Articolo metodologico

Valutazione della riserva di flusso coronarico in un modello murino di insufficienza cardiaca con frazione di eiezione preservata utilizzando l'ecocardiografia Doppler

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DOI:

10.3791/70135

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24 marzo 2026

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1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University, 2Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Nanjing University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un approccio rapido e non invasivo per valutare la disfunzione microvascolare coronarica in un modello murino di insufficienza cardiaca con frazione di eiezione preservata (HFpEF). La riserva di flusso coronarico (CFR) è determinata dalla localizzazione guidata da ultrasuoni Doppler dell'arteria coronarica sinistra, calcolata come il rapporto tra la velocità di flusso coronarico iperemica e quella di base.

Abstract

L'insufficienza cardiaca con frazione di eiezione preservata (HFpEF) costituisce un notevole onere globale per la salute e una sfida clinica importante a causa dell'assenza di terapie efficaci, e la fisiopatologia sottostante rimane sfuggente. La disfunzione microvascolare coronarica (CMD), altamente diffusa nei pazienti con HFpEF, scatena ischemia miocardica che compromette sia la funzione diastolica che quella sistolica del ventricolo sinistro. Dato che la disfunzione microvascolare è una caratteristica centrale dell'HFpEF, la CMD è ora considerata un fattore importante nella sua patogenesi. La riserva di flusso coronarico (CFR), definita come il rapporto tra la velocità massima iperemica e quella a riposo, è un marcatore molto prezioso dell'ischemia miocardica. Inoltre, rappresenta un indicatore completo della disfunzione vasomotoria coronarica, misurando gli effetti emodinamici combinati delle arterie coronarie epicardiche e microvascolari sulla perfusione miocardica. Questo protocollo si concentrava sulla valutazione dei cambiamenti nella CFR in un modello murino di HFpEF utilizzando l'ecocardiografia Doppler. In questo studio, i topi di controllo hanno mostrato un aumento superiore al doppio della velocità massima del flusso sanguigno coronarico con vasodilatazione indotta da isoflurano rispetto ai valori a riposo, mentre questa risposta è stata significativamente attenuata nei topi HFpEF. Nell'HFpEF, una riduzione della CFR prevede gli esiti avversi e riflette la disfunzione microvascolare sottostante, posizionandola come uno strumento chiave per studiare la progressione della malattia e guidare la selezione dei pazienti.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca (IC) con frazione di eiezione preservata (HFpEF) è stata la forma dominante di IC ed è associata a una prognosi negativa. Tuttavia, non esiste un trattamento comprovato per ridurre la morbilità e la mortalitàcorrelate 1,2. La presenza di molteplici fattori di rischio, tra cui età avanzata, ipertensione, diabete, dislipidemia e obesità, sta alla base della complessità e dell'eterogeneità in HFpEF3. Negli ultimi anni, le evidenze accumulate hanno dimostrato che la disfunzione microvascolare coronarica (CMD) è un fattore di rischio indipendente e diretto per l'HFpEF, piuttosto che unacomorbidità 4,5,6. La disfunzione microvascolare coronarica che coinvolge sia anomalie funzionali che strutturali è alla base dell'ischemia subendocardica, della fibrosi interstiziale diffusa e della disfunzione ventricolare sinistra in HFpEF 7,8. Sono state condotte ricerche approfondite sul ruolo patologico della CMD nelle malattie cardiovascolari 9,10. Uno studio clinico ha mostrato che la disfunzione microvascolare (evidenziata da una CFR compromessa <2.0) è direttamente associata a una peggiore funzione diastolica del ventricolo sinistro e potrebbe essere un bersaglio terapeutico promettente nell'HFpEF11. La valutazione ecocardiografica nello studio PROMIS-HFpEF ha rivelato che il 75% dei pazienti con HFpEF presentava CMD, basata sulle misurazioni CFR nell'arteriacoronarica sinistra 12. Inoltre, la CMD anomala era correlata a un rischio aumentato di esiti avversi, incluso un rischio di mortalitàsignificativamente aumentato 13,14. Di conseguenza, l'utilizzo della CMD come biomarcatore chiave nei modelli animali facilita notevolmente l'indagine della fisiopatologia dell'HFpEF e aiuta a convalidare la replicazione efficace del fenotipo della malattia.

