Isolamento e coltura di preadipociti bianchi e bruni da embrioni di topo

Sommario

Presentiamo un approccio innovativo, robusto e riproducibile per isolare e coltivare preadipociti bianchi e marroni da embrioni di topo, stabilendo una potente strategia in vitro per dissezionare i meccanismi cellulari e molecolari che governano l'impegno e la differenziazione della linea adiposa, e fornendo un quadro per indagare l'impatto dello sviluppo del tessuto adiposo.

Abstract

Il tessuto adiposo svolge un ruolo centrale nell'omeostasi metabolica e le sue proprietà vengono modellate durante lo sviluppo embrionale tramite la differenziazione degli adipociti. I preadipociti embrionali, quindi, rappresentano un modello rilevante per studiare gli eventi precoci nella formazione del tessuto adiposo e nella specifica della linea. Questo articolo descrive un protocollo riproducibile per l'isolamento e la differenziazione in vitro di preadipociti bianchi e marroni isolati da embrioni di topo al giorno embrionale 15.5 (E15.5), una fase di sviluppo in cui iniziano a formarsi depositi adiposi. Il metodo fornisce indicazioni dettagliate per la microdissezione tissutale, la digestione enzimatica, la coltura primaria e le condizioni di differenziazione specifiche per linea che supportano la vitalità cellulare e la maturazione adipogenica. I risultati rappresentativi includono l'accumulo di gocce lipidiche e l'espressione dei marcatori associati alla linea, confermando una differenziazione riuscita in condizioni di coltura definite. Con questo approccio, i preadipociti embrionali possono essere indirizzati verso destini degli adipociti bianchi o marroni, consentendo analisi comparative dei tempi di sviluppo, delle caratteristiche di lineamento e dei profili di espressione genica. Questo protocollo offre uno strumento pratico e rilevante per lo sviluppo per indagare la formazione del tessuto adiposo e i meccanismi di programmazione perinatale in un contesto sperimentale controllato.

Introduzione

Il tessuto adiposo svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell'omeostasi di tutto il corpo regolando l'immagazzinamento di energia, la segnalazione endocrina e la termogenesi adattativa, interagendo in modo esteso sia con organi locali che^{distanti 1,2,3}. Si possono distinguere due principali tipi di tessuto adiposo: il tessuto adiposo bianco (WAT) e il tessuto adiposo marrone (BAT), che differiscono notevolmente per linea cellulare, funzione fisiologica, distribuzione anatomica e attività^{metabolica 4}.

La WAT costituisce il serbatoio di energia primario dell'organismo. Gli adipociti bianchi sono altamente specializzati per l'immagazzinamento lipidico e si caratterizzano dalla presenza di una singola grande goccia lipidica (LD) che occupa la maggior parte dello spazio^{citoplasmatico 5}. Al contrario, BAT è specializzato nella termogenesi non tremante. Gli adipociti bruni contengono molteplici piccoli LD e mostrano un'elevata densità^{mitocondriale 3,6}. La capacità termogenica di BAT si basa sulla Proteina di Saccoppiamento 1 (UCP1), una proteina della membrana mitocondriale interna che facilita la perdita di protoni attraverso la^{membrana 7}. Separando la fosforilazione ossidativa dalla sintesi dell'ATP, UCP1 dissipa il gradiente protonico sotto forma di calore, contribuendo così al mantenimento della temperatura^{corporea 8}. Data la loro variegata funzione, WAT e BAT hanno suscitato notevole interesse non solo come regolatori chiave e potenziali bersagli terapeutici nelle malattie metaboliche, ma anche nella biologia dello sviluppo ed evolutiva, nell'immunologia e nell'invecchiamento, grazie alle loro complesse e di vasta portata interazioni^{sistemiche 9,10}. Le evidenze accumulate indicano anche che la programmazione metabolica fetale è strettamente associata allo sviluppo del tessuto adiposo, poiché le perturbazioni nell'ambiente intrauterino possono influenzare il numero, la distribuzione e la funzione degli adipociti, predisponendo così gli individui all'obesità e a malattie metaboliche più avanti nella^{vita 11}.

