Articolo di revisione

Metodi per chiarire i meccanismi delle malattie nei disturbi neuroevolutivi

DOI:

10.3791/70127

⸱

6 febbraio 2026

 , 
1Department of Neurology, University of Maryland School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le opzioni di trattamento modificanti della malattia per le persone che vivono con disturbi neuroevolutivi sono limitate e non esistono cure. Per affrontare questo problema, sono necessari sforzi per definire i meccanismi della malattia e nuovi bersagli terapeutici. In questa revisione, dettagliamo diverse tecniche che stanno guidando la strada in questi sforzi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I disturbi neuroevolutivi (NDD) colpiscono 317 milioni di bambini e giovani in tutto il mondo. Sebbene i NDD siano un gruppo eterogeneo di disturbi che colpiscono molteplici sistemi d'organo, l'epilessia, il disturbo dello spettro autistico (ASD) e/o la disabilità intellettiva (ID) sono esiti comuni. Purtroppo, esistono poche terapie modificanti la malattia e nessuna cura per le NDD. Recentemente, tuttavia, l'editing genetico, i saghi cellulari/molecolari e i modelli di cellule staminali sono emersi come tecniche promettenti per comprendere a fondo le cause profonde della NDD, categorizzare le varianti genetiche e modellare più precisamente i processi patologici umani. Inoltre, diverse tecniche, in particolare l'editing genetico, hanno già avuto successo clinico. In questa revisione, illustriamo diversi metodi innovativi per la validazione funzionale di varianti genetiche, modelli di cellule staminali delle NDD e approcci innovativi di editing genico. Comprendere e applicare questi metodi è fondamentale per scoprire nuovi meccanismi patologici e target terapeutici per le NDD, nonché per far progredire gli approcci tecnici dalla banca alla clinica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I disturbi neuroevolutivi (NDD) colpiscono 317 milioni di bambini e giovani intutto il mondo 1. Questi disturbi possono includere paralisi cerebrale, sindrome dell'X fragile, sindrome di Angelman e complesso di sclerosi tuberosa, tra molti altri. Sebbene i NDD siano un gruppo eterogeneo di disturbi che colpiscono molteplici sistemi d'organo, l'epilessia, il disturbo dello spettro autistico (ASD) e/o la disabilità intellettiva (ID) sono esitifrequenti 2. Infatti, uno studio ha riportato che i bambini in Kenya con epilessia e disabilità cognitive, visive, uditive o motorie sono morti a un tasso da 3 a 4 volte superiore a quello di quelli del gruppo1 non NDD.

Un cambiamento di paradigma per lo studio delle NDD avvenne con il completamento del Progetto Genoma Umano nel 2003. Ulteriori progressi sono stati fatti definendo i punteggi di rischio poligenico tramite GWAS, e caratterizzando i "disturbi neurosviluppativi" dal DSM-5 nel2013-4. Sebbene ci siano progressi significativi nella comprensione delle cause genetiche dei NDD, esistono poche terapie mirate per specifici NDD e non esistono terapie modificanti della malattia per l'ASD e/o il DI associati ad essi.

I metodi e i metodi di editing genico, elettrofisiologici e cellulari/molecolari descritti in questa revisione sono all'avanguardia della ricerca sulla NDD. Sebbene non abbiamo trattato in modo esaustivo tutti i sani, questi metodi rappresentano approcci all'avanguardia per identificare terapie che modificano la malattia. Un esempio, gli enzimi deubiquitilanti (DUB), è un gruppo di enzimi che rimuovono l'ubiquitina dalle proteine. Poiché le mutazioni all'interno dei DUB sono collegate agli NDD, mirare alla loro modifica potrebbe essere una potenziale terapia per leNDD 5,6. Inoltre, vengono esaminate vie a livello di circuito, come quelle che coinvolgono la subunità recettoreGABA A, e altre canalopatie per definire i meccanismi della malattia associati all'epilessia, all'ASD e alla ID7. Un altro metodo rilevante, l'editing genomico CRISPR/Cas (Figura 1), è uno strumento potente utilizzato per modificare direttamente il genoma al fine di creare nuovi modelli sperimentali e, recentemente, trattare malattie geneticherare 8,9,10. Il toolkit CRISPR continua ad espandersi, e quattro approcci, tra cui CRISPRi (CRISPR Interference/Inhibition), CRISPRa (Attivazione CRISPR), prime editing e base editing, sono emersi come innovazioni di ricerca e cliniche di grande impatto. Infine, questo articolo illustra i progressi nell'uso delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Gli iPSC e le loro derivate cellulari hanno permesso ai ricercatori di modellare in modo più accurato molti NDD utilizzando cellule derivate dai pazienti 9,11,12. È importante sottolineare che lo sviluppo degli organoidi a partire dagli iPSC ha permesso lo studio del processo di sviluppo che sta alla base di molti NDD in modo molto più rilevante per le malattie umane rispetto ai modelli diroditori 13,14.