Attualmente, i metodi per valutare la funzione microvascolare coronarica, come la tomografia a emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica cardiovascolare (CMR), la riserva di flusso frazionaria (FFR) e l'indice di resistenza microcircolatoria (IMR), sono difficili da applicare negli studi su roditori a causa delle dimensioni ridotte degli animali e della limitata disponibilità di hardware dedicato all'imaging. La riserva di flusso coronarico (CFR) è raccomandata dalle linee guida internazionali come strumento per interrogare la fisiologiacoronarica 15,16. Inoltre, la CFR funge da indicatore affidabile dell'ischemia cardiaca, indicatore della disfunzione vascolare coronarica e prezioso indicatore prognostico del rischiocardiovascolare. L'ecocardiografia Doppler per la valutazione della CFR è un metodo validato e riproducibile per valutare la funzione coronarica globale in modelli preclinici di roditori. Sebbene studi precedenti abbiano riportato l'uso della CFR in modelli topi/ratti di lesioni ischemiche-reperfusionemiocardica 18,19, non è mai stata applicata in modelli animali di HFpEF. Inoltre, il metodo di valutazione CFR descritto in questo studio, che localizza rapidamente l'ACL tramite ecocardiografia Doppler a colori, può essere esteso a una gamma di modelli animali, inclusi quelli di cardiomiopatia diabetica, cardiopatia ipertensiva e disturbi infiammatori o autoimmuni cronici. Nel presente studio, data l'assenza di stenosi coronarica epicardica nel modello murino, la riduzione della riserva di flusso coronarico (CFR) riflette principalmente disfunzioni microvascolari coronariche piuttosto che contributi epicardici e microvascolari combinati. Pertanto, il CFR funge da indicatore surrogato affidabile per la CMD in questo modello HFpEF.

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Protocollo

Tutte le procedure hanno rispettato i protocolli approvati dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Torre del Tamburo di Nanchino (Approvazione n. 20011141) e hanno rispettato le linee guida Ricerca sugli Animali: Segnalazione degli Esperimenti In Vivo (ARRIVE) 20. In questo studio, il modello HFpEF è stato stabilito in maschi di topi C57BL/6J (BW, ~25 g) di sei-otto settimane. Durante tutta la durata dell'esperimento, i topi sono stati ospitati in una stanza specifica priva di patogeni (SPF) in condizioni controllate di temperatura (23 ± 1 °C), umidità (65%–70%) e un ciclo di luce e buio di 12 ore. Tutti gli animali avevano accesso ad libitum a cibo e acqua. Dopo lo studio, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano all'1,5% e soppressi per lussazione cervicale. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Istituzione del modello topino HFpEF

  1. Assegnare casualmente i topi in due gruppi: un gruppo di controllo (CTRL) e un gruppo HFpEF, con otto topi ciascuno.
  2. Impiegare un protocolloconsolidato 21,22,23,24,25 per indurre il modello mouse HFpEF come segue:
    1. Dai dai topi dai sei alle otto settimane con una dieta ricca di grassi (HFD, 60% di grassi) e fornisci 0,5 g/L di N-nitro-L-arginina metilestere (L-NAME) disciolto in acqua potabile per 8 settimane.
      NOTA: Prepara acqua potabile L-NAME in bottiglie marroni per evitare l'esposizione alla luce e ricarica ogni 2–3 giorni.
  3. Dai da mangiare ai topi con età, compatibile, una dieta normale standard e fornisci acqua da bere regolarmente per la stessa durata del gruppo di controllo.

