Valutazione colorimetrica dell'attività della Deiodinasi 1 nei microsomi epatici umani utilizzando la reazione di Sandell-Kolthoff

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo colorimetrico per valutare in modo affidabile l'influenza delle sostanze chimiche sull'attività della Deiodinasi 1 (DIO1) nei microsomi epatici umani utilizzando la reazione di Sandell-Kolthoff. Include criteri di accettazione predefiniti e metriche statistiche di performance e supporta gli sforzi continui per l'inclusione nelle linee guida dei test OCSE.

Abstract

Questo metodo consente di identificare sostanze di prova che inibiscono l'attività della DIO1 e che possono quindi interferire con l'omeostasi dell'ormone tiroideo. Il protocollo presentato descrive un metodo colorimetrico non radioattivo per valutare gli effetti delle sostanze di prova sull'attività enzimatica della Deiodidinasi 1 (DIO1) nei microsomi epatici umani. Il saggio si basa sulla reazione di Sandell-Kolthoff (SK), che quantifica lo ioduro rilasciato durante la deiodinazione della triiodotironina inversa (rT3) in diiodothironina (T2). Il cerio giallo (IV) viene ridotto a cerio incolore (III) in presenza di iodio, permettendo la rilevazione fotometrica a 415 nm. In questa configurazione standardizzata, la concentrazione di cerio (IV) è impostata a 40 mM per migliorare la stabilità e la robustezza del segnale nelle condizioni descritte. Per garantire affidabilità e riproducibilità del saggio, è incluso un sistema di controllo completo: 6-propil-2-tioracille (elemento di riferimento), aurothioglucosio (controllo positivo), 1-tio-β-D-glucosio sale di sodio (controllo negativo) e 1% di dimetil solfosido (controllo con solventi). Il protocollo include un test di misurazione per determinare le concentrazioni di test appropriate, la standardizzazione dell'attività di rilascio di ioduro specifica per lotto di microsomi e test strutturati di interferenza chimica in assenza di microsome, con una valutazione di follow-up opzionale senza ditiotreitolo (DTT) per identificare artefatti dipendenti dalla DTT. Il saggio DIO1-SK è adatto per screening di media ad alta produttività e studi di tossicologia meccanicistica. La sua robustezza, scalabilità e applicabilità ai microsomi umani lo rendono uno strumento prezioso per indagare la perturbazione endocrina. Questo protocollo supporta gli sforzi di validazione normativa.

Introduzione

I disturbatori endocrini (DE) sono sostanze chimiche che interferiscono con la regolazione ormonale e di conseguenza causano effetti avversi negli esseri^{umani 1,2}. Le deididasini (DIO) sono enzimi associati alla membrana, con la selenocisteina come residuo chiave nei loro siti attivi. Questa famiglia enzimatica comprende tre isoforme distinte (DIO1, DIO2 e DIO3), che modulano collettivamente le concentrazioni dell'ormone tiroideo circolante (TH) e ne regolano la disponibilità specifica per tessuto all'interno delle^{cellule 3}. La tiroxina (T4), che funge da proormone, e la triiodotironina (T3), la forma attiva, svolgono ruoli vitali nella regolazione della spesa energetica, della crescita, dei processi di sviluppo e della termoregolazione nel^{corpo 4}. Le isoforme DIO differiscono per le caratteristiche della specificità del sito di deiodinazione, delle proprietà cinetiche e delle preferenze del^{substrato 3}. La DIO1 è la principale isoforma della deiodinasi nel fegato adulto e mostra una forte affinità con il substrato per la triiodotironina inversa (rT3) e le iodotironine solfaticate, mentre la DIO2 utilizza preferenzialmente T4 e rT3, e la DIO3 agisce principalmente su T4 e T3. L'utilizzo di microsomi epatici umani e rT3 come substrato consente una rilevazione selettiva dell'attività di DIO1, minimizzando l'interferenza da altre isoforme. Sebbene le conseguenze precise dell'inibizione della DIO1 indotta dalla sostanza restino ancora da chiarire, le evidenze delle mutazioni geniche umane che influenzano la DIO1 dimostrano chiaramente che la DIO1 può alterare il sistema ormonale^{tiroideo 5}. Di conseguenza, esiste un bisogno critico di metodi robusti e riproducibili per indagare l'inibizione di DIO1.

L'obiettivo del metodo presentato è quantificare l'attività DIO1 in vitro utilizzando un approccio colorimetrico non radioattivo basato sulla reazione di Sandell-Kolthoff (SK). DIO1 catalizza la conversione di rT3 inversa in T2, un processo che porta al rilascio di ioni iodio. La reazione SK consente una rilevazione sensibile dello ioduro rilasciato, consentendo di determinare l'attività di rilascio di ioduro (IRA) come misura diretta dell'attività di DIO1. Questo saggio consente di individuare gli effetti inibitori delle sostanze di prova su DIO1, supportando la tossicologia meccanicistica, lo screening o il processo decisionale regolatorio. È particolarmente rilevante per indagare l'inibizione della DIO1 come evento molecolare di avvio delle vie di esiti avversi che portano a una distruzione tiroidea, come evidenziato dagli sforzi internazionali di validazione come quelli coordinati da EURL ^{ECVAM 6,7}. Il metodo è stato originariamente sviluppato nel 2012 ^8,9 e ulteriormente ottimizzato ^6,7 in risposta alla crescente necessità di saggi in vitro robusti, riproducibili e scalabili, che possano essere integrati nelle batterie di test per lo screening endocrino, specialmente nel contesto del metabolismo dell'ormone tiroideo. Recentemente è stata pubblicata l'applicazione di configurazioni analogiche basate su SK per lo screening^{11 medio-10} ad alta produttività, dimostrando l'ampia applicabilità dell'approccio basato su SK.

Anche se il saggio DIO1-SK misura indirettamente l'attività DIO1 quantificando i prodotti IRA invece che TH, offre diversi vantaggi rispetto a tecniche alternative. A differenza dei metodi che si basano su substrati^{radiomarcati 12} o sulla quantificazione basata sulla spettrometria di massa degli ormoni tiroidei impoveriti^{o formati 13}, la reazione SK fornisce una lettura semplice, scalabile ed economica misurando il rilascio di ioduro a 415^{nm 14}. Sebbene i metodi LC-MS/MS con estrazione in fase solida (SPE-LC-MS/MS) offrano alta specificità e sensibilità per quantificare rT3 e T2, richiedono strumenti costosi e sono meno adatti per lo screening ad alta produttività. Al contrario, il test DIO1-SK può essere implementato in ambiti standard di laboratorio ed è stato preconvalidato per l'uso con microsomi epatici umani, dimostrando un'elevata riproducibilità e predittività ^6,7. In uno studio comparativo, i risultati della reazione SK, in particolare il rilascio di iodio, sono stati confrontati direttamente con la quantificazione dei metaboliti dell'ormone tiroideo (rT3 e T2) utilizzando SPE-LC-MS/^{MS 15}. I risultati hanno rivelato una forte concordanza tra i due approcci su una gamma di sostanze di prova e potenze inibitorie. Per tutte le sostanze testate, le variazioni nell'attività di rilascio di iodio (IRA) misurate dalla reazione SK rispecchiavano da vicino le alterazioni nei livelli di rT3 e T2 determinate dalla spettrometria di massa. Ciò ha ulteriormente supportato la validità della lettura SK come surrogato per l'attività DIO1. Queste analisi comparative confermano che il saggio SK offre un'alternativa robusta e affidabile a tecniche analitiche più complesse, e che il rilascio di iodio può essere misurato con sicurezza per valutare l'inibizione di DIO1 in vitro.

Tuttavia, il metodo SK presenta alcune limitazioni che devono essere considerate: è suscettibile all'interferenza di sostanze che contengono ioduro libero come impurità, rilasciano ioduro in modo non enzimatico o reagiscono con componenti del test come il ditiotreitolo (DTT). La DTT è inclusa come cofattore riducente per mantenere la competenza catalitica della deiodinasi supportando la rigenerazione della selenocisteina attiva nel suo stato ridotto durante il turnover. Poiché la DTT è un forte riduttivo, alcune sostanze di prova (o impurità) possono subire reazioni redox che possono influenzare la lettura colorimetrica e, in alcuni casi, portare ad artefatti di analisi dipendenti dalla DTT non correlati al rilascio enzimatico di iodio. Tali interferenze possono portare a risultati falsi negativi per l'inibizione di DIO1, poiché lo ioduro misurato potrebbe non derivare dalla conversione enzimatica di rT3. Pertanto, mentre il test SK è adatto per lo screening di routine e per la maggior parte delle sostanze di prova, LC-MS/MS potrebbe essere utilizzato per conferma ogni volta che si sospetta interferenza nel saggio o per sostanze con proprietà chimiche complesse.