Questa breve recensione dettaglia ed espande le tecniche sopra introdotte. Inoltre, vengono discussi diversi studi recenti che sfruttano queste tecniche per ottenere maggiori comprensioni sulle NDD, le lacune nella letteratura attuale e le direzioni future.

Revisione e prospettiva

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellule staminali pluripotenti indotte e paradigmi sperimentali associati

Le cellule staminali pluripotenti indotte sono emerse come un potente sistema in cui modellare le NDD. Infatti, molti processi dello sviluppo avvengono nei modelli iPSC simili a quelli osservati durante lo sviluppo cerebrale umano e che non avvengono durante lo sviluppo cerebrale deiroditori 15. Pertanto, i ricercatori hanno accoppiato modelli di cellule staminali, inclusi colturi 2D, organoidi e assembloidi, ad altri metodi sperimentali per comprendere meglio i meccanismi delle malattie nelle NDD 11,13,14,16.

Recentemente, assembloidi sono stati utilizzati per modellare una caratteristica chiave della neurogenesi compromessa durante lo sviluppo fetale della sindrome di Down (DS) 16. Utilizzando sia le hiPSC della DS che le hiPSC euploidi isogeniche, è stata indotta la neurogenesi, seguita dalla differenziazione in neuroni. Dopo 85 giorni, sono stati utilizzati immunocitochimica e imaging per osservare il ciclo cellulare. Hanno osservato che le cellule progenitrici neurali della DS non uscivano dal ciclo cellulare e non riuscivano a differenziarsi in neuroni maturi, e hanno anche scoperto che i difetti del ciclo cellulare modificano la fase neurogenica, causando una neurogenesi compromessa in DS16.

Mentre molti modelli di cellule staminali si sono concentrati sui neuroni, altri tipi cellulari, comprese le cellule gliali, svolgono un ruolo importante nella patologia dellaNDD 17. Un recente rapporto si è concentrato sul ruolo della gliogenesi e degli astrociti nella sindrome dell'X fragile (FXS). Utilizzando le hiPSC, le cellule progenitrici degli astrociti sono state coltivate e differenziate in astrociti specifici del cervello anteriore privi della proteina ribonucleare messaggera dell'Xfragile 11. Hanno osservato che questi astrociti presentavano un metabolismo glicolitico e mitocondriale disregolato. Lavori precedenti dello stesso team hanno anche dimostrato che la corretta funzione mitocondrica è necessaria per controllare l'attivazione del potenziale d'azione nei neuroni derivati da pazienti conFXS 11,18. Sebbene sia necessario approfondire il meccanismo con cui il metabolismo degli astrociti e l'attivazione dei neuroni vengono alterati nella FXS, questi studi dimostrano che gli astrociti possono sia guidare la patologia della malattia sia diventare un bersaglio terapeutico.