Per indagare la biologia del tessuto adiposo, la disponibilità di adipociti maturi è essenziale. I sistemi di coltura in vitro forniscono un ambiente controllato che consente la valutazione di fattori specifici che influenzano l'adipogenesi e la funzione degli adipociti. Sono stati stabiliti diversi protocolli per l'isolamento e la differenziazione degli adipociti da topi adulti o cuccioli^neonatali 12,13,14,15. Tuttavia, questi progenitori degli adipociti possono differire dalle popolazioni cellulari originali che danno origine ai tessuti adiposi durante lo sviluppo. Nei topi, i depositi BAT sono i primi a svilupparsi durante l'embriogenesi, fornendo ai neonati una capacità termogenica non tremante, fondamentale per l'adattamento postnatale al freddo. I depositi di adipociti bruni possono essere rilevati nella regione interscapolare già dal giorno embrionale 14.5 (E14.5)¹⁶. I LD iniziano a formarsi a E15.5 e l'espressione di UCP1 viene avviata intorno a E16.5. Nell'embrione di topo, i preadipociti del WAT inguinale (iWAT) sono già presenti in questa fase¹⁶.

Il protocollo descritto qui si concentra sui preadipociti isolati a E15.5. Questa fase corrisponde al periodo embrionale durante il quale le cellule progenitrici avviano la differenziazione in vivo¹⁶, rappresentando così i progenitori primari che danno origine a WAT e BAT. Al contrario, i progenitori adipogeni isolati in stadio adulto o neonatale potrebbero già essere stati influenzati da fattori ambientali e probabilmente mostraranno una plasticità più limitata. Pertanto, l'uso di progenitori embrionali a E15.5 aumenta la capacità di ricapitolare fedelmente il programma adipogenico in vivo , poiché queste cellule mantengono un alto grado di plasticità dello sviluppo e sono più inclini a seguire le traiettorie di differenziazione fisiologica. Questo approccio è di particolare interesse per questioni di biologia dello sviluppo, in particolare per l'indagine degli effetti dei fattori ambientali sulla differenziazione dei preadipociti durante il periodo perinatale, fornendo un modello prezioso per studiare come le esposizioni precoce possano influenzare lo sviluppo del tessuto adiposo e gli esiti metabolici a lungo termine. Tuttavia, gli utenti dovrebbero essere cauti riguardo a questa specificità di stadio: il metodo è ottimizzato per embrioni E15.5, e deviazioni nell'età embrionale o nella precisione della dissezione possono influire sulla resa o sulla vitalità cellulare. Inoltre, la tecnica di microdissezione richiede pratica per evitare la contaminazione con tessuti non adiposi, soprattutto data la piccola dimensione dei depositi embrionali. Questo protocollo riassume tutti i passaggi e le procedure per isolare, coltivare, amplificare e differenziare i preadipociti embrionali in adipociti maturi marroni e bianchi.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state eseguite secondo le normative locali e secondo le linee guida definite dalla Direttiva del Consiglio dell'Unione Europea del 22 settembre 2010 (2010/63/UE) (APAFIS#2617-2015110517317420).

Tutti i rifiuti biologici e le soluzioni enzimatiche devono essere gestiti e smaltiti secondo le linee guida e le normative istituzionali sulla biosicurezza per i materiali biopericolosi. In particolare:
- Rifiuti biologici: raccogliere in contenitori approvati per i rischi biologici e smaltirli tramite autoclaving o come indicato dall'ufficio biosicurezza dell'istituzione.
- Soluzioni enzimatiche: inattivare l'attività enzimatica residua aggiungendo il 10% di candeggina per 30 minuti e smaltire come rifiuto chimico secondo le normative locali.
- Consumabili contaminati (punte di pipetta, tubi, ecc.): da mettere in sacchetti di biohazard e autoclave prima dello smaltimento.
- Reagenti di fissazione: smaltire come rifiuti chimici pericolosi in contenitori designati.

