Articolo metodologico

Isolamento e identificazione delle cellule sinoviali primarie simili a fibroblasti da pazienti con artrite reumatoide

DOI:

10.3791/70116

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24 febbraio 2026

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1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive il metodo per isolare e identificare i sinoviociti primari simili ai fibroblasti (FLS) ad alta purezza dal tessuto sinoviale di pazienti con artrite reumatoide per una modellazione affidabile della malattia e uno screening farmacologico.

Abstract

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L'artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria autoimmune cronica caratterizzata da iperplasia sinoviale e distruzione articolare progressiva come principale caratteristica patologica. I sinoviociti simili a fibroblasti (FLS) sono riconosciuti come componenti cellulari fondamentali nella patogenesi dell'AR, caratterizzati dal loro comportamento aggressivo simile a un tumore, che media la distruzione di cartilagine e ossa. L'isolamento e la purificazione dei sinoviociti simili a fibroblasti per l'artrite reumatoide (RA-FLS) è uno strumento fondamentale per indagare i meccanismi della malattia e valutare potenziali farmaci terapeutici. Qui presentiamo un protocollo completo per isolare, coltivare e validare funzionalmente la RA-FLS primaria umana da campioni di tessuto sinoviale resezionati ottenuti durante la sostituzione del ginocchio in pazienti con AR. Questo metodo utilizza tessuto sinoviale fresco e impiega un processo di digestione enzimatica sequenziale con tripsina e collagenasi di tipo II per massimizzare l'isolamento della RA-FLS dalla matrice tissutale. Infine, l'identificazione cellulare viene ottenuta tramite immunofluorescenza Vimentina e citometria a flusso, completata dalla valutazione funzionale della proliferazione indotta da TNF-α. Questo protocollo consente l'acquisizione di colture di RA-FLS ad alta purezza con caratteristiche fenotipiche specifiche e risposta infiammatoria, fornendo ai ricercatori un metodo affidabile per ottenere RA-FLS a breve termine, derivata dal paziente, adatta a screening farmacologico, studi meccanicistici e applicazioni di ingegneria tissutale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria autoimmune cronica caratterizzata da poliartrite simmetrica delle articolazioni periferiche, con una prevalenza globale stimata dello 0,5%-1% e il potenziale di indurre varie complicazioni sistemiche ed extraarticolari 1,2,3,4,5. La caratteristica patologica centrale dell'AR è la sinovite cronica mediata da risposte autoimmuni, che porta ulteriormente alla formazione di tessuto panno invasivo che erode la cartilagine articolare e l'ossosottocondrale 6,7. Tra questi, la sinovite rappresenta il più antico e centrale segno patologico della AR. I sinoviociti simili a fibroblasti (FLS), che risiedono come cellule residenti predominanti della sinovia, sono fondamentali nell'orchestrazione sia dell'infiammazione sinoviale sia della distruzioneossea 8,9. Durante la risposta infiammatoria sinoviale nell'AR, i sinoviociti fibroblastici simili all'artrite reumatoide (RA-FLS) perdono il loro fenotipo "regolatore" normale e invece mostrano un profilo "pro-infiammatorio" 10. Questo cambiamento porta alla massiccia produzione di citochine infiammatorie, che possono attivare vie metaboliche energetiche correlate, portando a un aumento della proliferazione cellulare e amplificando ulteriormente la cascata infiammatoriasinoviale 11,12,13. Contemporaneamente, RA-FLS interagisce con altre cellule immunitarie (come macrofagi, cellule T e cellule B) per mantenere uno stato infiammatorio cronicopersistente 14,15. Inoltre, l'RA-FLS presenta caratteristiche simili a quelle cancerogene, tra cui una maggiore capacità migratoria, invasività, proliferazione incontrollata e resistenza all'apoptosi, ed è attivamente coinvolta nei processi di erosione di cartilaginee ossea 16.

Negli ultimi anni, le FLS sono state ampiamente utilizzate come modelli in vitro per studiare malattie infiammatorie articolari come l'AR, una tendenza dovuta in parte alle limitazioni delle attuali farmacoterapie di primalinea 17,18,19. Sono impiegati in colture 2D, modelli 3D e sistemi organo-in-chip per indagare i meccanismi delle malattie, validare bersagli terapeutici e condurre screening antidroga 20,21,22,23. Inoltre, i RAFLS fungono da base per applicazioni avanzate, inclusi organoidi sinoviali derivati dal paziente per la previsione della risposta dei DMARD; editing genetico tramite CRISPR/Cas9 per studiare la funzione genica nella progressione dell'AR; e come fonte cellulare per l'ingegneria di innesti sinovialifunzionali 24,25,26.