Editing genomico

Francisco Mojica gettò le basi per l'editing genomico con la scoperta di CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), un sistema immunitario adattativo per i procarioti, nei primi anni'90 1990. Sulla base di ciò, Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier hanno introdotto un metodo chiamato CRISPR/Cas9 che sfrutta CRISPR accoppiato all'endonucleasi Cas9 per isolare e modificare selettivamentei geni 20. Non molto tempo dopo la pubblicazione degli studi iniziali di editing genico CRISPR/Cas9, i ricercatori iniziarono a manipolare il sistema CRISPR/Cas per rivelare nuove informazioni genomiche o modificare i geni in modo unico. Un metodo innovativo è CRISPRi: un modo per silenziare un gene diinteresse 21,22. Utilizzando una nucleasi Cas9 cataliticamente inattiva insieme a cr- e tracr-RNA, l'accesso della RNA polimerasi al promotore viene bloccato, spegnendo l'espressione genica per uno specifico gene o un insieme digeni 22,23. Gli screening CRISPRi sono stati utilizzati per identificare diversi geni di rischio per le NDD e per individuare i cambiamenti funzionali associati alla perdita di funzione in quei geni. Ad esempio, uno screening recente di CRISPRi in assembloidi derivati da iPSC ha analizzato 425 geni NDD per il loro impatto sullo sviluppo interneuronale e ha rivelato che la perdita di diversi geni candidati ha influenzato la struttura del reticolo citoscheletricoe endoplasmatico 24. Inoltre, uno screening CRISPRi ha rivelato che la perdita di ADNP, un gene di rischio ASD, ha portato a cambiamenti nella potatura microgliale dellesinapsi 25. Pertanto, gli screening CRISPRi hanno rivelato diversi meccanismi di malattia convergenti e divergenti nella NDD.

Complementare a CRISPRi, CRISPRa è uno strumento utilizzato per aumentare l'espressione genica. Questa tecnica accoppia un Cas9 cataliticamente inattivo a attivatori trascrizionali ed è presa di mira da un RNA guida. CRISPRa è stato inoltre utilizzato per comprendere come l'attivazione dei geni di rischio ASD e NDD possa alterare i fenotipi della malattia. Sebbene esistano pochi studi che utilizzano CRISPRa per recuperare fenotipi NDD, CRISPRa potrebbe avere un grande potenziale terapeutico. Ad esempio, uno studio recente ha dimostrato che l'attivazione di ITGB3 (la cui aploinsufficienza è associata all'ASD) ha salvato la funzione della rete e i fenotipi dell'ASD neiroditori 23. Infatti, molte varianti del gene NDD causano malattie dovute all'aploinsufficienza, aumentando la possibilità che CRISPRa possa essere utilizzato per aumentare l'espressione dell'allele non affetto in modo modificante della malattia.

L'editing di base e il prime editing sono metodi precisi all'interno della cassetta degli attrezzi CRISPR per modificare nucleotidi specifici all'interno del genoma. Entrambi tagliano un singolo filamento di DNA invece di una rottura a doppio filamento (DSB) come CRISPR/Cas910,26. Sebbene il montaggio base sia più specifico rispetto al montaggio standard CRISPR/Cas9, è meno adattabile e quindi meno rilevante dal punto di vista traslazionale rispetto al prime editing. L'efficienza dell'editing delle basi risiede nella sua capacità di correggere mutazioni puntiformi sostituendo la citosina con timina o adenina con la guanina e viceversa10. Per questo motivo, il montaggio delle basi è limitato nei tipi di mutazioni che può produrre. Quindi, sebbene utili, possono essere eseguite solo mutazioni di transizione, non inserzioni odelezioni 10. Tuttavia, il prime editing è una forma altamente adattabile di editing genomico con molte possibili applicazioni. Il montaggio prime sfrutta un RNA guida di editing principale (pegRNA) e una nickasi Cas9 accoppiata a trasscrittasi inversa che può facilitare inserzioni, delezioni o cambiamenti in singolinucleotidi 10. Purtroppo, poiché è più tecnicamente complesso e può effettuare alterazioni geniche più grandi, il prime editing può essere meno efficiente rispetto al base editing. Pertanto, entrambi possono essere utilizzati come strumenti complementari e utili nell'editing genomico per disturbi neuroevolutivi. Il montaggio di prima qualità è già stato utilizzato per trattare un paziente con una rara malattiagenetica 27 e ha mostrato potenzialità nel salvare fenotipi di malattie in un modello roditore di emiplegia alternata nell'infanzia28.