Indossa sempre i DPI adeguati quando maneggia i rifiuti.

1. Prelievo degli embrioni di topo

1. Eutanasiate i topi gravidi (C57Bl/6J) in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali.
2. Disinfettare l'addome dei topi gravidi con etanolo al 70% e fare un'incisione mediana per esporre l'utero.
3. Incisci la cavità addominale per rimuovere i sacchi vitelini contenenti gli embrioni a E15.5 e mettili in una scatola di agarosio contenente 1x PBS freddo (4 °C).
4. Rimuovere la membrana esterna di ogni sacco vitellino e la placenta, e tagliare il cordone ombelicale degli embrioni.
5. Posiziona gli embrioni in una nuova scatola di agarosio contenente PBS freddo 1x.
   NOTA: Sebbene le strutture del sistema nervoso centrale alla base della percezione cosciente del dolore non siano ancora completamente sviluppate in questa fase gestazionale, i nocicettori periferici iniziano a formarsi tra E13 ed E15. In conformità con le linee guida istituzionali per la cura degli animali, per minimizzare potenziali risposte nocicettive, raccomandiamo tuttavia che gli embrioni vengano soppressi per decapitazione prima di qualsiasi manipolazione sperimentale.

2. Dissezione dei tessuti adiposi embrionali (Figura 1)

1. Dissezione del BAT interscapolare (Figura 1A)
   1. Taglia un rettangolo da una piastra di agarosio al 5% e metti l'embrione al suo interno per immobilizzarlo. Riempi il piatto con PBS freddo 1x. Posizionare la scatola dell'agarosio con l'embrione sotto un microscopio binoculare.
   2. Rimuovi la pelle dalla parte posteriore dell'embrione.
   3. Disseziona il pipistrello interscapolare usando pinze sottili e microforbici.
   4. Separare con cura il BAT dal tessuto circostante (tessuto congiuntivo e muscolo) utilizzando microforbici per ottenere un campione di BAT di circa 4–6 mm x 2–3 mm.
   5. Inserire il BAT in un tubo da 2 mL contenente 1 mL di glutamina fredda (4 °C) di Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F-12 (DMEM/F-12) con 100 U/mL di penicillina/streptomicina (P/S).
2. Dissezione dell'iWAT (Figura 1B)
   1. Posiziona l'embrione su un lato (da un lato e poi dall'altro) sulla lastra di agarosio.
   2. Disseziona l'iWAT usando pinze fini e microforbici.
   3. Separare l'iWAT dai tessuti circostanti (tessuto connettivo e pelle) con attenzione fino a ottenere due depositi di misura approssimativa di 2–4 mm x 0,5–0,8 mm.
   4. Inserire i due campioni WAT in un tubo da 2 mL contenente 1 mL di glutammina fredda DMEM/F-12 con 100 U/mL di penicillina/streptomicina (P/S).
      NOTA: Tutte le dissezioni devono essere eseguite al microscopio binoculare nell'ambiente più sterile possibile, utilizzando strumenti già disinfettati in anticipo.

3. Digestione dei tessuti adiposi

1. Rimuovere il DMEM/F12 con una pipetta e aggiungere nei tubi 200 μL di glutammina DMEM/F12 con 100 U/mL p/s, albumina sirica bovina (BSA) allo 0,2%, collagenasi D 0,5 U e dispase II 0,5 U.
2. Taglia i tessuti con microforbici nei tubi per ridurre il più possibile i pezzi di tessuto e aiutare il processo digeritivo pipettando su e giù 10 volte.
   NOTA: I campioni completamente digeriti dovrebbero apparire come una sospensione torbida senza grumi di tessuto visibili.
3. Incubare a 37 °C (in un bagno d'acqua) per 15 minuti.
4. Fermare la reazione aggiungendo 600 μL di glutammina fredda DMEM/F-12 con 100 U/mL p/s, 20% di siero fetale bovino (FBS). Risospendi in modo uniforme pipettando su e giù 10 volte.