L'ottenimento di RA-FLS coltivato a breve termine dal tessuto sinoviale di pazienti con artrite reumatoide rappresenta il primo passo per molti esperimenti. Rispetto alle linee cellulari FLS, le RA-FLS a breve termine coltivate e derivate dal paziente mantengono eterogeneità inter-paziente e caratteristiche specifiche della malattia, permettendo una rappresentazione più autentica dei fattori trascrizionali correlati alla malattia e delle differenze regolatorie delle vie di sicurezza. Di conseguenza, la resa cellulare, il tasso di crescita e le prestazioni funzionali possono essere influenzati da fattori specifici del paziente come età, durata della malattia, storia dei farmaci e attività della malattia, portando a un certo grado di variabilità tra i lotti. I ricercatori dovrebbero quindi valutare il background clinico della fonte tissutale prima dell'uso e condurre esperimenti nei passaggi precoci (P3-P7) per mantenere la stabilità fenotipica delle cellule.

Questo studio dettaglia un protocollo semplificato per l'estrazione e l'identificazione dell'RA-FLS dal tessuto sinoviale del ginocchio. Il metodo impiega una digestione enzimatica sequenziale (tripsina seguita da collagenasi di tipo II) combinata con una dissociazione meccanica delicata. Le evidenze suggeriscono che tali strategie enzimatiche ottimizzate e a più fasi generalmente superano i trattamenti a singolo enzima o a misto enzimatico non sequenziale, il che può compromettere la vitalità cellulare e il fenotipo 27,28,29,30. In confronto, il protocollo presentato consente un isolamento più efficiente e delicato di RA-FLS ad alta vitalità e purezza, minimizzando i danni cellulari e la perdita fenotipica per garantire l'idoneità ai saggi funzionali a valle.

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Protocollo

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Questo studio ha raccolto tessuto sinoviale da pazienti con artrite reumatoide sottoposti a un intervento di sostituzione articolare presso il China-Japan Friendship Hospital. Tutti i pazienti hanno fornito un consenso informato scritto prima dell'intervento. Le informazioni raccolte e i campioni biologici sono stati gestiti con misure rigorose per garantire la privacy dei pazienti e la sicurezza dei dati. Eventuali campioni di tessuto sinoviale rimanenti sono stati smaltiti secondo le normative sulla biosicurezza. L'uso di tessuto sinoviale dell'articolazione del ginocchio da pazienti con artrite reumatoide in questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale dell'Amicizia Cina-Giappone (Approvazione n.: 2025-KY-223). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Acquisizione e preparazione del tessuto sinoviale

NOTA: Inserire il tessuto sinoviale ottenuto durante l'intervento in un contenitore sterile riempito con soluzione salina allo 0,9% o PBS per prevenire contaminazioni durante il trasferimento dalla sala operatoria all'armadietto di biosicurezza. Utilizzare l'immersione con etanolo seguita da un lavaggio con una soluzione di penicillina-streptomicina come passaggi critici per prevenire contaminazioni batteriche o fungine, garantendo il successo degli esperimenti successivi.

  1. Immergi tessuto sinoviale fresco in un tubo centrifuga da 50 mL contenente PBS e trasferiscilo in un armadietto di biosicurezza.
  2. Trasferire il tessuto sinoviale in una piastra di Petri contenente il 75% di etanolo e immergerlo per 30 secondi per la disinfezione.
  3. Rimuovere il tessuto adiposo e osseo dal tessuto sinoviale utilizzando forbici chirurgiche sterili e pinze, quindi trasferire il tessuto rimanente in un nuovo piatto di coltura.
  4. Lavare il tessuto sinoviale ottenuto 3 volte con PBS contenente il 10% di penicillina/streptomicina.

2. Digestione del tessuto sinoviale

NOTA: Utilizzare la tripsina per interrompere le giunzioni cellulari e la matrice extracellulare all'interno del tessuto sinoviale per il successivo isolamento. Applicare la collagenasi di tipo II per degradare selettivamente la struttura della matrice extracellulare, facilitando la dissociazione cellulare dalla matrice. Sterilizza tutte le forbici chirurgiche, le pinze e i filtri cellulari necessari per la dissezione del tessuto sinoviale tramite autoclaving prima dell'uso. Dopo la digestione, i frammenti di tessuto dovrebbero apparire allentati, con i bordi sfilacciati, e il mezzo può diventare leggermente torbido. I tessuti non digeriti rimarranno compatti e opaci.