Saggi cellulari e molecolari

I NDD sono causati da varianti genetiche che influenzano la funzione cellulare in modidiversi 29,30,31. Una delle principali sfide per chi studia le NDD è come determinare se una variante specifica del paziente causa o meno un cambiamento funzionale deleterio alla cellula. Pertanto, c'è un grande bisogno di saggi che possano determinare rapidamente e con precisione se una variante genetica specifica sia causante di malattie o benigna. Un nuovo saggio promettente è il test di scolturaa ubiquitina 32. Gli enzimi deubiquitilanti (DUB) sono un gruppo di enzimi che rimuovono l'ubiquitina dalle proteine, prevenendo la degradazione. I DUB sono sia potenziali trattamenti che cause di NDD. Finora, sono state identificate mutazioni in 12 DUB come causalmente legate alle NDD, tra cui la sindrome di Hao-Fountain, la pseudo-TORCH, la sindrome da microcefalia-malformazione capillare e altre5. Per determinare se varianti specifiche del paziente causano o meno malattia, i saggi di clivagatura ubiquitina in vitro sono diventati il punto di riferimento per misurare l'attività enzimatica DUB al fine di validare funzionalmente le mutazioni. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l'effetto delle varianti geniche sulle DUB. Uno studio recente si è concentrato su una DUB mutata nella disabilità intellettiva 105 legata all'X, DUB Ubiquitin Specific Protease 27 (USP27X). I ricercatori hanno dimostrato con successo un metodo per l'espressione e purificazione di USP27X ricombinante e un saggio in vitro sulla scissione della catena ubiquitina. Questo approccio consente di accertare l'attività enzimatica che regola il ricambio proteico nei neuroni e, quindi, può essere importante per comprendere i meccanismi alla base della potatura sinaptica alterata, dei periodi critici neurosviluppistici e della funzioneproteica 32. Curiosamente, vi è una scarsità di articoli pubblicati sulle DUB e il loro ruolo nelle malattie e, di conseguenza, l'intera applicabilità di questo saggio rimane non testata e aperta a ulteriori indagini.

Poiché molti NDD sono anche classificati come disturbi rari, l'accertamento genetico clinico delle varianti identifica frequentemente i cambiamenti genici come 'varianti di significato sconosciuto' (VUS) a causa della mancanza di studi clinici o funzionali pubblicati su talivarianti 7,33,34. Pertanto, i saggi per determinare rapidamente se una VUS sia patogena sono fondamentali per accertare le cause genetiche delle NDD. Un esempio sono le varianti dei recettoriGABA A. Le varianti genetiche del recettoreGABA A sono una delle principali cause di epilessia genetica e sono associate a molti tipi di crisi epilettiche e a encefalopatie epilettichedello sviluppo 7,35. Uno studio recente ha indagato le subunità del recettoreGABA A e ha cercato di identificare se le varianti causassero o meno cambiamenti funzionali all'interno della cellula utilizzando un approccio multimodale. I test in silico sono stati utilizzati per identificare la VUS e prevedere variazioni patogeniche della subunità γ2GABA A. Le conseguenze molecolari delle varianti furono quindi definite e includevano marcatori strutturali, fisicochimici ebiofisici 7. Ciascuno di questi domini è stato definito utilizzando analisi della letteratura, modellizzazione in silico e elettrofisiologia patch-clamp. Una volta selezionata una regione di riferimento, è stata utilizzata la modellazione neuronale piramidale per testare gli effetti dell'inibizione mediata dal recettoreGABA A. Hanno osservato che due mutazioni di un'unità ß3 (ß3N110D e ß3T288N) e due mutazioni di una subunità γ2 compromessero l'inibizioneGABAergica 7. Questo protocollo dimostra che un approccio multimodale è spesso utile per determinare la patogenicità della VUS. Pur non essendo ad alta produttività, questo approccio può essere utile anche per altre VUS associate a NDD che non dispongono di un test specifico per validare funzionalmente varianti (ad esempio, DUB), in particolare se associate a cambiamenti elettrofisiologici.