4. Coltura cellulare primaria

NOTA: Da questo passaggio in poi, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni rigidamente sterili in un Armato di Sicurezza Biologica (BSC) per prevenire contaminazioni. Indossa guanti sterili, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza per mantenere la sterilità e proteggerti dai potenziali pericoli. Utilizza plastica usa e getta sterile, tecniche asettiche e assicurati che tutti i reagenti e i mezzi siano sterili. Evita il contatto con superfici non sterili per evitare contaminazioni.

1. Placcare le cellule su vetri di pozzo e incubarle in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂) per 1 ora; per piastre a 8 pozzi, si applica 200 μL/pozzo. Dopo l'incubazione, confermare che le cellule siano aderite muovendo delicatamente la piastra mentre osservate al microscopio.
   NOTA: In questa fase, diversi campioni di BAT o WAT possono essere raggruppati in un unico tubo per ottenere colture omogeneizzate nei diversi pozzi (ad esempio, per testare l'effetto di un trattamento su colture simili).
2. Sostituire il mezzo con glutamina preriscaldata (37 °C) DMEM/F-12 con 100 U/mL p/s, 10% FBS e incubare le cellule durante la notte a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: Cambiando il mezzo, vengono rimosse cellule morte/non attaccate e frammenti di tessuto che non potevano essere degradati, lasciando solo le cellule attaccate.
3. Trattamento di differenziazione (72 h)
   1. Per la differenziazione degli adipociti marroni, si cambia il mezzo usando glutamina dmem/f-12 preriscaldata (37 °C) CON 100 U/mL p/s, 10% FBS, 125 nM di indometacina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 nM triiodotironina (T3), 1 μM di rosiglitazone, 1 μM di desametasone e 850 nM di insulina e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 72 ore.
   2. Per la differenziazione degli adipociti bianchi, si cambia il mezzo usando DMEM/F-12 glutamina preriscaldata con 100 U/mL p/s, 10% FBS, 0,5 mM IBMX, 1 μM di desametasone e 850 nM di insulina e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 72 ore.
4. Trattamento di mantenimento (ogni 48 ore)
   1. Cambia il mezzo usando dmem/f-12 preriscaldato (37 °C) GLUTAMINE CON 100 U/mL p/s, 10% FBS, 1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone e 850 nM di insulina. Rinnova il mezzo ogni 48 ore.
      NOTA: Tutte le concentrazioni elencate si riferiscono alle concentrazioni finali di lavoro dei reagenti. Si regolano i volumi finali di mezzi di differenziazione e manutenzione in base al numero di pozzi da trattare, utilizzando 200 μL per pozzo come volume standard per piastre a 8 pozzi.

5. Fissazione e immunocolorazione (Figura 2A)

1. Aspira il substrato e lava le cellule con 1x PBS freddo.
2. Fissa le cellule per 10 minuti con formaldeide fredda al 4% in 1x PBS.
3. Lava le celle con 1 PBS per 3 x 5 minuti.
4. Permeabilizza le cellule con lo 0,1% di Triton in 1x PBS per 10 minuti.
5. Lava le celle con 1 PBS per 3 x 5 minuti.
6. Blocca i siti inspecifici con il 5% di siero normale dell'asino (NDS) in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: La scelta della specie per il siero bloccante dipende dalla specie in cui sono prodotti gli anticorpi secondari.
7. Incubare anticorpi primari diluiti in NDS al 5% in 1x PBS durante la notte a 4 °C.
   NOTA: Non aggiungere anticorpi primari a uno dei pozzi: questo fungerà da controllo negativo.
8. Lava le celle con 1 PBS per 2 x 5 minuti.
9. Lava le cellule con il 5% di NDS in 1x PBS per 5 minuti.
10. Incubare con gli anticorpi secondari, DAPI e Bodipy per 1 ora a RT, coperto per proteggere dalla luce.
11. Lava i pozzi con 1x PBS per 3 x 5 minuti.
12. Mantenere le cellule a 4 °C al buio fino all'acquisizione delle immagini.

