla luce per 30 minuti.
3. Risciacquare le sezioni due volte con PBS, aggiungere le scomparse di copertura e osservare con un microscopio a fluorescenza (le aree ROS-positive mostrano fluorescenza rossa; più basso è il livello ROS, più debole è il segnale di fluorescenza rosso).

15. Test degli indicatori biochimici

1. Raccogli il siero per topi e prepara i reagenti per la rilevazione secondo le istruzioni dei relativi kit di analisi.
2. Misurare le attività dell'aspartato transaminasi (AST) e dell'alanina transaminasi (ALT) nel siero topo utilizzando i rispettivi kit.
3. Determinare i livelli di azoto nell'urea nel sangue (BUN) e creatinina (CRE) nel siero topo utilizzando i rispettivi kit.

16. Western blot

1. Raccogliere 50 mg di tessuto o 1×10⁶ cellule, lisare i campioni sul ghiaccio per 30 minuti utilizzando un tampone di lisi RIPA da 200 μL per ottenere proteine.
2. Centrifugare a 8000 × g per 5 minuti a 4 °C e raccogliere il soprandante. Valuta il contenuto proteico nelle cellule e nei tessuti utilizzando il kit per il test di concentrazione proteica BCA.
3. Eseguire elettroforesi di proteine campioni su gel SDS-PAGE al 12% e trasferire proteine separate alle membrane PVDF a 4 °C.
4. Blocca le membrane PVDF con il 5% di BSA per 3 ore a temperatura ambiente. Risciacquare le membrane con TBST (contiene 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl e 0,1% Tween-20) 3 volte, poi incubare durante la notte a 4°C con anticorpi primari: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), collagene I (1:1000), ciclina A2 (1:500), chinasi dipendente da ciclina 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:1000), P-Smad2 (1:1000) o p-Smad3 (1:1000).
5. Il secondo giorno, lavare le membrane con TBST 3 volte, poi incubare con 1 mL di IgG anticoniglio di capra (1:10000) a temperatura ambiente per 2 ore. Applicare 500 μL del reagente chemiluminescenza avanzata (ECL) in modo uniforme sulle membrane, poi scansionarle utilizzando un sistema di imaging in gel.
6. Esegui analisi del valore grigio utilizzando software di analisi delle immagini. Esprimi il livello di espressione relativo come il rapporto tra il suo valore grigio e quello del GAPDH.

17. Analisi statistica

1. Per i saggi cellulari in vitro , tutti gli esperimenti vengono ripetuti indipendentemente tre volte (n=3, repliche biologiche).
2. Per esperimenti in vivo su animali, sono inclusi 6 topi per gruppo (n=6), il che rispetta i principi 3R per il benessere ed etica degli animali da laboratorio.
3. Tutti i risultati sono espressi come media ± deviazione standard. Eseguire analisi statistiche utilizzando software di analisi statistica. La normalità dei dati è stata testata utilizzando il test di Shapiro-Wilk.
4. Per dati normalmente distribuiti, si utilizza l'ANOVA unidirezionale per il confronto multigruppo, seguito dal test post-hoc di Tukey per i confronti a coppie tra gruppi. Per dati non normalmente distribuiti, applica il test di Kruskal-Wallis non parametrico. P< 0,05 indica una differenza significativa.
5. Genera grafici usando software di graficazione.

Risultati

L'HNK allevia i danni da stress ossidativo nelle cellule HDF causati dai raggi UVA
Gli impatti delle varie concentrazioni di trattamento con HNK per 24 o 48 ore sulla vitalità delle cellule HDF sono stati esaminati tramite un saggio di vitalità cellulare per selezionare la concentrazione e la durata del trattamento adeguate. I risultati hanno mostrato che 2,5, 5 e 10 μM di HNK non hanno influito in modo significativo sulla vitalità delle cellule HDF normali dopo 24 o ...

