In vivo Osservazione non invasiva dei cambiamenti dinamici nel fusto dei capelli, nella melanina e nel collagene durante il ciclo dei follicoli pilosi del topo

Sommario

Questo studio presenta un metodo non invasivo, in vivo , che utilizza microscopia a due fotoni e a seconda generazione armonica per monitorare longitudinalmente la morfologia del fusto pilifero, la dinamica della melanina e la densità del collagene dermico durante l'intero ciclo follicolo pilifero nei topi, fornendo un solido quadro metodologico per la ricerca terapeutica sulla perdita di capelli.

Abstract

Le valutazioni tradizionali del ciclo del follicolo pilifero si basano su metodi istologici invasivi, limitando l'osservazione longitudinale continua. È stato ipotizzato che l'imaging ottico non invasivo, in particolare la fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF) e la generazione del secondo armonico (SHG), possano tracciare e quantificare con precisione i cambiamenti dinamici in vivo nei fusti dei capelli, nella melanina e nel collagene attraverso più cicli follicologici. I fusti di capelli dei topi C57BL/6 sono stati monitorati in vivo durante le fasi anagene, catagenica e telogena tramite dermoscopia, fotografia e microscopia elettronica. In particolare, TPEF sotto eccitazione e imaging a 800 nm sono stati utilizzati per quantificare la dinamica della melanina, mentre SHG sotto eccitazione a 950 nm è stato utilizzato per osservare i cambiamenti interfollicolari del collagene. Per garantire accuratezza, le misurazioni ottiche in vivo sono state convalidate incrociata: la dinamica della melanina è stata confermata tramite fotografie cutanee per l'aspetto complessivo del tessuto e colorazione di ematossilina ed eosina (HE) per l'espressione dei bulbi civellosi, mentre i cambiamenti del collagene sono stati convalidati valutando la densità e l'orientamento delle fibre utilizzando un sistema di imaging polarizzante a cristalli liquidi su sezioni colorate con Sirius Red. Le osservazioni dei risultati hanno dimostrato che durante la fase anagene, il diametro del fusto del pelo e la produzione di melanina aumentavano progressivamente, accompagnati da una significativa riduzione della densità di collagene interfollicolare. Durante le fasi catagenica e telogena, i livelli di melanina sono diminuiti gradualmente e la densità del collagene è tornata gradualmente ai livelli di base. Questo progetto stabilisce una metodologia in vivo validata e non invasiva per valutare la dinamica completa dei follicoli piliferi, fornendo un solido quadro sperimentale per la valutazione preclinica degli agenti attivi nei trattamenti della perdita di capelli.

Introduzione

I follicoli piliferi dei topi C57BL/6 mostrano sincronicità e regolarità, offrendo comodità sperimentale e rendendoli un modello animale comune per lo studio delle malattie della pelle ^1,2. I follicoli piliferi entrano nella seconda fase telogena nella settima settimana dopo la nascita del topo C57BL/6³. In assenza di interventi artificiali, questa fase telogena si mantiene fino alla dodicesima settimana dopo^{il parto 4}. Questo periodo prolungato di telogen è un punto temporale comune utilizzato nella ricerca per sincronizzare il ciclo di crescita del follicolo^{pilifero 5}. Dopo la depilazione artificiale dei topi, i follicoli piliferi iniziano immediatamente a entrare nella fase^{anagene 6}.

Dopo l'ingresso nella fase di crescita, le cellule staminali nella regione del rigonfiamento proliferano e si differenziano nella guaina radicolare esterna, crescendo verso il basso per aumentare la lunghezza del^{follicolo 7}. La base del fusto del pelo si estende verso l'alto mentre il follicolo si^{approfondisce.} Le cellule staminali nel bulbo si differenziano continuamente nel fusto del pelo e nella guaina radicolare^{interna 9}. La secrezione di collagene e melanina nella pelle cambia rapidamente durante la fase^{anagene 10}, svolgendo un ruolo importante nello sviluppo dei follicoli^{piliferi 11,12}. Negli studi relativi alla perdita di capelli, la secrezione di melanina viene generalmente valutata tramite il colore della pelle, che non consente una quantificazione precisa¹³. Finora, la ricerca sul collagene si è concentrata prevalentemente sullo sviluppo e l'invecchiamento piuttosto che sulle dinamiche cicliche della quantificazione.