Il saggio DIO1-SK è attualmente in fase di preparazione per essere inserito come linea guida OCSE in un progetto internazionale PEPPER (piattaforma pubblico-privata per la validazione dei metodi di caratterizzazione dei disruptori endocrini), che ne sottolinea la crescente importanza per le applicazioni regolatorie e l'armonizzazione internazionale delle strategie di test dei disruptori endocrini. Il test può essere integrato in batterie di test in vitro complete, supportando sia la valutazione della sicurezza chimica sia le indagini meccanicistiche sulle alterazioni^{endocrine 16}. Quando combinato con saghi che affrontano ulteriori eventi chiave lungo il percorso degli esiti avversi alla tiroide, contribuisce a una comprensione più completa dei meccanismi di disturbo degli ormoni tiroidei.

Inoltre, la scalabilità e l'elevata riproducibilità del protocollo lo rendono particolarmente adatto per lo screening a through-media e alta. Questo è essenziale per valutare un gran numero di sostanze durante lo sviluppo di farmaci e in ambito accademico, come recentemente^{dimostrato 11}. I ricercatori interessati all'inibizione di DIO1, sia per lo screening, la tossicologia meccanicistica o il processo decisionale regolatorio, trarranno beneficio da un saggio robusto, accessibile e versatile. La convalida di questo metodo lo renderà uno strumento standard per la ricerca sulla perturbazione del sistema ormonale tiroideo e per la valutazione della sicurezza chimica.

Protocollo

NOTA: Prima di eseguire il test principale, è essenziale una serie di passaggi preparatorii per garantire accuratezza, riproducibilità e validità del test DIO1-SK. Queste attività di pre-analisi includono la colata di piastre filtranti riempite di resina a scambio ionico, che sono fondamentali per una separazione efficace e per minimizzare le interferenze di fondo nella reazione SK. La reazione di Sandell-Kolthoff viene regolarmente standardizzata utilizzando curve standard a iodio per monitorare cambiamenti sistematici e mantenere la qualità del saggio. L'attività dei microsomi epatici umani viene misurata per determinare la capacità di rilascio di ioduro specifica per lotto, garantendo una performance enzimatica costante tra gli esperimenti. Insieme, questi passaggi forniscono una solida base per il successivo lavoro principale di analisi e la valutazione dei dati, supportando la generazione di risultati riproducibili e interpretabili.