2. Valutazione della riserva di flusso coronarico tramite ecocardiografia

  1. Precedere la valutazione ecocardiografica anestetizzando il topo tramite inalazione di isoflurano vaporizzato all'1,5% somministrato a 1,5–2,0 L/min con flusso di O₂ al 100% in una camera anestesia.
    ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico volatile. Assicurati una ventilazione adeguata durante il funzionamento. Indossa guanti di nitrile quando aggiungi isoflurano liquido al vaporizzatore per evitare il contatto con la pelle.
  2. Confermare l'assenza di reazione al pizzicamento della pelle e alla stimolazione delle dita o della coda, poi posizionate l'animale supino sulla piattaforma di imaginazione.
  3. Spostare la macchina per l'anestesia gassolista dalla camera alla maschera e mantenere una concentrazione anestetica costante dell'1,5% durante tutta la procedura.
  4. Acquisire dati fisiologici (ECG e respirazione) applicando un gel conduttivo al foglio di rame (elettrodi ECG) della piattaforma di imaging e fissando le quattro zampe su di esse.
    NOTA: Mantieni l'isoflurano all'1,5% per il mantenimento e mantieni la temperatura corporea centrale vicino ai 37 °C utilizzando la piattaforma di riscaldamento integrata. Mantieni una frequenza respiratoria target di 100–140 respiri al minuto per garantire la stabilità fisiologica durante l'imaging di esperienza.
  5. Rimuovi i peli del petto applicando una crema depilatoria con un applicatore con punta di cotone.
  6. Asciuga l'eccesso di panna e il pelo sciolto con garze imbevbite d'acqua per prepararti all'immagini.
    NOTA: Rimuovere completamente la crema depilatoria residua per evitare irritazioni o tossicità cutanee.
  7. Applica unguenti ophtalmics lubrificanti sterili su entrambi gli occhi per prevenire l'asciugatura sclerale.
  8. Applicare il gel per la trasmissione per ultrasuoni nell'area anteriore del cuore e posizionare la piattaforma di imaging con un angolo approssimativamente di 30°–45° rispetto all'orizzontale.
    NOTA: Evita le bolle d'aria nel gel per l'ecografia.
  9. Posizionare lentamente il trasduttore a ultrasuoni ad alta frequenza sulla linea parasternale e allinearlo parallelo al torace per ottenere la vista regolata del lungo asse parasternale (PLAX) del ventricolo sinistro (Figura 1A).
  10. Inclina la sonda per garantire un contatto leggero con la parete toracica, evitando la compressione.
  11. Premi il pulsante Bright Mode per passare all'imaging in modalità luminosità.
  12. Regolare l'angolo della sonda e della piattaforma di imaging per localizzare l'arteria coronarica sinistra (LCA).
    NOTA: Identificare il ventricolo sinistro (LV), l'atrio sinistro (LA), la parete anteriore del ventricolare sinistro (LVAW), la parete posteriore del ventricolo sinistro (LVPW), il setto interventricolare (IVS), l'aorta (AO), l'arteria polmonare (PA), la vena polmonare (PV), la valvola mitrale (MV) e il muscolo papillare all'interno della finestra acustica.
  13. Attiva la modalità Doppler a colori premendo il pulsante Doppler a colori sul touchscreen. Nella visualizzazione in tempo reale, il flusso che si allontana dalla valvola aortica (verso la sonda) appare rosso.
  14. Regolare l'angolo e la posizione della sonda per visualizzare l'intera LCA dal seno aortico al sito del ramo distale, minimizzando al massimo l'interferenza del flusso venoso polmonare.
  15. Attiva la modalità Doppler a onda impulsiva (PW). Posizionare la finestra di misurazione del PW parallela alla direzione del flusso sanguigno dell'ACL (Figura 1B,C).
    NOTA: Mantieni l'angolo di insonazione sotto i 60° e applica la correzione dell'angolo in tempo reale allineando il cursore Doppler parallelo al flusso coronarico.
  16. Seleziona Salva clip per catturare la forma d'onda di velocità di flusso LCA di base.
  17. Aumentare la concentrazione di isoflurano al 3% e osservare l'aumento graduale della velocità del flusso coronarico.
  18. Dopo 45 secondi di esposizione continua al 3% di isoflurano, seleziona Salva clip per catturare la velocità del flusso coronarico iperemico.
    NOTA: monitorare continuamente il flusso sanguigno dell'ACL. Se il volume del campione PW si sposta a causa di un movimento respiratorio o cardiaco, si pausa l'acquisizione, si torna alla modalità Doppler a colori per riidentificare l'LCA, riposiziona la porta PW e riprende la modalità PW.
  19. Al completamento, interrompere l'inalazione di isoflurano e rimuovere il gel per ultrasuoni. Metti il mouse su una borsa riscaldante finché non si riprese completamente, poi riportalo nella gabbia.