Attualmente, un importante limite nella valutazione dei cicli dei follicoli piliferi e delle terapie rigenerative è la dipendenza da endpoint istologici distruttivi, che richiede l'eutanasia di diverse coorti di animali in momenti temporali^{specifici 14}. Questo impedisce il monitoraggio longitudinale continuo dello stesso microambiente follicolare su più cicli. Inoltre, le tecniche convenzionali non invasive come la dermatoscopia mancano di sufficiente penetrazione tissutale per visualizzare i cambiamenti profondi dei^{follicoli 15}, e l'osservazione macroscopica non quantifica con precisione la melanina, rendendo difficile rilevare la radice carente di melanina del peli a clava durante le fasi di regressione tardiva e^{riposo 16,17}. Mentre varie tecnologie ottiche hanno fatto progressi nell'osservazione longitudinale in vivo ^18,19, come la polarimetria a cristalli liquidi per la valutazione delle fibre di^{collagene 20,21}, la microscopia confocale cutanea per osservare la pigmentazione^22,24 e la tomografia di coerenza ottica per misurare lo spessore ^{cutaneo 25,26,27}, la microscopia multifotonica offre una soluzione unicamente convincente. L'uso combinato della fluorescenza a due fotoni eccitata (TPEF) e della generazione a seconda armonica (SHG) offre vantaggi distinti: consente una sezionazione ottica ad alta risoluzione e senza etichette in profondità nel derma, consentendo la quantificazione simultanea in vivo dell'autofluorescenza della melanina e dell'architettura delle fibre di collagene senza coloranti esogeni ^28,29. In questo studio, gli autori ipotizzano che l'imaging non invasivo TPEF/SHG possa quantificare dinamicamente e con precisione questi cambiamenti strutturali con un'accuratezza paragonabile a quella degli standard istologici invasivi. Affrontando questo problema scientifico chiave, questo studio mira a stabilire un solido quadro longitudinale di imaging in vivo per supportare la valutazione non invasiva degli agenti terapeutici per l'alopecia³⁰.

Protocollo

Tutti i metodi che prevedono l'uso di soggetti vertebrati sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali. Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali del Centro di Ricerca Sperimentale dell'Accademia Cinese delle Scienze Mediche Cinesi (Codice Protocollo: ERCCACMS11-2210-03). Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Preparazione degli animali e osservazione macroscopica
Maschi C57BL/6 topi, di età compresa tra 6 e 7 settimane e con un peso di 20 ± 2 g, sono stati ottenuti da un fornitore commerciale. I topi sono stati suddivisi in una coorte di analisi istologica (n = 39) e una coorte continua di imaging in vivo (n = 3). I peli dorsali di tutti i topi venivano depilati per sincronizzare il ciclo follicole. Lo stato di crescita dei peli è stato esaminato a giorni alterni dal giorno 2 al giorno 26 dopo la depilazione. La schiena dei topi della coorte di imaging è stata fotografata a giorni alterni fino al giorno 26 con una macchina fotografica. È stata mantenuta una distanza focale fissa di 15 cm e sono state garantite condizioni di illuminazione ambientale standard e costanti per documentare accuratamente i cambiamenti macroscopici.