6. Crioconservazione dei preadipociti

NOTA: È possibile interrompere la coltura e congelare le cellule prima o dopo il processo di differenziazione per conservarle e riutilizzarle per colture cellulari successive.

1. Prepara il mezzo congelante: 50% FBS, 40% DMEM/F-12 glutamina con 100 U/mL p/s, 10% Dimetil Solfossido (DMSO).
   ATTENZIONE: Il DMSO è una sostanza chimica pericolosa. È un irritante per la pelle e gli occhi, può facilitare l'assorbimento di altre sostanze tossiche attraverso la pelle e può causare danni se inalata o ingerita. Maneggia sempre il DMSO all'interno del BSC per minimizzare l'esposizione e la contaminazione. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata (guanti sterili, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza per prevenire il contatto). Evita il contatto con la pelle. In caso di contatto, lava subito con molta acqua. Conserva il DMSO in un contenitore ben sigillato all'interno del BSC quando non viene utilizzato e assicurati lo smaltimento corretto secondo i protocolli di sicurezza del laboratorio.
2. Lava le cellule con PBS preriscaldato (37 °C).
3. Aggiungere tripsina preriscaldata (37 °C) allo 0,05% per staccare chimicamente le cellule e incubare 5 minuti a 37 °C, 5% di CO₂. Controlla visivamente se ci sia un distacco cellulare al microscopio.
4. Ferma la reazione aggiungendo 3 volte il volume di glutamina preriscaldata (37 °C) DMEM/F-12 con 100 U/mL p/s, 10% FBS. Risospendi in modo uniforme.
5. Centrifuga 7 minuti a RT, 300 × g e scarta il soprantantante.
6. Risospendere le cellule in 10 mL di mezzo congelante. Centrifugare 7 min a RT, 300 × g e scartare il sovrantantante, lasciando circa 3 mL.
   NOTA: Misura il volume esatto per calcolare il numero totale di celle dopo il conteggio.
7. Diluire un piccolo volume 1:2 con Trippan Blue e contare le cellule vive usando una camera Neubauer.
8. Regolare il volume con il mezzo congelante per ottenere 5 × 10⁴ – 1 × 10⁵ cellule/fiala (volume finale: 1 mL/fiala).
9. Trasferire le fiale in un contenitore congelante (tasso di raffreddamento: -1 °C/min) e conservare a -80 °C durante la notte.
10. Trasferisci in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Questo protocollo consente una vitalità superiore al 90% dopo lo scongelamento.
11. Scongelare le celle quando necessario scongelando rapidamente la fiala in un bagno d'acqua a 37 °C.
12. Trasferire il contenuto della fiala a 4 mL di glutamina preriscaldata (37 °C) DMEM/F-12 con 100 U/mL p/s, 10% FBS. Risospendi in modo uniforme pipettando delicatamente su e giù 10 volte. Incubare durante la notte a 37 °C, 5% CO₂.
13. Sostituisci il mezzo con DMEM/F-12 nuova glutammina con 100 U/mL p/s, 10% FBS e rinnova ogni 48 ore.
    NOTA: È fondamentale cambiare il mezzo per rimuovere i residui di DMSO, poiché un'esposizione prolungata può compromettere la vitalità, la differenziazione e la funzione cellulare. Assicurati una sostituzione completa del mezzo per evitare effetti citotossici.
14. Procedi con esperimenti o cellule di passaggio quando raggiungono l'80% di confluenza.