  1. Trita ripetutamente il tessuto con forbici fino a farne frammenti da 1 mm × 1 mm.
  2. Aggiungere lo 0,25% di tripsina al tessuto e digerire a 37 °C in uno shaker a temperatura costante (a 100-150 rpm) o in un incubatore cellulare per 30 minuti.
  3. Prepara una soluzione di siero bovino fetale (FBS) al 10% utilizzando soluzione salina fosfatata tamponata (PBS).
  4. Trasferire il tessuto in tubi centrifughe da 15 mL o 50 mL a seconda della quantità di tessuto, neutralizzarlo e digerirlo con PBS contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS).
  5. Centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 minuti), poi scarta il surnatante e trattieni la pallina.
  6. Risospendi il pellet in PBS.
  7. Centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min), poi scartare il soprantantante e trattenere il pellet.
  8. Aggiungi 100 mg di collagenasi di tipo II a 50 mL di mezzo DMEM per preparare una soluzione di collagenasi di tipo II da 2 mg/mL.
  9. Filtrare la soluzione di collagenasi di tipo II preparata attraverso una membrana di 0,22 μm per la sterilizzazione.
  10. Aggiungi 2 mg/mL di collagenasi di tipo II e digerisci in un shaker a temperatura costante a 37 °C (a 100-150 giri/min) o in un incubatore cellulare per 4 ore.

3. Isolamento e coltura di sinoviociti simili a fibroblasti

NOTA: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare su un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili e indossare guanti sterili per prevenire contaminazioni.

  1. Prepara il mezzo DMEM completo integrando il medium basale DMEM con siero bovino fetale al 10%, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina.
  2. Posiziona un colino di 100 mesh cellulari su una piastra di Petri sterile e versa il tessuto sinoviale digerito e il liquido sul colino.
  3. Trasferire il filtratore cellulare con tessuto residuo in un'altra piastra di Petri sterile.
  4. Macinare il tessuto rimanente sul colino usando l'estremità di una barra sterile sterile da 20 mL finché non rimangono solo residui bianchi e fibrosi e non possono essere espresse ulteriori sospensioni cellulari.
  5. Risciacqua il colino con un volume appropriato di mezzo DMEM completo.
  6. Raccogli tutti i filtrati, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e scarta il surnaante.
  7. Sospendere il pellet in PBS, centrifugare (4 °C, 500 × g, 5 min) e scartare il sovrantante.
  8. Sospendere le cellule in un mezzo DMEM completo.
  9. Esegui il conteggio delle cellule e trasferisci le cellule in una fiaschetta di coltura.
  10. Incubare la fiaschetta in un incubatore di colture cellulari (37 °C, 5% CO₂).
  11. Sostituisci il medium dopo 48 ore.
  12. Digerisci le cellule con tripsina e passaggio in un rapporto 1:3 quando raggiungono la confluenza completa.

4. Identificare RA-FLS utilizzando la colorazione immunofluorescenza della vimentina

NOTA: Preriscaldare la soluzione PBS utilizzata per il lavaggio delle celle in un bagno d'acqua impostato a 37 °C. Tutti i volumi di reagenti specificati in questa sezione sono standardizzati per un formato a piastre a 48 pozzi. I volumi dovrebbero essere scalati proporzionalmente in base all'area di crescita quando si usano lastre di formato diverso.

  1. Digerire le cellule con la tripsina, risospendere le cellule raccolte e diluire a 1 × 104 cellule/L usando un mezzo DMEM completo.
  2. Seme RA-FLS in una piastra da 48 pozzi a 200 μL per pozzo.
  3. Mettere in un incubatore di colture cellulari (37 °C, 5% CO₂) e incubare per 24 ore.
  4. Scartare il substrato e lavare le cellule tre volte con PBS preriscaldato.
  5. Aggiungi il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule per 10 minuti, elimina il fissativo e lava tre volte con PBS.
  6. Preparare 150 μL di soluzione Triton X-100 allo 0,1% in PBS per pozzo. Assicurati una miscelazione completa tramite vortice o inversione dolce prima dell'uso.
  7. Aggiungere soluzione Triton X-100 allo 0,1% ai pozzi e incubare per 10 minuti per permeabilizzare le cellule.
  8. Scartare la soluzione Triton X-100 allo 0,1% e lavare tre volte con PBS.
  9. Aggiungi 150 μL di soluzione bloccante senza animali per pozzo, incuba a temperatura ambiente per 1 ora.
  10. Scarta la soluzione di blocco. Aggiungere 150 μL di soluzione primaria di attivazione per anticorpi di vimentina (diluente diluente per anticorpi diluente) in ciascun pozzo.
  11. Incubare con l'anticorpo primario a 4 °C durante la notte.
  12. Elimina l'anticorpo primario e lava le cellule cinque volte con PBS.
  13. Aggiungere 150 μL di anticorpo secondario IgG anti-coniglio coniugato Alexa Fluor 488 (diluito 1:50 in diluente universale per anticorpi) per pozzo, e incubare a 37 °C per 1 ora protetto dalla luce.
  14. Scartare l'anticorpo secondario e lavare le cellule tre volte con PBS.
  15. Aggiungi una goccia di mezzo antisfaccetto contenente DAPI per pozzo e asciuga per 10 minuti al buio.
  16. Osserva e cattura immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di un obiettivo 20× e set di filtri appropriati per DAPI e FITC/GFP.
    NOTA: Lavare le cellule con PBS riempiendo completamente i pozzi con PBS, incubando per 5 minuti, e poi rimuovendo il PBS. Questa procedura costituisce un unico ciclo di lavaggio.