In vivo Imaging TPEF e SHG
Le sessioni di imaging sono state eseguite nei giorni 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26 dopo la depilazione. I topi sono stati anestetizzati usando isoflurano. La perdita completa di coscienza veniva assicurata osservando la frequenza respiratoria e testando il riflesso del piede con una leggera pizzicatura al dito del piede. Il topo anestetizzato fu fissato sul palco di un microscopio a due fotoni. Per l'imaging TPEF della melanina, il microscopio era dotato di un obiettivo di immersione in acqua 25x (apertura numerica = 1,05), e la lunghezza d'onda di eccitazione era impostata a 800 nm. È stata eseguita una scansione a pila z dell'autofluorescenza della melanina, raggiungendo una profondità totale di scansione di 45 μm. La dimensione del passo era impostata a 2 μm, la risoluzione dell'immagine a 1.024 × 1.024 pixel e la velocità di acquisizione a 4 μs/pixel. Per l'imaging SHG delle fibre di collagene, la lunghezza d'onda di eccitazione è stata regolata a 950 nm utilizzando lo stesso obiettivo di immersione in acqua di 25x. È stata avviata una scansione a z-stack dalla superficie superiore del derme fino a una profondità totale di scansione di 45 μm, mantenendo una dimensione di passo di 2 μm, una risoluzione dell'immagine di 1.024 × 1.024 pixel e una velocità di acquisizione di 4 μs/pixel. Dopo la sessione di imaging, il topo è stato accuratamente rimosso dalla fase del microscopio, l'isoflurano è stato interrotto e il topo è stato posto su un tappetino riscaldante fino a quando non ha ripreso completamente conoscenza prima di essere riportato nella gabbia domestica.

Raccolta dei tessuti e elaborazione istologica
Una coorte distinta e separata di tre topi del gruppo istologico è stata eutanasiata a giorni alterni dal giorno 2 al giorno 26, secondo le linee guida istituzionali, assicurando che nessun topo fosse riutilizzato per il campionamento istologico longitudinale. Un campione di tessuto cutaneo dorsale di 2 cm × 2 cm a spessore completo, centrato precisamente all'intersezione tra le linee medie orizzontali e verticali sul dorso di ciascun topo, è stato chirurgicamente espulso. Il tessuto cutaneo espulso veniva posizionato piatto su un cartoncino duro per evitare l'arricciamento dei bordi e subito immerso in una provetta contenente il 4% di paraformaldeide. I tessuti fissi furono disidratati e incorporati per preparare sezioni di paraffina spesse 6 μm. Prima della decerificazione, le sezioni in paraffina sono state riscaldate su un scaldatore per 120 minuti. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (HE) e Sirius Red utilizzando kit di colorazione standard secondo le istruzioni del produttore. Le sezioni venivano montate con gomma neutra e osservate con un microscopio rovesciato. Per l'imaging polarizzato a cristalli liquidi, le sezioni de-waxed e Sirius Red-tinted sono state fotografate al microscopio a luce polarizzata. Un angolo di polarizzatore unificato veniva stabilito attraversando il polarizzatore e l'analizzatore a esattamente 90° per ottenere uno sfondo (stato di estinzione) al massimo del più scuro, e questo angolo specifico veniva costantemente bloccato per tutte le successive catture dell'immagine.

Dermoscopia in vivo e microscopia elettronica dei fusti di capelli
Prima della staccatura, l'area di crescita dei peli dorsali è stata valutata in vivo utilizzando un dermatoscopio clinico con un ingrandimento di 20x. La rigenerazione dei capelli è stata quantificata utilizzando un sistema standard di punteggio 0–3 basato sull'emergenza e densità del fusto dei capelli (0 = nessun pelo visibile; 1 = emergenza di capelli rada; 2 = densità moderata dei capelli; 3 = denso e copertura completa dei capelli). Per garantire un campionamento imparziale, l'area depilata dorsale di ciascun topo è stata visivamente divisa in quattro quadranti uguali. Un generatore di numeri casuali veniva utilizzato per selezionare due quadranti per ogni topo, e cinque nuovi fusti di capelli cresciuti venivano fermamente raccolti da ciascun quadrante selezionato usando pinze sterili. I fusti di capelli strappati sono stati immediatamente immersi e fissati nel glutaraldeide al 2,5% in un tampone fosfato di 0,1 M (pH 7,4) per 4 ore a 4 °C per preservare l'ultrastruttura. I fusti fissi del pelo sono stati lavati tre volte in un tampone fosfatico a 0,1 M e disidratati successivamente attraverso una serie di etanolo classificato (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 15 minuti a ciascuna concentrazione, seguiti da un'asciugatura nei punti critici usando_CO2 liquido. I fusti di capelli secchi erano montati orizzontalmente su nastro in carbonio conduttivo a doppia faccia fissato a moconi di alluminio. I campioni sono stati rivestiti a sputter con uno strato d'oro da 10 nm utilizzando un rivestimento a vuoto per 60 secondi per evitare la carica degli elettroni. I campioni rivestiti venivano inseriti in un microscopio elettronico a scansione e i fusti di capelli venivano osservati utilizzando una tensione di accelerazione di 5,0 kV. I cambiamenti morfologici ultramicroscopici sono stati valutati sistematicamente catturando immagini a ingrandimenti di 500x e 1.000x, documentando specificamente il diametro del fusto del pelo e l'integrità strutturale e la disposizione delle scaglie cuticolari.