1. Lavoro di preassay

1. Preparazione di buffer e reagenti
   1. Preparare in anticipo tutti i buffer e le soluzioni stock come descritto nella Tabella 1. Conservare le aliquote come indicato per garantire stabilità e riproducibilità.
   2. Il giorno del saggio, prepara il substrato fresco per ogni piastra da 96 pozzi. Per una piastra da 96 pozzi, si combinano 5,75 mL di tampone HEPES/EDTA (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL di 1 M DTT scongelato e 10 μL di 6 mM rT3 (disciolto in DMSO). Mescola delicatamente e tieni il substrato sul ghiaccio fino all'uso.
2. Preparazione del riferimento
   1. Prepara una soluzione stock ^10-1 M di 6-PTU di riferimento in un solvente appropriato (ad esempio, DMSO) fresco il giorno dell'esecuzione del saggio.
   2. Preparare una diluizione 1:10 di questo stock in_{diH 2O}(RI-C8) per raggiungere una concentrazione di DMSO del 10% e preparare una serie di diluizioni da questo stock in DMSO al 10% in_{diH 2}O come descritto nella Tabella 2.
3. Preparazione del controllo positivo
   1. Prepara una soluzione stock di ^10-2 M del controllo positivo Aurothioglucosio in un solvente appropriato (ad esempio, DMSO) e conservalo fino a 6 mesi a 4 °C.
   2. Il giorno del saggio, diluire la stock a ^10-3 M in_{diH 2}O per ottenere una concentrazione di DMSO del 10% di DMSO.
4. Preparazione del controllo negativo
   1. Prepara una soluzione di stocco di ^10-2 M del sale sodio 1-Thio-β-D-glucosio sotto controllo fresco il giorno dell'esecuzione.
   2. Il giorno del saggio, diluire la stock a ^10-3 M in_{diH 2}O per ottenere una concentrazione di DMSO del 10% di DMSO.
      NOTA: Utilizzare sempre le adeguate precauzioni di sicurezza, specialmente quando si maneggiano sostanze chimiche pericolose come arsenite di sodio e acido solforico. Tutti i reagenti devono essere preparati con acqua deionizzata e conservati secondo le raccomandazioni del produttore. La miscela di substrato, una volta preparata, e l'aliquota DTT scongelata sono destinate all'uso singolo il giorno del test e non devono essere ricongelate.
5. Colata della resina a scambio ionico
   1. Usa un contenitore trasparente rettangolare appropriato per la preparazione.
   2. Aggiungi circa 250 g (o la quantità desiderata) di resina a scambio ionico in un contenitore grande e lava il prodotto. Lavare aggiungendo acido acetico al 10%; Lascia riposare la sospensione in resina per 10 minuti.
   3. Dopo aver lasciato la sospensione stabilizzarsi per 10 minuti, inclina leggermente e aspira il sovrandante. Lava almeno 5 volte in totale o finché non filtra più colore nel solvente.
   4. Dopo l'ultimo passaggio di lavaggio, aggiungi il 10% di acido acetico in modo che costituisca circa il 50% del volume totale.
   5. Inclina il contenitore in modo che la resina si muova da un lato e stabilizza il contenitore in posizione inclinata. Aspetta ~10 minuti che le fasi si separino.
   6. Posizionare una piastra filtrante da 96 pozzi sopra una piastra profonda 96 pozzi e aggiungere 100 μL di acido acetico al 10% in ciascun pozzo della piastra filtrante da 96 pozzi.
   7. Tagliare le punte usate per la colata della resina a un'altezza di ~1 cm per allargare l'apertura all'estremità e fondere 300 μL di resina a scambio ionico in ciascun pozzo della piastra filtrante a 96 pozzi.
      NOTA: Le punte utilizzate nel nostro lavoro hanno un volume massimo di 1.200 μL e possono essere collegate a pipette multicanale.
   8. Eludi l'acido acetico centrifugandolo in una piastra di pozzo profonda 96 con 100–200 × g in una centrifuga con rotore oscillante per le piastre microtitolate per 1 minuto. Controlla se la resina è distribuita uniformemente sulla placca.
   9. Sigilla il piatto con un foglio impermeabile di plastica e conserva a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
      NOTA: I costituenti della resina a scambio ionico sono noti per influenzare la reazione SK se non vengono rimossi correttamente. Il soprandanante rimosso può essere utilizzato direttamente nella reazione SK (utilizzare 50 μL di campione di sovrantantante, aggiungere 50 μL di cerio e infine 50 μL di soluzione di arsenite) e può essere confrontato con un campione di acido acetico al 10% (controllo a vuoto) per garantire un completo lavaggio dei componenti.
6. Standardizzazione della reazione di Sandell-Kolthoff
   1. Preparare diluizioni di ioduro da una rispettiva fonte di iodio (ad esempio, soluzione standard di iodio) con concentrazioni raccomandate di 1.500, 1.000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 e 1 nM usando uno standard di iodio in_{diH 2}O.
   2. Aggiungere 50 μL di_{diH 2}O puro come controllo e 50 μL delle diluizioni di ioduro preparate su una piastra da 96 pozzi in triplicato, come descritto nella disposizione della Figura 1.
   3. Aggiungi 50 μL di soluzione di cerio da 40 mM a tutti i pozzi e avvia la reazione aggiungendo 50 μL di soluzione di arsenite da 25 mM a tutti i pozzi.
   4. Il prima possibile dopo aver aggiunto la soluzione di arsenite, misurare l'assorbimento utilizzando un lettore di placche a 415 nm (±2 nm) registrando la densità ottica (OD) ogni minuto per 21 minuti, oltre a registrare il diametro esterno iniziale.
   5. Valuta i risultati come descritto nella sezione 4.
      NOTA: Di solito, un background di_{ΔOD 21min} > 0,3 nel controllo_{diH 2}O puro richiederà attenzione e ulteriori indagini sulle cause sottostanti (ad esempio, contaminazione nel lotto As o Ce, bassa qualità dell'acqua).
7. Valutazione dell'attività dei microsomi
   1. Preparare la concentrazione più alta (RI-C8) dell'elemento di riferimento (6-PTU) come descritto nel passo 1.2.
   2. Preparare le sei diluizioni di microsomi come descritto nella Tabella 3 e la miscela di substrato come descritto nella Tabella 1.
   3. Aggiungere 10 μL di diluizione solvente al 10% (v/v) in_{diH 2}O (ad esempio, 10% DMSO in_{diH 2}O) e 10 μL di 10-2 M 6-PTU (RI-C8) in una piastra a 96 pozzi in triplicato, come descritto nella disposizione delle lastre nella Figura 2.
   4. Aggiungere 40 μL di diluizioni microsomali in_{diH 2}O (risultando in 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 e 0 μg di proteina microsomale per pozzo) alla piastra a 96 pozzi come mostrato nella disposizione della placca.
      NOTA: I fornitori tipicamente forniscono la concentrazione stock di proteine microsomali. In caso contrario, potrebbero essere utilizzati metodi standard di quantificazione delle proteine, anche se non li abbiamo applicati in questo studio.
   5. Aggiungi 50 μL di substrato fresco in ogni pozzo e sigilla la piastra con un foglio impermeabile di plastica.
   6. Posizionare la piastra a 96 pozzi su uno shaker in un incubatore (37 °C a 850 giri/min) e incubare per 2 ore.
   7. Dopo il tempo di incubazione, metti il piatto sul ghiaccio per fermare la reazione.
   8. Esegui lo scambio ionico analogo al passo 2.2.
   9. Trasferire quantità appropriate di campione dal pozzo profondo ottenuto nella fase di scambio ionico a una nuova piastra da 96 pozzi per misurare diluzioni non diluite (50 μL di campione), 1:2 (25 μL di campione + 25 μL di acido acetico al 10%) e 1:4 (12,5 μL di campione + 37,5 μL di acido acetico al 10%), mantenendo invariata la disposizione delle placche.
   10. Valutare i risultati come descritto nella sezione 4 e determinare il fattore di diluizione per i campioni nel 10% di acido acetico così come la concentrazione di proteine microsomale che porta comunque ai valori più alti possibili di ΔOD_21min -BG nella reazione di Sandell-Kolthoff senza raggiungere il plateau di saturazione.
       NOTA: Di solito, un rilascio di ioduro di_{ΔOD 21min} > 0,5 è facilmente raggiungibile nelle diluizioni 1:4 o 1:2 di acido acetico dei 20 μg di proteina microsomica per campione di pozzo e di solito varia intorno a un_{ΔOD 21min} di 1. Concentrazioni più elevate di proteine microsomiche non sono raccomandate per l'uso, poiché aumentano il legame di fondo e aspecifico durante il saggio. Si raccomanda di ripetere la misurazione di una serie di diluizione a 6 PTU utilizzando la concentrazione microsomica determinata e il fattore di diluizione per confermare il risultato.
8. Valutazione della solubilità degli item del test
   1. Sciogliere l'oggetto di prova a 100 mM o 200 mg/mL in un solvente adatto (ad esempio DMSO) a temperatura ambiente. Mescola o vortice e controlla la dissoluzione visivamente (microscopio).
   2. Se non è dissoluto, sonica per un massimo di 5 minuti e controlla di nuovo. Se ancora non è sciolto, riscalda a 37 °C per un massimo di 60 minuti e ricontrolla.
   3. Se insolubile, diluire ulteriormente oppure preparare un nuovo calcio a concentrazione più bassa e ripetere la procedura. Se il DMSO non è adatto, prova acqua o etanolo come solventi alternativi.
   4. Una volta dissolto, prepara una diluizione 1:10 in_{diH 2}O (solvente al 10%) e ripeti la valutazione (miscelazione, sonicazione, riscaldamento secondo necessità).
   5. Per simulare le condizioni del saggio, si prepara una diluizione dell'1% dell'oggetto di prova nel tampone del saggio e ripeti il controllo di solubilità.
9. Preparazione degli elementi di prova e localizzazione della distanza
   1. Preparare la soluzione di stock di prova alla concentrazione solubile più alta in un solvente adatto (preferibilmente DMSO), come determinato durante la valutazione della solubilità al passo 1.8.
   2. Per il saggio di misurazione della portata, preparare otto diluizioni degli elementi di prova tramite passaggi consecutivi di diluizione 1:10 (v/v) utilizzando la soluzione standard e il 10% di DMSO in_{diH 2}O.
   3. Eseguire il test di localizzazione della distanza per stimare il profilo inibitorio dell'item di test eseguendo i passaggi descritti nella sezione 2. Se l'item di prova mostra inibizione del ≥25% a qualsiasi concentrazione, si regola l'intervallo di concentrazione per le esecuzioni finali del test includendo almeno tre concentrazioni nell'intervallo di inibizione lineare e due concentrazioni inferiori al 10% IRA, se applicabile.
   4. Se l'item di prova mostra un'inibizione del <25% in tutte le concentrazioni testate, riutilizzare la stessa serie di diluizione per le esecuzioni finali del saggio. In questo caso, il test di rilevamento della distanza può essere considerato uno dei tre test indipendenti richiesti.
      NOTA: Esegui almeno due, idealmente tre, esperimenti indipendenti per ogni oggetto di prova per garantire la riproducibilità e l'affidabilità dei risultati. Se si sceglie un'altra diluizione per coprire meglio l'intervallo di attività, è consentita una deviazione dal rapporto di diluizione 1:10. La soglia del 25% in questa strategia di test (vedi passaggi 1.9.3 e 1.9.4) distingue gli effetti degli item di test dai controlli negativi, tenendo conto della variabilità dell'attività di base e fornendo un margine di sicurezza aggiuntivo. Questa soglia garantisce una classificazione affidabile dei profili inibitori.

Figura 1: Disposizione delle lastre per la curva standard dello ioduro. Questa figura mostra la disposizione delle piastre a 96 pozzi utilizzata per generare la curva standard dello ioduro. I pozzi contengono diluizioni seriali di iodio che vanno da 1 nM a 1.500 nM, oltre a controlli_diH2 solo O.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Disposizione delle piastre per la titolazione delle proteine microsomale e il test degli item di riferimento. Questa figura mostra la disposizione delle piastre a 96 pozzi per la titolazione della proteina microsomale e per i test con inibitori di riferimento (6-PTU). Le file contengono quantità crescenti di proteine microsomale per pozzo, con e senza 6-PTU.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Esecuzione del test DIO1–SK