5. Quantificare RA-FLS e valutare la purezza utilizzando la citometria a flusso

NOTA: Utilizzare Vimentina e CD90 come marcatori positivi per identificare RA-FLS, applicando CD68, CD14 e CD11b come controlli negativi per escludere la contaminazione da cellule immunitarie. La vimentina funge da proteina filamentosa intermedia specifica intracellulare, prevalentemente localizzata nel citoplasma di RA-FLS. CD90 funziona come un marcatore superficiale critico fortemente espresso su RA-FLS, permettendo la loro distinzione dalle cellule immunitarie. Sebbene CD68, CD14 e CD11b siano specificamente espressi in macrofagi, monociti e cellule mieloidi, vengono impiegati come marcatori negativi per escludere la contaminazione da cellule immunitarie. Assegnare fluorocromi ai marcatori di superficie cellulare in base alla loro specificità di legame e assicurarsi che non si sovrappongano canali di fluorescenza. Ad esempio, in questo esperimento, CD90 e CD68 condividono lo stesso fluorocromo; pertanto, non aggiungerli allo stesso tubo della centrifuga. Prima di incubare con l'anticorpo della vimentina, aggiungere agenti di fissazione e permeabilizzazione per disturbare la membrana cellulare. Se il citometro a flusso dispone di canali fluorescenti sufficienti, marker come CD90 e CD68 possono essere assegnati a canali diversi per un'analisi simultanea multicolore al fine di migliorare ulteriormente l'efficienza della rilevazione e il contenuto informativo.

  1. Digerire RA-FLS di terza generazione usando tripsina senza EDTA.
  2. Terminare la digestione con mezzo DMEM completo, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e scartare il sovrandante.
  3. Risospendere il pellet in PBS, eseguire il conteggio delle cellule e regolare la concentrazione cellulare a 1 × 10⁶ cellule/mL usando PBS.
  4. Distribuire le celle in tre tubi centrifughe, aggiungendo 200 μL di sospensione a ciascun tubo.
  5. Aggiungere l'anticorpo CD11b (diluito 1:100 in diluente universale per anticorpi) a un volume finale di 100 μL nel tubo 1. Vortice da mixare.
    1. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere 1 mL di agente di fissazione/permeabilizzazione al tubo 1, miscelare il vortice e incubare per 30 minuti protetto dalla luce.
    2. Aggiungere 1 mL di buffer di fissazione/permeabilizzazione al Tubo 1 per terminare la permeabilizzazione, vortice per mescolare, centrifugare (4 °C, 500 × g, 5 minuti) e scartare il sovrantante.
    3. Preparare 100 μL di vimentina e cocktail di anticorpi CD68 (ciascuno diluito 1:100 in diluente universale per anticorpi), aggiungere al tubo 1, creare un vortice per mescolare e incubare protetto dalla luce per 30 minuti.
    4. Aggiungi 1 mL di buffer di fissazione/permeabilizzazione al tubo 1, vortice da mescolare, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 minuti) e scarta il soprantantante.
    5. Aggiungere 100 μL di anticorpo secondario IgG anti-coniglio coniugato con Alexa Fluor 488 (diluito 1:50 in diluente universale per anticorpi) al tubo 1. Vortice per mescolare e incubare protetto dalla luce per 30 minuti.
    6. Aggiungi 1 mL di tampone al tubo 1, al vortice per mescolare, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e scarta il soprantantante.
    7. Aggiungere 300 μL di buffer al Tubo 1 e vortice per mescolare per il campione di carico.
  6. Aggiungere anticorpi CD90 e CD14 (ciascuno diluito 1:100 in diluente universale per anticorpi) al tubo 2 a un volume finale di 100 μL. Lasciare il tubo 3 senza anticorpi come controllo negativo.
    1. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungi 1 mL di PBS ai tubi 2 e 3.
    2. I tubi centrifughe 2 e 3 (4 °C, 500 × g, 5 min) scartano il sovrandante, aggiungono 300 μL di tampone e si mescola per il campione di caricamento.
  7. Eseguire l'acquisizione tramite citometria a flusso dei campioni preparati.
  8. Analizza i dati della citometria a flusso ed esegue statistiche utilizzando software compatibile.