3. Analisi statistica

  1. Misurazioni medie di tre cicli cardiaci consecutivi tracciate nel software di analisi per ottenere le velocità di flusso di base e picco dell'LCA. Calcola il CFR come il rapporto tra la velocità di flusso coronarico diastolico iperemica di picco e la velocità di flusso coronarico diastolico di base (CFV).
  2. Implementare un progetto doppio cieco tra sperimentatore e analista dati. Valuta la normalità utilizzando il test di Shapiro–Wilk. Analizzare i dati normalmente distribuiti utilizzando un test t di Student non accoppiato a due code. Analizzare dati non normalmente distribuiti utilizzando il test Mann–Whitney U.

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Risultati

In questo studio, 16 topi (HFpEF, n = 8; CTRL, n = 8). L'arteria coronarica sinistra è stata identificata sotto guida Doppler a colori nella visuale del lungo asse parasternale (PLAX), e la velocità del flusso coronarico è stata misurata utilizzando Doppler a onde pulsanti (PW). Dopo l'acquisizione di immagini sufficienti e riproducibili da ciascun topo sia alle concentrazioni di isoflurano all'1,5% (basale) che al 3% (iperemiche),il CFR di 26 è stato determinato ...

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Discussione

Questo studio presenta un protocollo che utilizza un metodo non invasivo, diretto e riproducibile per valutare la disfunzione macro- e microvascolare nei modelli animali HFpEF. L'ecocardiografia Doppler per la valutazione della Riserva di Flusso Coronarico è riconosciuta dalla Società Europea di Cardiologia come metodo validato eriproducibile 15. In condizioni fisiologiche normali nei topi C57BL/6J, la riserva di flusso coronarico è prevista essere ≥2,0. In questo...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non esistono interessi finanziari o commerciali in competizione.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi per Giovani Scienziati Distinti a Nanchino - Progetto Chiave sostenuto dalla Medical Science and Technology Development Foundation, Dipartimento della Salute di Nanchino (JQX22001); Fondazione Scientifica Postdottorato Cina (2023M731631); Finanziamenti per studi clinici dall'Ospedale Drum Tower affiliato, Facoltà di Medicina dell'Università di Nanchino (2024-LCYJ-PY-29); Fondazione di Ricerca della Commissione provinciale del Jiangsu per la salute e la pianificazione familiare (MQ2024049).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Monitor di fisiologia animaleFujifilmVEVO 3100Monitorare la frequenza cardiaca, la frequenza respiratoria e la temperatura corporea
Topi C57GemPharmatech Co., Ltd
FotocameraCanon, GiapponeEOS R50Registra le posizioni della piattaforma di imaging e della sonda ecografica
Crema depilatoriaVeet, franceseDepilazione
GarzaCurityCAR-6339-PKSterile
IsofluranoPREMIOR510-22-10Anestesia
Estere metilico N-nitro-L-arginina (L-NAME)Sigma-AldrichN5751Introduzione al modello di mouse HFpEF
Diete di ricerca, 60% grassi    Research Diets, Inc.   D12492Dieta ricca di grassi
Impasto termostatico chirurgico termicoGlobalebio, CinaGE0-20WControllo della temperatura
Gel per ultrasuoniLaboratori ParkerW60698LGel per trasmissione a ultrasuoni
Platino di imaging preclinico Vevo 3100FujifilmVEVO 3100Ecocardiografia
Software VevoLABFujifilmVevoLAB 3.2.6Analisi dei dati ecocardiografia

Riferimenti

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Disfunzione microvascolare coronaricaischemia miocardicadisfunzione vasomotoriaflusso sanguigno coronaricovasodilatazione da isoflurano

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