1. Incubazione del microsoma con oggetto di prova
   1. Preparare l'elemento di riferimento come descritto nel passo 1.2, così come il controllo positivo e negativo, come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4. Preparare gli elementi di test con concentrazioni adeguate seguendo il protocollo descritto nei passaggi 1.8 e 1.9.
   2. Prepara la miscela di substrato come descritto nella Tabella 1 e prepara una sospensione di microsomi nella concentrazione proteica predefinita secondo il passo 1.7, diluendo con cura la soluzione di microsomi scongelata e aliquotata in diH2O. Tieni la sospensione del microsoma sul ghiaccio fino alla necessità dell'incubazione.
   3. Seguendo la disposizione delle lastre mostrate in Figura 3 e Figura 4 (se vengono valutati contemporaneamente più elementi di test), aggiungi 10 μL di concentrazioni di elementi di riferimento, controllo positivo e negativo, controllo solvente (solvente al 10% (v/v) in_{diH 2}O) e concentrazioni di elementi di test ai pozzi.
   4. Aggiungi 40 μL di sospensione a microsomi a tutti i pozzi. Aggiungi 50 μL del substrato appena preparato ai campioni.
   5. Sigilla la piastra con un foglio impermeabile di plastica e posizionala su uno shaker in un incubatore (37 °C a 850 giri/min) per 2 ore; Posiziona la piastra dopo l'incubazione sul ghiaccio per fermare la reazione.
   6. Posiziona il piatto sul ghiaccio dopo l'incubazione per fermare la reazione.
      NOTA: La piastra può essere conservata sul ghiaccio fino alla misurazione per preservare l'integrità del campione. La prima lastra di prova contiene otto concentrazioni dell'oggetto di riferimento, mentre ogni piastra aggiuntiva nello stesso giorno contiene solo la concentrazione più alta dell'oggetto di riferimento, lasciando più spazio per ulteriori elementi di prova se necessario.
2. Separazione tramite piastre filtranti riempite con resina a scambio ionico a 96 pozzi
   1. Posizionare una piastra filtrante preparata con resina a scambio ionico riempita da 96 pozzi, come preparato nel passo 1.5, sopra una piastra di pozzo profonda 96 e aggiungere 150 μL di acido acetico al 10% in ciascun pozzo della piastra filtrante riempita con resina a scambio ionico per bagnare la resina nelle colonne.
   2. Elude l'acido acetico centrifugandolo nella piastra di pozzo usata con profondità 96 e 100–200 × in una centrifuga con rotore oscillante per le piastre microtitolate per 1 minuto.
   3. Sostituire la piastra usata da 96 profondità con una nuova da 96 profondità.
   4. Aggiungere 133 μL di acido acetico al 10% in ciascun pozzo della piastra incubata a 96 pozzi dal passo 2.1.6 e scuotere brevemente la piastra per mescolare le soluzioni.
   5. Trasferire 175 μL dei campioni preparati nella fase precedente sulla piastra filtrante riempita di resina a scambio ionico da 96 pozzi, mantenendo la disposizione iniziale della piastra a piastre stessa.
   6. Far passare i campioni attraverso la resina e nella piastra del pozzo profonda 96 centrifugando (100–200 × g) in una centrifuga con rotore oscillante per le piastre microtitolate per 1 minuto. Rimuovi la piastra filtrante riempita di resina a scambio ionico da 96 pozzi.
      NOTA: La piastra del pozzo profonda 96 con i campioni può essere sigillata con un foglio impermeabile di plastica e conservata a 4 °C per almeno 3 mesi. Ciò consente ulteriori misurazioni in caso di errori manuali/tecnici o cambiamenti del fattore di diluizione nella reazione o misurazione di Sandell-Kolthoff nei giorni successivi.
3. Reazione Sandell-Kolthoff
   1. A seconda del fattore di diluizione determinato dei campioni in acido acetico al 10% per il lotto di microsomi utilizzato (vedi passo 1.7), aggiungere 50 μL del campione non diluito o adeguatamente diluito a una nuova piastra da 96 pozzi.
   2. Aggiungere 50 μL di soluzione di cerio da 40 mM (preparata come descritto nella Tabella 1) a tutti i pozzi e avviare la reazione aggiungendo 50 μL di soluzione di arsenite da 25 mM (preparata come descritto nella Tabella 1) a tutti i pozzi.
   3. Non appena possibile dopo l'aggiunta della soluzione di arsenite, misurare l'assorbimento utilizzando un lettore di piastre a 415 nm (±2 nm) registrando la densità ottica (OD) ogni minuto per 21 minuti, oltre a registrare il diametro diametrale iniziale.

Figura 3: Disposizione delle piastre per il test parallelo di due elementi di test. Disposizione delle piastre a 96 pozzi per testare due elementi di prova in triplicata su più concentrazioni, insieme a repliche di controlli negativi, positivi, solventi e dell'item di riferimento. Usato come prima piastra di analisi della giornata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Disposizione delle piastre per il test parallelo di tre elementi di prova. Disposizione a piastre a 96 pozzi per testare tre elementi di prova in triplicata su più concentrazioni, con repliche di controlli negativi, positivi e solventi. L'oggetto di riferimento è incluso solo nella sua concentrazione più alta, poiché viene completamente testato sulla prima lastra (vedi Figura 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Test per interferenze (microsomi ± e ± DTT)

1. Preparare la concentrazione più alta (RI C8) dell'elemento di riferimento (6 PTU) come descritto nel passo 1.2 e preparare la soluzione e le diluizioni di stock dell'item di prova (inclusa la concentrazione massima dell'item di prova).
2. Preparare la sospensione dei microsomi alla concentrazione definita per pozzo (vedi passo 1.7) diluendo microsomi accuratamente scongelati e quotati in_{diH 2O}. Mantenere la sospensione dei microsomi sul ghiaccio fino all'utilizzo.
3. Prepara due miscele di substrati: la miscela standard con DTT come descritto nella Tabella 1, e una miscela di substrato altrimenti identica senza DTT (omettendo solo la DTT).
4. Dispensare nei pozzi designati di una piastra da 96 pozzi secondo la Figura 5: 10 μL di RI C8, 10 μL di DMSO al 10% (v/v) in_{diH 2}O (controllo del solvente) e 10 μL di ciascuna diluizione dell'item di prova.
5. Aggiungere 40 μL di sospensione a microsomi ai pozzi designati "con microsomi" e 40 μL di_{diH 2}O ai pozzi designati "senza microsomi", secondo la Figura 5.
6. Sul ghiaccio, aggiungere 50 μL di miscela di substrato con DTT ai pozzi designati "con DTT" e 50 μL della miscela senza DTT ai pozzi designati "senza DTT" (Figura 5).
7. Sigilla la piastra con un foglio impermeabile di plastica e incuba su uno shaker in un incubatore (37 °C, 850 rpm) per 2 ore.
8. Dopo l'incubazione, posiziona il piatto sul ghiaccio per fermare la reazione.
9. Eseguire separazione dello scambio ionico e quantificazione dello ioduro tramite la reazione SK come descritto nei passaggi 2.2 e 2.3, e valutare i risultati come descritto nella Sezione 4.
   NOTA: Questa configurazione a singola placca (Figura 5) testa la concentrazione più alta di elementi di test in parallelo con rispetto a non microsomi e con rispetto a senza DTT per distinguere l'attività enzimatica DIO1 dagli artefatti del saggio. Un aumento dell'IRA del ≥20% in pozzi senza microsomi indica interferenze SK (rilascio/lettura di iodio indipendente da DIO1), e la sostanza è classificata come "non applicabile nel saggio SK DIO1" ed esclusa dall'analisi. Le differenze tra condizioni DTT e senza DTT aiutano a identificare il rilascio di ioduro dipendente dalla DTT come meccanismo di interferenza aggiuntivo.

Figura 5: Disposizione delle placche per i test di interferenza. Questa figura mostra la disposizione delle piastre a 96 pozzi per i test di interferenza, dove elementi di test, item di riferimento e controllo solvente vengono testati sia con che senza microsomi in presenza di DTT così come senza microsomi e senza la presenza di DTT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Valutazione dei dati

1. Valutazione dell'attività DIO1
   1. Determinare i valori_{ΔOD 21min} sottraendo i valori 21 min di tutti i campioni dai valori iniziali misurati (0 min):
      
   2. Determinare i valori ΔOD-BG sottraendo la media dei valori_{ΔOD 21min} dei controlli inibiti 10 3 M 6-PTU (RI) dai valori_{ΔOD 21min} di tutti i campioni:
      
   3. Normalizzare i valori dell'item di prova ai rispettivi valori di controllo del solvente dividendo l'elemento/i (TI) ΔOD_{21min-BG TI} valori per la media dei valori_{ΔOD 21min} -_BG SC del rispettivo controllo solvente (SC), generando valori di attività di rilascio di ioduro (IRA) in %.
      
   4. Traccia i valori IRA delle diverse concentrazioni degli elementi di prova in un pacchetto software di statistica, con i valori IRA sull'asse y (lineare) e le concentrazioni degli item di prova sull'asse x (logaritmico).
   5. Utilizzare un algoritmo di adattamento a curve per visualizzare una relazione concentrazione-risposta (ad esempio, "[Inibitore] versus risposta -- pendenza variabile (quattro parametri)" nel software statistico preferito. "Alto" rappresenta la risposta massima, "Sotto" rappresenta la risposta più bassa, e "HillSlope" descrive la ripida della curva:
      
   6. Determinare l'IC₅₀ dell'item di riferimento e, se applicabile, dell'item di test.
   7. Calcola il coefficiente di varianza (CV) della stima log IC₅₀ dell'elemento di riferimento in %:
      
   8. Calcola l'IRA del controllo negativo normalizzato al controllo del solvente in %:
      
   9. Calcola l'IRA del controllo positivo normalizzato al controllo del solvente in percentuale:
      
   10. Calcola il fattore z:
       
   11. Per verificare la validità dell'esperimento, confrontare i valori calcolati con i criteri di accettazione nella Tabella 4.
       NOTA: Tutti i criteri devono essere raggiunti per ottenere una prova valida del test.
   12. Classificare gli elementi del test come inibitori completi, parziali o non inibitori in base alla loro massima inibizione e ai valori IC₅₀ , come riassunto nella Tabella 5.