6. Misurazione della proliferazione RA-FLS indotta da TNF-α utilizzando il saggio MTS

  1. Digerire RA-FLS di terza generazione usando tripsina senza EDTA.
  2. Terminare la digestione con mezzo DMEM completo, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e scartare il sovrandante.
  3. Risospendere il pellet in mezzo DMEM completo, eseguire il conteggio delle cellule e diluire a 1 × 10⁵ cellule/L.
  4. Semina le cellule risospese in una piastra da 96 pozzi a 100 μL per pozzo.
  5. Incubare la piastra in un incubatore di colture cellulari fino a quando non avviene l'adesione cellulare, poi dividere in gruppi di controllo e intervento vuoti.
  6. Aggiungere 10 ng/mL di TNF-α al gruppo di intervento e un volume uguale di PBS al gruppo di controllo vuoto.
  7. Dopo 24 ore di intervento, aggiungere 10 μL di reagente MTS a ciascun pozzo e continuare l'incubazione nell'incubatore di colture cellulari.
  8. Dopo 1 ora di incubazione, si misura l'assorbanza (OD) a 490 nm utilizzando un lettore di microplacche.
  9. Calcola la vitalità della proliferazione cellulare basandosi sul valore OD di ciascun pozzo.

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Risultati

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Utilizzando il protocollo, abbiamo isolato con successo RA-FLS a breve termine in coltura e derivato dal paziente. Viene fornito uno schema del flusso di lavoro procedurale (Figura 1). Sotto microscopia ottica, l'RA-FLS ha mostrato un fenotipo morfologico predominante di celle poligonali a forma di fuso e irregolari. Le cellule mostravano una diffusa diffusione citoplasmatica estesa con processi allungati. I confini cellulari apparivano leggermente indistint...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo stabilisce un metodo riproducibile per l'isolamento e la coltura a breve termine della RA-FLS da pazienti con RA, il cui successo è evidenziato da un'elevata vitalità cellulare, un fenotipo caratteristico, l'espressione di marcatori specifici e la reattività funzionale agli stimoli infiammatori.

Passaggi critici e considerazioni tecniche
L'affidabilità di questo metodo dipende da diversi passaggi critici. Innanzitutto, il ...

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Dichiarazioni

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Gli autori riportano che non ci sono conflitti di interesse in questo lavoro e confermano che l'uso di Figdraw per generare la Figura 1 rispetta i termini di licenza della piattaforma.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82074223 e 8207141673) e dal progetto chiave a livello di governo centrale: L'istituzione di un uso sostenibile per le preziose risorse della medicina cinese (n. 2060302).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 488-coniugato anti-rabbit IgGZhongshan Jingqiao BiotecnologiaZF-0511
0,25% Tripsina-EDTA (1X)Gibco25200-072
4% ParaformaldeideSolarbioP1110
Alexa Flour674 anti-umano CD68biolegend562111
Soluzione di blocco senza animaliTecnologia di segnalazione cellulare15019
APC anti-umano CD90biolegend559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD in Biologia657925
BD LSRFortessaBD in Biologia647177
BV605 anti-umano CD11bBidegend563015
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)PromegaG358A
Collagenasi IISolarbioC8150
Mezzo di montaggio fluorescente contenente DAPIZhongshan Jingqiao BiotecnologiaZLI-9556
Mezzo di montaggio fluorescente contenente DAPIZhongshan Jingqiao BiotecnologiaZLI-9556
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto livello di glucosioHyCloneSH30022.01
Siero bovino fetale-Superfine (FBS)Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.ZQ0500
FITC anti-umano CD14biolegend325604
PBS, 1 e volte; (pH 7,4) Soluzione salina tamponata con fosfatoServicebioG4202
Soluzione miscela di penicillina-streptomicina (doppi antibiotici) 100 volte e poi;Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.CSP006
QuickBlock Universal Protein Blocking e Buffer di diluizione degli anticorpiBeyotimeP0270-500ml
TNF-& alfa umano ricombinante;Peprotech300-01A
Buffe di colorazione con fattore di trascrizioneeBioscienza00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Soluzione di tripsina (senza EDTA)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

Riferimenti

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