Dati e analisi statistica
I parametri dell'immagine venivano misurati e quantificati utilizzando software generici di analisi delle immagini. Tutte le analisi statistiche e le rappresentazioni grafiche sono state condotte utilizzando software standard di analisi statistica. Per i dati di monitoraggio continuo in vivo ottenuti dagli stessi animali in più momenti temporali, è stata determinata la significanza statistica utilizzando l'analisi della varianza a misure ripetute (RM-ANOVA) seguita dal test post-hoc di Bonferroni. Per i dati istologici che coinvolgono campioni animali indipendenti, è stata utilizzata una normale ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc di Tukey per valutare le differenze statistiche. Tutti i risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). Le differenze sono state considerate statisticamente significative a *p < 0,05, p < 0,01 e ***p < 0,001.

Risultati

Osservazione dei peli del topo
Le osservazioni fotografiche della crescita dei peli murini sono presentate nella Figura 1A. L'emergere dei peli attraverso la superficie cutanea è iniziata al giorno 10, con uno sviluppo continuato mantenuto tra il giorno 12 e il giorno 16 (p < 0,05). La copertura dei capelli si è poi stabilizzata dal giorno 18 al giorno 26 (p > 0,05) (Figura 1B). Inoltre, la ...

Discussione

Il modello topino C57BL/6 è stato scelto perché la sua seconda fase telogen dura stabilmente dalla settimana 7 alla settimana 12. Poiché la finestra di osservazione di 26 giorni rientra interamente in questa fase statica, i profondi cambiamenti dinamici osservati sono esplicitamente guidati dalla progressione del ciclo indotta dalla depilazione, escludendo completamente le fluttuazioni naturali legate all'età. Quando la depilazione viene eseguita durante la fase telogena, i follicoli pil...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi C57BL/6	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	SCXK (Jing) 2021-0006	Usati per modelli animali
Fotocamera DSLR digitale	Canon	EOS 80D	Utilizzata per scattare fotografie del dorso dei topi
Kit di colorazione H&E	LtdSolarbio Science & Technology Co.	G1120	Utilizzato per la colorazione di sezioni tissutali
Microscopio invertito	Olympus	BX51	Utilizzato per scattare foto
Isoflurano	RWD Life Science Co.	R510-22-16	Utilizzato per anestetizzare gli animali
Mai Tai DeepSee	SpectraPhysics	Mai Tai HP	Utilizzato per TPEF e SHG nell'imaging in vivo
Dermatoscopio elettronico medico	China Chuanghong Medical Technology Co.	CH-DSIS-2000	Utilizzato per l'imaging in vivo del colore della pelle
Microscopio a luce polarizzata	Olympus	BX51-P	Utilizzato per l'imaging della colorazione Sirius Red
Microscopio elettronico a scansione (SEM)	Hitachi High-Tech Corporation	SU8010	Per l'osservazione dell'ultrastruttura del fusto pilifero
Kit di colorazione Sirius Red	Solarbio	G1472	Per la colorazione delle fibre di collagene
Macchina per l'anestesia di piccoli animali	RWD Life Science Co.	R500	Utilizzato per anestetizzare gli animali