Risultati

La Figura 6 offre una panoramica del flusso di lavoro del saggio DIO1-SK e dei principali passaggi di standardizzazione necessari per stabilire con successo il metodo in laboratorio. Il flusso di lavoro (Figura 6A) riassume le fasi sequenziali del saggio, inclusa l'uso di microsomi epatici umani, l'incubazione con item di test e controlli, l'estrazione dello ioduro tramite separazione a scambio ionico e la quantificazione colorimetrica dello ioduro tramite la reazione di Sandell–Kolthoff (SK). La Figura 6B evidenzia la strategia di standardizzazione che sostiene prestazioni robuste e risultati validi, inclusi (i) la standardizzazione della reazione SK, (ii) il test dell'attività microsomica specifica per lotto, (iii) la valutazione della solubilità e il test di interferenza, (iv) un saggio di misurazione della distanza e (v) l'aggiustamento delle concentrazioni degli elementi di prova basandosi sulla prima esecuzione valida del saggio.

Un elemento centrale di questa strategia è il test microsomale specifico per lotto, poiché i lotti di microsomi epatici umani possono differire sostanzialmente nell'attività di deiodinazione rT3, rendendo necessario determinare una concentrazione enzimatica appropriata per ogni nuovo lotto prima dei test di routine delle sostanze.

Questa strategia di test a stadi è fondamentale per l'implementazione: solo dopo che le prestazioni di base del saggio (controlli, comportamento di reazione SK e attività dei microsomi) sono state verificate e le condizioni del test sono state standardizzate possono essere attese a produrre profili di inibizione validi e interpretabili.

Figura 6: Flusso di lavoro e passaggi di standardizzazione del test SK DIO1. (A) Il flusso di lavoro illustra l'uso dei microsomi epatici umani, la configurazione della piastra a 96 pozzi, l'incubazione con item di prova e controlli, l'estrazione dello ioduro e la quantificazione colorimetrica tramite la reazione SK. Ogni passaggio è rappresentato in sequenza per evidenziare le fasi principali del saggio. (B) I passaggi di standardizzazione includono la standardizzazione della reazione di Sandell-Kolthoff, il test di attività microsomica specifica per lotto, la valutazione della solubilità e il test di interferenza, il test di misurazione della distanza e l'aggiustamento delle concentrazioni degli elementi di prova basandosi sulla prima esecuzione valida del saggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Basandosi sul flusso di lavoro e sul quadro di standardizzazione mostrato nella Figura 6, la Figura 7 illustra come i laboratori determinino una concentrazione microsomale proteica appropriata (e diluizione post-scambio ionico) per ottenere un intervallo dinamico sufficiente mantenendo al contempo una risposta di inibizione sigmoidale per l'inibitore di riferimento. Nella Figura 7A, la ΔOD21min-BG aumenta con l'aumento della proteina microsomica e dipende dalla diluizione post-scambio ionico (non diluita, 1:2, 1:4). La diluizione che produce il più alto ΔOD21min-BG mantenendo una risposta sigmoidale viene selezionata per gli esperimenti successivi (esempio mostrato: diluizione 1:2). Nella Figura 7B, le curve di inibizione 6-PTU vengono confrontate tra quantità microsomiche di proteine per identificare la concentrazione proteica più bassa che comunque produce una curva sigmoidale (esempio mostrato: 5 μg di proteina/pozzo), bilanciando così sensibilità con il fondo.

È importante sottolineare che questo passaggio di ottimizzazione deve essere eseguito da ciascun laboratorio durante l'implementazione del metodo, poiché la concentrazione proteica richiesta dipende dall'attività del lotto microsomico utilizzato, rendendo necessaria la standardizzazione specifica per lotto della concentrazione enzimatica.

Figura 7: Attività microsomica e inibizione da 6-PTU. (A) Il grafico mostra l'aumento dell'attività mentre il segnale di Sandell-Kolthoff corretto sul fondo (BG) (_{ΔOD 21 min} n-BG) con quantità crescenti di proteina microsomica per pozzo (log10[μg proteina/pozzo]), testato a diluizioni non diluite, 1:2 e 1:4. La diluizione più alta con il valore_{ΔOD 21 min}–BG più alto, così come con una forma sigmoide, sarà utilizzata per esperimenti futuri. In questo caso, si tratta della diluizione 1:2. (B) Curva concentrazione-risposta dell'inibitore di riferimento 6-propil-2-tiouracilo (6-PTU) che mostra l'attività di rilascio di iodio (IRA in %) tracciata rispetto a log10[concentrazione (M)] a diversi carichi proteici microsomici (5, 7,5 e 10 μg proteina/pozzo). I valori IRA sono normalizzati al controllo del solvente. I punti dati di entrambi i grafici rappresentano la media ± SD di tre repliche tecniche (pozzi) per condizione da un test rappresentativo di attività microsomica. Le curve sono state regolate tramite regressione non lineare utilizzando un modello logistico a quattro parametri ("pendenza variabile") (inibitore vs. risposta). La concentrazione proteica più piccola con curva sigmoidale sarà utilizzata per esperimenti futuri; In questo caso, 5 μg/pozzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una volta completati i passaggi di flusso di lavoro e standardizzazione (Figura 6) e stabilita una concentrazione microsomica appropriata per il lotto di microsomi selezionato (Figura 7), i parametri principali del test sono in atto per procedere con i test di routine delle sostanze. In questa fase, gli elementi di prova possono essere valutati insieme al set di controllo della lastra (elemento di riferimento, controllo del solvente e controlli positivi/negativi) nel formato standardizzato della piastra a piatta, consentendo una normalizzazione robusta e un'interpretazione coerente dei profili di inibizione.

La Figura 8 dimostra la discriminazione del saggio basata sul comportamento concentrazione–risposta nell'attività di rilascio di ioduro (IRA). L'inibitore di riferimento 6-PTU (Figura 8A) mostra una diminuzione dell'IRA dipendente dalla concentrazione, fornendo il profilo di inibizione sigmoidale atteso, come previsto per la verifica delle prestazioni del saggio. L'acido tannico (Figura 8B) mostra un profilo inibitorio comparabile a quello dell'inibitore di riferimento (inibizione massima > 90%) nelle condizioni mostrate. Le tre concentrazioni più alte della sostanza testata hanno mostrato valori IRA negativi. I valori IRA <0% non riflettono un 'rilascio negativo di iodio' biologicamente significativo, ma derivano dalla procedura di calcolo (sottrazione di fondo e normalizzazione al controllo del solvente), che può propagare piccole fluttuazioni nel controllo del solvente in valori normalizzati negativi. Di conseguenza, i valori IRA inferiori allo 0% sono considerati equivalenti allo 0% (baseline) per l'interpretazione dei risultati. Il dibutilftalato (Figura 8C) non mostra inibizione (inibizione massima inferiore al 25%) nell'intervallo di concentrazione testato, rappresentando un profilo non inibitore. Insieme, questi profili illustrano che il saggio può differenziare il comportamento inibitorio da quello non inibitorio in condizioni standardizzate. Il sistema di test può anche identificare inibitori parziali, che mostrano livelli massimi di inibizione tra il 25% e il 90% (dati non mostrati). Ulteriori dettagli su come queste sono categorizzate si trovano nella Tabella 5.

Figura 8: Il comportamento dose-risposta del saggio DIO1–SK distingue gli inibitori dai non inibitori. Le curve dose-risposta mostrano l'attività di rilascio di ioduro (IRA in %) rappresentata rispetto alla concentrazione log10 (M) per (A) l'inibitore di riferimento 6-PTU, (B) un inibitore rappresentativo (acido tannico) e (C) un non-inibitore rappresentativo (ftalato di dibutil). I valori IRA sono stati calcolati dopo sottrazione di background e normalizzati al controllo del solvente. I simboli rappresentano la media ± SD (n = 3) di un esperimento indipendente, ciascuno eseguito con tre repliche tecniche (pozzi) per concentrazione. Le curve sono state regolate tramite regressione non lineare utilizzando un modello logistico a quattro parametri ("pendenza variabile") (inibitore vs. risposta). I valori IRA inferiori allo 0% sono considerati equivalenti allo 0% (baseline) per l'interpretazione dei risultati. Questi dati dimostrano che il test fornisce un profilo di inibizione sigmoidale per l'inibitore di riferimento e può confermare se una curva concentrazione-risposta sia inibitoria o non in condizioni standardizzate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In un test valido, i controlli con solvente (SC) mostrano una chiara separazione del segnale_{ΔOD 21 minuti} dalla condizione di riferimento completamente inibita (6-PTU, RI-C8). In un dataset di esempio (10 corse indipendenti), ogni piastra includeva n = 9 repliche tecniche per SC e il riferimento completamente inibito (6-PTU a 10⁻³ M). Tra le lastre, i valori medi SC ΔOD_21min della placca variavano da 1,383 a 1,819 (media ± DS: 1,565 ± 0,114), mentre i valori medi ΔOD_{della placca a 21} minuti per la condizione inibita di 6-PTU variavano da 0,258 a 0,771 (media ± SD: 0,473 ± 0,087). Il calcolo di ΔOD in questo saggio si basa sulla differenza tra OD_0min e OD_21min, e la validità del saggio è comunemente supportata da una soglia di fattore z di >0,5.