Risultati

Come illustrato nella Figura 1, i depositi intatti di BAT e iWAT possono essere isolati efficacemente dagli embrioni a E15.5. Sebbene il BAT sia facilmente rilevabile negli embrioni di E15.5, il rilevamento dell'iWAT può richiedere addestramento. In entrambi i casi, è essenziale microdissezionare tutto il tessuto circostante dopo una dissezione ruvida per evitare la coltivazione di altri tipi cellulari.

Le fasi iniziali di digesti...

Discussione

La coltura dei preadipociti è stata ampiamente descritta in diversi contesti sperimentali. Tuttavia, i protocolli esistenti si basano prevalentemente su tessuti adulti o fibroblasti embrionali, e attualmente non sono disponibili metodi standardizzati per isolare e coltivare preadipociti embrionali direttamente da tessuti adiposi in sviluppo. Studiare queste cellule è particolarmente importante, poiché rappresentano le autentiche popolazioni di preadipociti che risiedono nel loro microamb...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3,5,3'-triiodotironina	Sigma	709719	T3
3-isobutil-1-metilxanthina	Sigma	I7018	IBMX
Agarose	Sigma	A0169
Alcol	VWR	1.59010.0500
Anticorpo anti-UCP1	Abcam	AB10983
Microscopio binoculare	Leica	MZ9.5
Cabinet di sicurezza biologica	Thermo Scientific	51022482	BSC, HeraSafe KS Classe II Armato di sicurezza
Bodipy	Invitrogen	D3922	Eccitazione/Emissione 493/504 nm
Albumina sierica bovina	Euromedex	04-100-812-C	BSA
Centrifuga	Eppendorf	5430 R
Morsetti	FST (Germania in acciaio inox)
Collagenasi D	Sigma	11088882001
Criotubi	Sarstedt	72.379
Piastre di coltura (8-pozzi)	Ibidi	80826
Piastre di coltura (12 pozzi)	Corning Costar	CLS3513	Piastra in polistirene, fondo piatto, sterile
Desametasone	Sigma	D2915
Dispase II	Sigma	4942078001
DMEM/F12	Gibco	31331	Aggiunta di glutammina
DMSO	Sigma	D2438
Anticorpo anti-coniglio dell'asino	Invitrogen	A32795	Alexa Fluo Plus 647
Eppendorfs 1,5 mL	Eppendorf	15625367
FBS	Gibco	A5256701
Formaldeide 37%	Thermo Scientific	119690010
Contenitore congelante	Thermo Scientific	5100-0001
Hoechst	Invitrogen	H3570
Incubatore	Thermo Scientific	50116048	Incubatore di CO2 Heracell 150i
Indometacina	Sigma	I7378
Insulina	Sigma	I9278
microscopio rovesciato dotato di un microscopio 10 e volte; Obiettivo e illuminazione alogena	Carl Zeiss Axio Vert.A1
Mouse C57BL/6J	Fiume Charles
Microforbici	FST (Germania in acciaio inox)
NDS	Sigma	D9663
Camera di Neubauer	Thermo Scientific	10195580
PBS 10x	Gibco	14200
PBS 1x	Gibco	14190
Penicilina/Streptomicina	Gibco	15140-122
Piastre di Petri	Sarstedt	83.3902
Targhe qPCR	Thermo Scientific	AB-0600
Sonda qPCR per Fabp4	Thermo Scientific	4331182	TaqMan analizza, Mm00445878_m1
Sonda qPCR per Pparg	Thermo Scientific	4331182	TaMan saggia, Mm00440940_m1
Sonda qPCR per Ucp-1	Thermo Scientific	4331182	TaqMan analizza, Mm01244861_m1
Kit di trascrizione inversa	Thermo Scientific	4368813	Kit cDNA ad alta capacità
Kit di estrazione RNA	Omega Bio-Tek	R6934-02	E.Z.N.A. Kit RNA TOTALE II
Rosiglitazone	Sigma	R2408
Triton X-100	Thermo Scientific	A16046
Trippan Blue	Sigma	T8154
Tripsina-EDTA	Gibco	25300054
Bagno d'acqua	Grant	SAP12	Capacità 12 L