Discussione

La luce ultravioletta è un fattore ambientale che danneggia cellule e organismi. Studi precedenti hanno riportato che i radi UVA, con la sua elevata potenza di penetrazione, sono il principale tipo di luce ultravioletta che raggiunge la superficie terrestre³⁸. I fibroblasti sono cellule funzionali importanti nel derma, e il loro invecchiamento può causare direttamente o indirettamente l'invecchiamento della pelle³⁹. Il danno da foto-invecch...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per il test di attività ALT	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	P2711M	Kit di rilevamento dell'attività della alanina transaminasi
Kit di analisi Amplex Red CRE	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	S0291S	Kit di rilevamento della creatinina
Mezzo di montaggio AntiFade	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	P0126	Mezzo di montaggio per la conservazione del segnale di fluorescenza
Kit per il test di attività AST	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	P2715S	Kit di rilevamento dell'attività della transaminasi aspartate
Kit per il test proteico BCA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	P0012	Kit per la determinazione della concentrazione proteica
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V900933	reagente bloccante per il legame non specifico
Kit BUN Assay	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	S0574S	Kit di rilevamento dell'azoto nell'urea nel sangue
Kit per il test CAT	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	S0051	Kit di rilevamento dell'attività della catalasi
Reagente CCK-8	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	96992	Soluzione di saggio di viabilità cellulare, che è un sale tetrazoliale solubile in acqua
Anticorpo CDK2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-79024	anticorpo primario per la rilevazione di CDK2
Agente chemiluminescente ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-K1005	Reagente di rilevamento della chemiluminescenza potenziata
Anticorpo del collagene I	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-26204	anticorpo primario per la rilevazione del collagene I
Anticorpo della ciclina A2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-34682	Anticorpo primario per la rilevazione della ciclina A2
Soluzione di colorazione DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9542	Colorante per colorazione nucleare
Sonda fluorescente DCFH-DA	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-D0940	Sonda fluorescente reattiva per specie di ossigeno
Soluzione di differenziazione	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	C0161s	Reagente per la fase di differenziazione dell'ematossilina
Sonda diidroetidio	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	S0063	Sonda reattiva delle specie ossigeno
Mezzo di coltura fibroblastica	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Cina	SNPM-H342	Mezzo di coltura completo per la crescita dei fibroblasti
Capra etichettata FITC anti-coniglio IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F-2765	Anticorpo secondario marcato con fluoresceina isotiocianato (FITC)
Citometria a flusso	BD in bioscienze, San Jose, CA, USA	BD FACSCaliburTM	Citometro a flusso
Software FlowJo	BD in bioscienze, San Jose, CA, USA	v10.8	Software per l'analisi della citometria a flusso
Microscopio a fluorescenza	Leica, Heidelberg, Germania	DM IL GUIDÒ	microscopio per l'imaging a fluorescenza
Anticorpo GAPDH	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-987	Anticorpo di controllo interno per la normalizzazione proteica
Sistema di imaging gel	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	iBright CL1500	Sistema di imaging per il rilevamento delle proteine
capra anti-coniglio IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	31460	Anticorpo secondario per l'immunoditeczione
Software Graphpad Prism 9.0	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	Prism 9.0	Software per la grafica
Kit per analisi GSH	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	S0053	Kit per il rilevamento del contenuto di glutatione
Kit per la colorazione HE	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	C0105S	Kit di colorazione istologica per l'analisi morfologica dei tessuti
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N0003	Honokiol, composto bioattivo
Fibroblasti dermici umani	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Cina	SNP-H342	Cellule primarie di fibroblasti della pelle umana
Software IBM SPSS Statistics 26.0	IBM Corporation, Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics 26.0	Software per l'analisi statistica
Software ImageJ	Wayne Rasband, Istituto Nazionale di Salute Mentale, USA	Versione 1.54H	Software di analisi delle immagini
Anticorpo Ki67	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14520	Anticorpo primario per la rilevazione dei marcatori di proliferazione cellulare
Microscopio ottico	Leica, Heidelberg, Germania	DM3000	Microscopio ottico per imaging in campo chiaro
Kit di colorazione tricromo Masson	Solarbio, Pechino, Cina	G1340	Kit per la colorazione di collagene e tessuto connettivo
Kit per analisi MDA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	S0131S	Kit di rilevamento del livello di malondialdeide (marcatore di perossidazione lipidica)
Lettore di microplacche	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	1410101	Strumento di misurazione dell'assorbenza per saggi basati su celle
Anticorpo MMP-1	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-27210	Anticorpo primario per il rilevamento della metalloproteinasi della matrice-1
Kit MMP-1 ELISA	Biotecnologie collegate agli enzimi, Shanghai, Cina	ml038199	Rilevamento quantitativo di MMP-1 in campioni biologici
Anticorpo MMP-3	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab52915	Anticorpo primario per la rilevazione della metalloproteinasi matriciale-3
Kit MMP-3 ELISA	Biotecnologie collegate agli enzimi, Shanghai, Cina	ml105322	rilevamento quantitativo di MMP-3 in campioni biologici
Gomma neutra	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	C0173	Mezzo di montaggio
Anticorpo P16	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-20379	Anticorpo primario per la rilevazione della proteina P16
Anticorpo P21	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14949	Anticorpo primario per la rilevazione della proteina P21
Anticorpo P53	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab131442	Anticorpo primario per la rilevazione della proteina P53
paraformaldeide	Solarbio, Pechino, Cina	P1110	Reagente di fissazione cellulare e tissutale
PI	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	ST512	Iodio di propidio per la colorazione del DNA nell'analisi del ciclo cellulare
Kit per il saggio peptidico pro-collagene I C	TAKARA, Tokyo, Giappone	MK101	Kit per il rilevamento della sintesi del collagene
Anticorpo p-Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-244G	anticorpo primario per la rilevazione di Smad2 fosforilata
Anticorpo p-Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-246G	anticorpo primario per la rilevazione di Smad3 fosforilato
Membrane PVDF	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	88520	Membrana di trasferimento proteico per Western blotting
Buffer di lisi RIPA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	P0013B	Buffer di estrazione proteica per i lisati cellulari e tissutali
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	ST579	ribonucleasi per la rimozione dell'RNA durante la colorazione del DNA
Kit di colorazione SA-β-galactosidasi	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	C0602	Kit di rilevamento della senescenza cellulare
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-10431	TGF-& beta; 1 Inibitore della via di segnalazione
Gel SDS-PAGE	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	WG1403BX10	Gel di poliacrilamide per elettroforesi proteica
Topi senza pelo SKH1	Vitalriver, Pechino, Cina		Modello animale per studi di foto-invecchiamento cutaneo
Anticorpo Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1300	anticorpo primario per la rilevazione di Smad2
Anticorpo Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1500	anticorpo primario per la rilevazione di Smad3
Kit SOD Assay	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	S0101S	Kit di rilevamento dell'attività da superossido dismutasi
TGF-& beta; 1 Anticorpo	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab215715	anticorpo primario per TGF-& beta; 1 Rilevamento
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-100	detergente non ionico per permeabilizzazione della membrana cellulare
Soluzione per il saggio TUNEL	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina	C1086	Reagente per il rilevamento dell'apoptosi per la frammentazione del DNA
Xylene	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	247642	Solvente organico per la deparaffinizzazione dei tessuti