In 10 esecuzioni di test indipendenti, la 6-PTU ha prodotto una curva sigmoidale concentrazione-risposta con valori IC₅₀ variabili da 1,20E-06 M a 5,02E-06 M (media ± SD: 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). I criteri di accettazione per i valori IC₅₀ nell'intervallo di riferimento da 1.00E-06 a 1.00E-05 si basano su dati di precedenti studi di validazione. Tuttavia, i valori di IC₅₀ sono significativamente influenzati dal lotto specifico di microsomi utilizzato e possono mostrare una notevole variabilità. Tuttavia, si prevede che queste variazioni rimangano allo stesso ordine di grandezza.

La qualità del saggio può essere riassunta usando il fattore z′, che riflette sia la finestra del segnale sia la variabilità dei controlli. Nel dataset descritto, sei curve di riferimento erano associate a fattori z′ variabili da 0,544 a 0,774 (media ± SD: 0,658 ± 0,062), coerenti con l'obiettivo di accettazione comunemente usato di z′ > 0,5.

In pratica, le corse subottimali possono essere identificate da deviazioni nel background del saggio e/o dal mancato rispetto dei criteri di accettazione predefiniti. Ad esempio, un alto background nella reazione di Sandell-Kolthoff è indicato quando il diH₂O puro mostra ΔOD > 0,3, il che richiede un'indagine (ad esempio, contaminazione da reagenti o problemi di qualità dell'acqua). Tali aumenti di fondo possono ridurre l'intervallo dinamico del saggio e aumentare la variabilità del controllo, contribuendo così a criteri di accettazione falliti, incluso un fattore z sotto 0,5. I pozzi che mostrano artefatti tecnici evidenti (ad esempio, precipitazioni o decolorazioni anomale) sono esclusi come valori anomali dalla valutazione. Anche i valori anomali determinati tramite test di diagramma a scatola sono esclusi. Se i criteri di accettazione non vengono soddisfatti dopo la rimozione degli outlier, l'esecuzione del saggio è considerata non valida e deve essere ripetuta.

Reagente/Buffer	Informazioni sulla preparazione
Soluzione acida di ammonio e cerio (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 M H2SO4) (250 mL)	Aggiungi 6,32 g di (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O e 125 mL di diH2O in una fiaschetta volumetrica da 250 mL. Aggiungi 125 mL 1 M H2SO4 per raggiungere un volume finale di 250 mL. Conserva a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
DTT (Aliquote di 1 M)	Aliquota è una soluzione di 1 M DTT in H2O come aliquota di 0,5 mL in tubi microcentrifughe da 1,5 mL e conservata a -20°C per un massimo di 6 mesi.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) tampone (pH 7,0)	Utilizzando una fiaschetta volumetrica da 250 mL, aggiungi 12,5 mL di soluzione 1 M HEPES, 201 mg di acido etilendediaminatetraacetico (EDTA) e riempi fino a 250 mL con diH2O. Conserva a 4°C per un massimo di 3 mesi.
Soluzione rT3 ("tubi di miscela di substrato")	Dissolvere rT3 in DMSO fino a una concentrazione finale di 6 mM, aliquotare le rT3 in porzioni da 10 μL in tubi centrifughe da 15 mL e conservarle a -20°C per un massimo di 6 mesi.
Soluzione di arsenite di sodio (25 mM NaAsO2, 0,8 M NaCl, 0,5 M H2SO4) (250 ml)	Aggiungi 0,81 g di NaAsO2, 11,7 g di NaCl e 125 mL di diH2O a una fiaschetta volumetrica da 250 mL. Aggiungi 125 mL 1 M H2SO4 per raggiungere un volume finale di 250 mL. Conserva a temperatura ambiente fino a 6 mesi.

Tabella 1: Preparazione di tamponi e reagenti. Questa tabella dettaglia i passaggi di preparazione e le istruzioni di stoccaggio per tutti i tamponi e le soluzioni stock utilizzate nel test DIO1 SK, inclusi il tampone HEPES/EDTA, la DTT, la soluzione rT3, la soluzione acida di ammonio cerio e la soluzione di arsenite di sodio.

Nome della diluizione dell'oggetto di riferimento	Concentrazione di diluizione dell'elemento di riferimento [M]	10% DMSO [μL]	Elemento di riferimento	Concentrazione finale dell'elemento di riferimento nel saggio [M]
RI-C8	1.00E-02	450	50 μL di soluzione di stock di riferimento 10-1 M	1.00E-03
RI-C7	1.00E-03	450	50 μL di RI-C8	1.00E-04
RI-C6	1.00E-04	450	50 μL di RI-C7	1.00E-05
RI-C5	3.16E-05	342	158 μL di RI-C6	3.16E-06
RI-C4	1.00E-05	450	50 μL di RI-C6	1.00E-06
RI-C3	3.16E-06	450	50 μL di RI-C5	3.16E-07
RI-C2	1.00E-06	450	50 μL di RI-C4	1.00E-07
RI-C1	1.00E-07	450	50 μL di RI-C2	1.00E-08

Tabella 2: Preparazione delle diluizioni degli elementi di riferimento. Questa tabella riassume la preparazione delle diluizioni seriali per l'elemento di riferimento (6-PTU), includendo concentrazioni, volumi di DMSO e concentrazioni finali utilizzate nel saggio.

Microsoma per pozzo [μg]	diH2O [μL]	Diluizione dei microsomi [μL]	Concentrazione finale di enzima nel saggio [μg/mL]
20	780	20 μL di soluzione di microsoma da 20 mg/mL	200
10	400	400 μL di diluizione di 20 μg microsoma per pozzo	100
5	400	400 μL di 10 μg di microsoma per diluizione	50
2.5	400	400 μL di 5 μg di microsoma per diluizione	25
1.25	400	400 μL di 2,5 μg di microsoma per diluizione	12.5
0.68	400	400 μL di 1,25 μg di microsoma per diluizione	6.8

Tabella 3: Preparazione delle diluizioni dei microsomi. Questa tabella fornisce lo schema di diluizione per la proteina microsomale per ogni pozzo, inclusi i volumi richiesti di diH₂O e la soluzione di microsoma stock per ottenere le concentrazioni finali di proteine microsomale per il saggio.

Criteri di accettazione	Valore di soglia suggerito
Numerico
IC50 dell'articolo di riferimento [M]	1*10-05 - 1*10-06
CV del log IC50 stima dell'elemento di riferimento [%]	< 3
Controllo negativo IRA [%]	80 - 120
Controllo positivo IRA [%]	20 <
Z'-Factor	> 0,5
Binario
Forma dell'oggetto di riferimento (sigmoidale?)	Sì
La curva concentrazione-risposta finale dell'item di riferimento è composta da almeno sei concentrazioni da tre repliche	Sì
La curva finale concentrazione-risposta dell'item di prova è composta da almeno sei concentrazioni da tre repliche	Sì

Tabella 4: Criteri di accettazione per il test DIO1 SK. Questa tabella elenca i criteri di accettazione per la validità del saggio come l'intervallo IC₅₀, il coefficiente di variazione, i valori IRA per i controlli, il fattore z e i requisiti per le curve concentrazione-risposta. Le finestre di accettazione sono state derivate da studi di validazione DIO1-SK precedentemente^{riportati 6}, inclusa una valutazione di riproducibilità basata su cinque esecuzioni indipendenti che hanno informato la finestra di riferimento IC₅₀. In un dataset di esempio di 10 run indipendenti, le prestazioni z′-factor variavano da 0,544 a 0,774 (media ± SD: 0,658 ± 0,062), supportando la soglia di accettazione z′ usata qui.