Sebbene non sia un approccio innovativo, l'elettrofisiologia a patch-clamp rimane lo standard d'oro per comprendere le proprietà elettriche dei neuroni e, di conseguenza, come i cambiamenti genetici influenzino anche le proprietà di base dei neuroni. Rilevanti per le NDD sono lecanalopatie 36. Sebbene esistano molti tipi di canalopatie, le varianti di SCN1A sono state ben studiate e rappresentano la causa principale della sindrome di Dravet - un'encefalopatia epilettica dello sviluppo particolarmentedevastante 36. La validazione funzionale delle varianti di SCN1A è stata ottenuta utilizzando un approccio combinatorio di patch-clamp automatizzato e simulazioni in silico. Sfruttando questo approccio, i ricercatori sono riusciti a risolvere diverse VUS e a creare correlazioni genotipo-fenotipo basate sui cambiamenti funzionali deineuroni 37. In uno studio separato con un approccio simile, i modelli iPSC sono stati utilizzati con elettrofisiologia automatica a patch-clamp e modelli in silico per classificare varianti geniche nei canali calcicidi tipo T 38. Concentrandosi su CACNA1G, un gene che codifica Cav3.1 in vari tipi di neuroni, CACNA1G è stato mutato per creare 18 varianti di Cav3.1 che sono poi state transitoriamente trasfettate nei neuroni. Successivamente, furono effettuate registrazioni automatiche del patch-clamp, seguite da approcci manuali patch-clamp e calcolo. Hanno osservato che il patch-clamp automatizzato e il patch-clamp manuale producevano risultati simili e che gli approcci computazionali erano in grado di accertare i cambiamenti funzionali indotti da specifiche variantigenetiche 38. Sebbene i modelli computazionali offrano un modo relativamente rapido per prevedere le conseguenze funzionali delle varianti geniche, gli approcci elettrofisiologici rimangono dispendiosi in termini di tempo e richiedono competenze altamente specializzate che limitano l'utilità di tali approcci nel tentativo di convalidare un gran numero di varianti.

Le matrici multi-elettrodo (MEA) sono utilizzate per misurare l'attività elettrica attorno a piccoli gruppi o su grandi reti di celle. Questo metodo differisce dall'elettrofisiologia patch-clamp in quanto si concentra su modelli multicellulari, mentre il patch-clamp è centrato su un unico canale ocellula 39,40. Per questo motivo, le MEA possono fornire una comprensione di come le diverse regioni cerebrali interagiscono tra loro e possono essere utilizzate per studiare le malattie su scala di rete. Molti studi hanno utilizzato i MEA per indagare modelli sperimentali di epilessia eASD 14,39. Una caratteristica chiave delle MEA è che sono in grado di determinare i modi in cui diversi tipi di cellule neuronali interagiscono (ad esempio, neuroni glutamatergici, interneuroni GABAergici, progenitori e cellule gliali)14. Questo rende i MEA un eccellente approccio per studiare gli assembloidi cerebrali. Uno studio, condotto da Pan et al., ha utilizzato questo metodo per studiare lo sviluppo delle reti neuronali. Gli autori hanno utilizzato cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) dai fibroblasti14 del prepuzio, che sono stati prima marcati viralmente e poi coltivati per generare assembloidi. Successivamente, gli assembloidi sono stati attaccati alle tavole MEA e ne hannoregistrati 14. È importante sottolineare che, poiché gli assembloidi potevano essere stabilizzati, registrati e sottoposti a esperimenti farmacologici per circa 50 giorni, questo paradigma poteva essere utilizzato per analizzare farmaci terapeutici per trattare l'epilessia associata alle NDD. Infatti, questo approccio potrebbe essere utilizzato per testare eventuali NDD in cui sono note o sospettate variazioni nelle proprietà di rete deineuroni 14.

Conclusioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I NDD possono essere disturbi devastanti e hanno pochi trattamenti mirati e nessuna cura. Infatti, la maggior parte delle terapie è mirata a gestire i sintomi della malattia (ad esempio, farmaci antiepilettiche per l'epilessia). Tuttavia, i recenti progressi tecnologici hanno portato a nuove tecniche di editing genico, saghi e sistemi modello che permettono agli scienziati di indagare le cause profonde delle NDD  (Figura 1). Questa revisione ha descritto alcuni degli approcci all'avanguardia negli sforzi per trovare nuovi trattamenti per le NDD e patologie correlate. Le tecniche di editing genico permetteranno ai ricercatori di colpire direttamente le mutazioni per comprendere meglio i meccanismi della malattia e potenzialmente trattare i pazienti con la terapia genica di precisione. Nuovi saghi consentono la rapida classificazione funzionale delle varianti genetiche, e i modelli di cellule staminali permetteranno agli scienziati di comprendere i primi meccanismi di sviluppo che guidano le NDD e di testare nuove terapie. Le tecniche descritte in questa revisione costituiscono la base su cui possono essere condotti studi futuri con l'obiettivo di acquisire una comprensione più profonda dei meccanismi NDD, oltre a condurre a nuovi approcci clinici per trattarli. Man mano che il campo continua a evolversi, studi futuri dovrebbero integrare tecniche come test prenatali, terapie fetali, imaging ad alto contenuto e farmacogenomica con quelle descritte in questa revisione.