Categoria (per efficacia)	Sottocategoria (per potenza)	Attività inibitoria	Soglia
Categoria 1: inibitore completo	R: Inibitore completo potente	Inibisce completamente l'attività di DIO1 a una concentrazione comparabile all'item di riferimento 6-PTU	Inibizione massima maggiore del 90% e IC50 al limite superiore o inferiore dell'IC50 di 6-PTU
	B: Inibitore completo debole	Inibisce completamente l'attività di DIO1 a concentrazioni più elevate rispetto all'item di riferimento 6-PTU	Inibizione massima maggiore del 90% e IC50 sopra il range superiore IC50 del 6-PTU
Categoria 2: inibitore parziale	-	Nessuna inibizione completa, ma superiore al controllo negativo e solvente	Inibizione massima tra il 25% e il 90%
Categoria 3: non inibitore	-	Non inibisce DIO1 (come il controllo negativo e solvente)	Inibizione massima sotto il 25%

Tabella 5: Classificazione degli elementi di prova basata sulla potenza e l'efficacia dell'inibizione di DIO1. Gli item del test sono suddivisi in tre gruppi di efficacia (pieno, parziale o non inibitore) in base alla massima inibizione dell'attività DIO1. Gli inibitori completi sono ulteriormente sottocategorizzati in base alla potenza, a seconda del loro IC₅₀ rispetto all'item di riferimento 6-PTU.

Discussione

Il saggio DIO1-SK offre un'alternativa non radioattiva, economica e scalabile ai metodi tradizionali per valutare l'attività DIO1, come i saggi radiomarcati o la spettrometria di massa. La sua preconvalidazione per i microsomi epatici umani e la forte concordanza con le misurazioni SPE-LC-MS/MS dei livelli di ormoni tiroidei confermano la sua affidabilità e rilevanza regolatoria, come dimostrato dalla sua inclusione nel piano di lavoro delle linee guida OCSE. La semplicità della reazione Sandell-Kolthoff (SK) rende il saggio accessibile ai laboratori senza strumenti avanzati.

Nel protocollo attuale, diversi aspetti pratici sono stati specificati in modo più dettagliato rispetto alle procedure DIO1-SK precedentemente pubblicate per supportare ulteriormente robustezza e riproducibilità in un formato di routine a 96 pozzi. Queste chiarimenti si concentrano sulla logica del concetto di controllo (controlli solventi, negativi e positivi), sulla decisione di utilizzare lastre di resina a scambio ionico appena preparate invece di riutilizzare piastre già fuse, e sulle condizioni di reazione SK che migliorano la robustezza della maneggevolezza nelle misurazioni a piastre multi-pozzo, mantenendo l'interpretazione biologica coerente con il lavoro di standardizzazione^{precedente 6,7}.

Nonostante i suoi punti di forza, devono essere affrontati diversi passaggi critici per quantificare accuratamente lo ioduro rilasciato durante la conversione mediata da DIO1 di rT3 in T2. Questo si ottiene tramite la reazione di Sandell-Kolthoff, che richiede tempi precisi e una gestione costante dei reagenti per garantire la riproducibilità. La reazione SK è un processo catalitico rapido in cui lo ioduro accelera la riduzione del cerio giallo (IV) in cerio incolore (III) tramite arsenite; La velocità di cambiamento del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione di iodio. Poiché la reazione procede rapidamente una volta aggiunta la soluzione di arsenico, è essenziale che la misurazione venga avviata senza ritardo. In un formato a piastre a 96 pozzi, l'aggiunta lenta o incoerente della soluzione di arsenico può introdurre una significativa variabilità tra i pozzi. Pertanto, è fortemente raccomandato l'uso di una pipetta multicanale o di un distributore automatico per garantire un'aggiunta uniforme e rapida di reagenti su tutti i pozzi.

Per massimizzare la comparabilità tra pozzi e tra lastre, l'ordine di aggiunta del reagente nella reazione SK dovrebbe essere mantenuto coerente con il flusso di lavoro descritto: il cerio è presente come substrato cromogenico, e la reazione è avviata tramite l'aggiunta di arsenite, che definisce il tempo di inizio e quindi richiede una distribuzione rapida e sincronizzata. Gli ordini alternativi di aggiunta di reagenti non venivano valutati in questa configurazione; Pertanto, non è consigliato cambiare l'ordine durante la riproduzione del protocollo. Inoltre, la concentrazione di cerio può influenzare le caratteristiche pratiche di prestazione della lettura SK (ad esempio, finestra del segnale e robustezza). Mentre 25 mM di cerio era definito come condizione standard validata durante la precedente standardizzazione dei saggi, concentrazioni più elevate come 40 mM hanno dimostrato di aumentare la finestra del segnale e il fattore z′ senza influire sui valori IC₅₀ o sull'interpretazione biologica, come già descritto in lavori^{precedenti 6}. In questo protocollo, 40 mM di cerio viene utilizzato per garantire una complesazione completa e rapida dello ioduro nelle condizioni di prova e per migliorare la robustezza e la stabilità del segnale nelle misurazioni di routine basate su placche. I criteri di accettazione (ad esempio, fattore z, valori IC₅₀ dell'inibitore di riferimento) si basano sulle prestazioni storiche osservate in precedenti studi di validazione e sono pensati come un controllo di routine delle prestazioni del saggio.

L'uso di microsomi epatici umani introduce variabilità biologica, rendendo essenziale la standardizzazione dell'attività di rilascio di iodio specifica per lotti di microsomi. È necessaria un'attenta preparazione delle piastre filtranti riempite di resina a scambio ionico per evitare una distribuzione disomogenea della resina lungo la piastra filtrante e per garantire la completa separazione dello ioduro dalle sostanze potenzialmente interferenti. Per quanto riguarda il flusso di lavoro della resina, sono state scelte piastre filtranti riempite con resina a scambio ionico appena colate per minimizzare il rischio potenziale di variabilità aggiuntiva derivante dalla saturazione della resina, dal trasferimento di iodio o proteine, e dalla potenziale perdita di efficienza del legame al riutilizzo. Il riutilizzo di resina e piastre filtranti è tecnicamente fattibile, tuttavia potrebbe comportare alcuni rischi che non sono stati valutati sistematicamente in questo studio. Può introdurre deriva da batch a batch se la capacità di legame della resina è ridotta o se i componenti residui della matrice rimangono nel letto di resina dopo le passate riprese. Per i laboratori che stanno considerando il riciclo, una raccomandazione pragmatica è validare le prestazioni della resina dopo il riutilizzo (ad esempio, monitorando il comportamento di fondo e delle curve standard e garantendo una cattura coerente dello ioduro) e interrompere il riutilizzo se si osserva un aumento del fondo, una riduzione dell'intervallo dinamico o una separazione incoerente. Si raccomanda di utilizzare piastre filtranti riempite di resina per uso singolo, poiché questo protocollo è stato sviluppato specificamente sulla base di questa metodologia.

Inoltre, la solubilità di ciascun elemento di prova deve essere determinata in un veicolo appropriato, poiché la concentrazione massima testata è limitata dalla solubilità (tipicamente fino a 1 mM con 1% di DMSO). Poiché tutti i composti di prova sono applicati in DMSO come solvente, il controllo del solvente definisce l'attività di base di DIO1 in condizioni rilevanti per l'analisi e funge da condizione di riferimento più appropriata per la normalizzazione e il confronto. Al contrario, il sale sodio 1-tio-β-D-glucosio è stato incluso come controllo negativo perché è strutturalmente simile all'aurothioglucosio di controllo positivo (ATG) ma chimicamente inerte rispetto alla deiodinazione di iodotironina e non interferisce con i sistemi redox microsomali o l'attività catalitica della DIO1. La sua inclusione aiuta a distinguere i veri effetti specifici di DIO1 da quelli non specifici legati all'aggiunta di composti, alla gestione o alle interazioni con la matrice del saggio. Un controllo senza trattamento/senza veicolo non è stato utilizzato come condizione di riferimento primaria perché non rifletterebbe l'ambiente effettivo di analisi in cui il DMSO è presente in tutti i pozzi trattati con composti; Pertanto, il controllo del solvente è la base rilevante per l'interpretazione del saggio.