figure-results-1
Figura 1: Riepilogo dei punti di forza e di debolezza chiave degli approcci tecnici. I metodi dettagliati nell'articolo e presentati nelle raccolte di metodi complementari sono riassunti. Un punto di forza e una debolezza principali sono dettagliati per ogni tecnica. Un riferimento chiave per ciascuna tecnica è fornito sotto la colonna del metodo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I finanziamenti sono stati forniti dal NIH NINDS RO1NS131223 a PHI. La Figura 1 è stata preparata usando BioRender.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global report on children with developmental disabilities. , https://www.unicef.org/media/145016/file/Global-report-on-children-with-developmental-disabilities-2023.pdf (2023).
  2. Martínez De Lagrán, M., Bascón-Cardozo, K., Dierssen, M. Neurodevelopmental disorders: 2024 update. Free Neuropathol. 20, (2024).
  3. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931-945 (2004).
  4. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. , 5th ed, American Psychiatric Association. (2013).
  5. Jolly, L. A., Kumar, R., Penzes, P., Piper, M., Gecz, J. The DUB club: Deubiquitinating enzymes and neurodevelopmental disorders. Biol Psychiatry. 92, 614-625 (2022).
  6. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 338-352 (2019).
  7. Arslan, A., Öz, P. Identification and classification of position-specific GABAA receptor subunit missense variants for their role in hippocampal pyramidal neurons. J Vis Exp. , e67833(2025).
  8. Cabré-Romans, J. J., Cuella-Martin, R. CRISPR-dependent base editing as a therapeutic strategy for rare monogenic disorders. Front Genome Ed. , 7(2025).
  9. Zhang, F., Wen, Y., Guo, X. CRISPR/Cas9 for genome editing: Progress, implications and challenges. Hum Mol Genet. 23, R40-R46 (2014).
  10. Matuszek, Z., Brown, B. L., Yrigollen, C. M., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Current trends in gene therapy to treat inherited disorders of the brain. Mol Ther. 33, 1988-2014 (2025).
  11. Reddy, B. K., Annaiyappa, N., Bhattacharya, A., Chattarji, S., Pal, R. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cell-derived astrocytes lacking fragile X messenger ribonucleoprotein. J Vis Exp. (220), e68081(2025).
  12. Ren, B., Dunaevsky, A. Modeling neurodevelopmental and neuropsychiatric diseases with astrocytes derived from human-induced pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 22 (4), 1692(2021).
  13. Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  14. Pan, T., et al. A multi-electrode array platform for modeling epilepsy using human pluripotent stem cell-derived brain assembloids. J Vis Exp. (211), e67396(2024).
  15. Wu, S. R., Nowakowski, T. J. Exploring human brain development and disease using assembloids. Neuron. 113 (8), 1133-1150 (2025).
  16. Sharma, V., Chhawari, H., Joshi, P., Nehra, S., Singhal, N. In vitro modeling of Down syndrome neurogenesis using human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (217), e67382(2025).
  17. Lee, K. M., et al. The application of human pluripotent stem cells to model the neuronal and glial components of neurodevelopmental disorders. Mol Psychiatry. 25, 368-378 (2020).
  18. Sharma, S. D., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42, 112344(2023).
  19. Mojica, F. J. M., Garrett, R. A. Discovery and seminal developments in the CRISPR field. CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea. Barrangou, R., van der Oost, J. , 1-31 (2013).
  20. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  21. Enright, A. L., Heelan, W. J., Ward, R. D., Peters, J. M. CRISPRi functional genomics in bacteria and its application to medical and industrial research. Microbiol Mol Biol Rev. 88 (2), e00170-e00222 (2024).
  22. Kristof, A., et al. Engineering novel CRISPRi repressors for highly efficient mammalian gene regulation. Genome Biol. 26, 164(2025).
  23. Jaudon, F., Thalhammer, A., Zentilin, L., Cingolani, L. A. CRISPR-mediated activation of autism gene Itgb3 restores cortical network excitability via mGluR5 signaling. Mol Ther Nucleic Acids. 29, 462-480 (2022).
  24. Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  25. Teter, O. M., et al. CRISPRi-based screen of autism spectrum disorder risk genes in microglia uncovers roles of ADNP in microglia endocytosis and synaptic pruning. Mol Psychiatry. 30, 4176-4193 (2025).
  26. Liang, R., et al. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 42, 1867-1875 (2024).
  27. Musunuru, K., et al. Patient-specific in vivo gene editing to treat a rare genetic disease. N Engl J Med. 392 (22), 2235-2243 (2025).
  28. Benezra, D., et al. Bilateral optic nerve abnormalities associated with a 4-10 chromosomal translocation. Ophthalmic Paed Gen. 5 (3), 151-154 (1985).
  29. Prasad, D., Shukla, P. A comprehensive review on neurodevelopmental disorders. 12, 5(2025).
  30. Pinheiro, J., Honavar, M. F. Focal cortical dysplasia: updates. Indian J Pathol Microbiol. 65, S189-S197 (2022).
  31. Pejhan, S., Rastegar, M. Role of DNA methyl-CpG-binding protein MeCP2 in Rett syndrome pathobiology and mechanism of disease. Biomolecules. 11 (1), 75(2021).
  32. Koch, I., et al. Measuring enzymatic activity of neurodevelopmental disorder-associated deubiquitylating enzymes via an in vitro ubiquitin chain cleavage assay. J Vis Exp. (211), e67367(2024).
  33. Chen, E., et al. Rates and classification of variants of uncertain significance in hereditary disease genetic testing. JAMA Netw Open. 6, e2339571(2023).
  34. Al Eissa,, et al. Reclassifying variations of unknown significance in diseases affecting Saudi Arabia's population reveal new associations. Front Genet. 14, 1250317(2023).
  35. Maljevic, S., et al. Spectrum of GABAA receptor variants in epilepsy. Curr Opin Neurol. 32 (2), 183-190 (2019).
  36. Brunklaus, A., et al. Gene variant effects across sodium channelopathies predict function and guide precision therapy. Brain. 145 (12), 4275-4286 (2022).
  37. Knox, A. T., et al. Genotype-function-phenotype correlations for SCN1A variants identified by clinical genetic testing. Ann Clin Transl Neurol. 12 (3), 499-511 (2025).
  38. Davakan, A., et al. Electrophysiological classification of CACNA1G gene variants associated with neurodevelopmental and neurological disorders. Front Pharmacol. 16, 1613072(2025).
  39. McCready, F. P., et al. Multielectrode arrays for functional phenotyping of neurons from induced pluripotent stem cell models of neurodevelopmental disorders. Biology. 11, 316(2022).
  40. The practice of patch clamping. Patch clamping. , 95-114 (2002).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Editing geneticoModelli di cellule staminaliValidazione di varianti geneticheSaggi molecolariSaggi cellulariDisturbo dello spettro autisticoDisabilit intellettivaEpilessia

Articoli correlati