La risoluzione dei problemi si concentra sull'identificazione delle interferenze nella reazione SK. Sostanze contenenti iodio, chelanti o fortemente ossidanti possono influenzare artificialmente la lettura^{colorimetrica} 14,17,18. Per affrontare questo problema, il protocollo include test di interferenza senza microsome. Inoltre, l'uso del ditiotreitolo (DTT) come cofattore può anche portare al rilascio di ioduro non enzimatico da alcune sostanze test. In tali casi, si raccomandano metodi ortogonali come SPE-LC-MS/MS per confermare l'inibizione di DIO1. Interferenze non specifiche tramite effetti generali di denaturazione (ad esempio, tensioattivi) possono generare falsi positivi, quindi una strategia generale per identificare i colpiti frequenti, utilizzando strumenti in silico o approcci di test integrati, può essere preziosa.

Il saggio presenta diverse limitazioni. È suscettibile all'interferenza di sostanze di prova che reagiscono con i componenti del saggio o rilasciano iodio indipendentemente dall'attività DIO1. Il test non distingue tra inibizione specifica di DIO1 e interferenza non specifica con la funzione enzimatica o l'integrità strutturale. Per migliorarne la specificità, l'inibizione di ulteriori enzimi microsomici può essere analizzata in parallelo, e confrontare le potenze inibitorie tra diversi saghi enzimatici, potrebbe fornire ulteriori prove.

Un'ulteriore strategia per identificare possibili artefatti è includere test di integrità o di vitalità, come comunemente eseguiti nei test in vitro basati su cellule, per definire la concentrazione massima di test. Sebbene manchi un test diretto di integrità per il saggio DIO1-SK, il suo utilizzo all'interno di una batteria di test in vitro consente l'integrazione di dati di citotossicità da altri saghi cellulari per informare la selezione delle concentrazioni. Se tali informazioni di analisi incrociate non sono disponibili, la concentrazione superiore nel saggio DIO1-SK è limitata dalla solubilità, che potrebbe non riflettere le esposizioni in vivo rilevanti. Tuttavia, gli approcci tossicocinetici possono essere utilizzati per definire e interpretare meglio le concentrazioni dei test in vitro.

Il saggio DIO1-SK è particolarmente utile nello screening tossicologico e negli studi meccanicistici di disturbo endocrino. Affronta un evento chiave nell'omeostasi dell'ormone tiroideo e può essere integrato nelle batterie di test in vitro. La sua robustezza, riproducibilità e adattabilità a diversi contesti di laboratorio e esigenze di produzione lo rendono uno strumento prezioso per la valutazione della sicurezza chimica e la validazione normativa. Il saggio fornisce una misura robusta in vitro dell'inibizione di DIO1 in condizioni standardizzate e supporta la classificazione delle sostanze di prova rispetto a un inibitore di riferimento ben caratterizzato (6-PTU). Tuttavia, i dati in vivo sull'inibizione della DIO1 sono scarsi e la correlazione diretta tra gli esiti di inibizione in vitro e gli effetti in vivo non è quindi attualmente applicabile per stimare la predittività in vivo. Di conseguenza, i risultati dei test devono essere interpretati come prove meccanicistiche di interferenza con un evento chiave nel metabolismo dell'ormone tiroideo e integrati con ulteriori linee di evidenza (ad esempio, altri saggi MoA tiroidei e misurazioni ortogonali dove necessario). È importante sottolineare che il saggio DIO1–SK è stato valutato in molteplici studi orientati alla validazione (ottimizzazione/standardizzazione, valutazione della predittività e analisi di robustezza/accuratezza^)6,7,15, e man mano che il metodo avanza verso l'implementazione OCSE, il presente articolo fornisce un livello di dettaglio procedurale passo dopo passo volto a facilitare il trasferimento e l'implementazione coerente tra ulteriori laboratori.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-Tio-β-D-glucosio sale sodico	Sigma-Aldrich	T6375-1G	CAS 10593-29-0
3,3',5'-triiodotironina (rT3)	Santa Cruz Biotecnologia	SC-209692	CAS 5817-39-0
6-Propoli-2-tioracele (6PTU)	Supelco	P3755-10G	CAS 51-52-5
Acido acetico	Thermo Fisher	9526-33	CAS 64-19-7
Bilanciamento analitico	NA	NA	Capace di pesare con precisione fino a 30 g con leggibilità di 0,1 mg
Ossido di sodio di arsenico (NaAsO2)	Thermo Fisher	041533.AP	CAS 7784-46-5
Lastre di prova (formato a 96 pozzi)	Merck	Z707902-108EA	ad esempio piastre di coltura tissutale, piastra a 96 pozzi, fondo piatto, polistirene, 0,34 cm2, sterile, 108/cs, TPP
Aurothioglucosio (ATG)	Sigma-Aldrich	A0606-5MG	CAS 12192-57-3
Tubi centrifughe 15 e 50  mL	Merck	Z707724-800EA, Z707716-320EA	ad esempio tubi centrifughe TPP, volumi 15 e 50 mL, polipropilene
Centrifuga con rotore oscillante per piastre microtitolate	NA	NA	Dovrebbe essere abbastanza alta da poter entrare una piastra di pozzo profonda 96 con una piastra filtrante da 96 pozzi sopra (almeno circa 6 cm di altezza).
Solfato di ammonio di cerio (IV) (Ce(NH4)4(SO4)4)	Sigma-Aldrich	22269-100G-F	CAS 10378-47-9
Incubatore CO2	NA	NA	in grado di mantenere temperature di 37°C; C, 5% di CO2 e ≥ 90% di umidità
Piastre a pozzi profondi (formato a 96 pozzi)	Supelco	575653-U	ad esempio SPE 96-Piastra di raccolta del pozzo quadrato profondo, volume del pozzo 2 mL, polipropilene
Dimetilsolossido (DMSO)	AppliChem	A3672.0250	CAS 67-68-5
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779-1G	CAS 3483-12-3
Etilediamimina, acido tetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	APO456787707-500G	CAS 6381-92-6
Piastre filtranti (formato 96 pozzi)	Merck	WHA77002810	ad esempio Micro-Plates, 96-pozzi, polistirene trasparente, 800 & micro; L, Legare il DNA, Whatman
Sigillanti a piastra a tenuta di gas	Thermo Fisher	232698	ad esempio: nastro sigillante, poliestere, sterile, nastro sigillante, poliestere, sterile, Nunc
HEPES	Pan Biotech	P05-01100	CAS 7365-45-9
Microsomi epatici umani	Biovit	X008070	ad esempio INVITROCYP 150-Microsomi del fegato umano raggruppati da donatori
Iodio (standard IC)	Supelco	41271-100ML	ad esempio, standard di iodio per IC, 1000 mg/L in acqua, Sigma-Aldrich
Resina a scambio ionico come la Dowex 50WX2	Roth	334.4	CAS 12612-37-2; Mesh 100-200
Tubi microcentrifughe 1.5  mL	Merck	EP0030120086-1PAK	ad esempio Eppendorf & reg; Tubi microcentrifughe Safe-Lock, volume 1,5 mL, naturali
Distributore multicanale in grado di fornire 50-300  & micro; L per passo	NA	NA	NA
Pipetta multicanale in grado di fornire da 10 a 100  & micro; L per passo	NA	NA	NA
Misuratore di pH con elettrodo e tamponi di calibrazione	NA	NA	in grado di leggere +/- 0,1 unità di pH
Fotometro per la misurazione dell'assorbenza	Tecan Trading AG	NA	ad esempio Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
Pipete in grado di fornire da 1 a 10  & micro; L	NA	NA	NA
Pipete in grado di fornire da 10 a 100 nbsp; & micro; L	NA	NA	NA
Pipete in grado di fornire da 100 a 1000 nbsp; & micro; L	NA	NA	NA
Pipete per volumi più alti	NA	NA	Pipette sierologiche, ad esempio 10, 25, 50 mL
Agitatore per piastre	Thermo Fisher	NA	ad esempio la piastra microtitolatrice Thermo Scientific H+P monoshake vortexer, controllata direttamente
Pipetta ripetitrice	NA	NA	NA
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-25G	CAS: 7647-14-5, ad esempio cloruro di sodio, reagente ACS e così; 99.0 %
Software di statistica	NA	NA	Capace di eseguire analisi di regressione che riflettano le caratteristiche del saggio e capace di calcolare concentrazioni inibitorie, ad esempio GraphPad Prims 8, GraphPad
Acido solforico (H2SO4)	Supelco	1007311000	CAS 7664-93-9
Fiaschetta volumetrica	NA	NA	Certificato con volume definito