Articolo metodologico

Stabilimento di un modello di immunosoppressione indotta dalla sepsi nel topo tramite instillazione intranasale di batteri

DOI:

10.3791/70150

⸱

12 giugno 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Burns and Combined Injury, Army Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Daping Hospital, Army Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per stabilire un modello di immunosoppressione per la sepsi del topo tramite instillazione intranasale di Klebsiella pneumoniae e convalidiamo il modello attraverso vari indicatori.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sepsi è un'insufficienza d'organo potenzialmente letale causata dalla risposta inappropriata dell'ospite all'infezione. La polmonite è la causa principale della sepsi. I modelli animali sono strumenti importanti per studiare la patogenesi della sepsi e valutare nuove strategie di trattamento. I modelli animali precedenti di sepsi mancavano di vie naturali di infezione, rendendo difficile riflettere accuratamente il processo clinico di infezione.

Questo studio ha introdotto un modello di immunosoppressione per la sepsi nei topini, stabilito tramite instillazione intranasale di Klebsiella pneumoniae (KP) per simulare la via naturale dell'infezione respiratoria. Dopo la modellazione con diverse concentrazioni di KP, l'infiammazione del modello è stata valutata a 12 ore per i livelli di interleucina-6 di citochine-6 (IL-6), mentre i danni agli organi sono stati valutati a 24 ore per i livelli di alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), creatina chinasi (CK) e azoto ureico nel sangue (BUN). Il tasso di sopravvivenza del modello è stato analizzato dopo 7 giorni. La percentuale di linfociti e globuli bianchi, la proporzione di espressione del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II) nei monociti e l'intensità media di fluorescenza (MFI) di IL-10 e TGF-β1 nelle cellule T CD4+ sono state osservate per valutare la soppressione immunitaria nei topi. Dopo 7 giorni di modellazione, è stata eseguita un'infezione secondaria tramite instillazione intranasale di Pseudomonas aeruginosa (PA). Il carico batterico nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) 24 ore dopo l'infezione secondaria e il tasso di mortalità entro 14 giorni sono stati valutati per valutare ulteriormente la immunosoppressione del modello.

L'instillazione nasale di Klebsiella pneumoniae ad alta concentrazione può indurre efficacemente una immunosoppressione. Il suo scopo è simulare la sepsi indotta da una via naturale di infezione respiratoria e fornire un modello standard per la ricerca sulla sepsi negli animali.

Introduzione

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La sepsi è un'insufficienza d'organo potenzialmente letale derivante dalla risposta inappropriata dell'ospiteall'infezione 1,2,3. È una delle principali cause di morte nelle unità di terapia intensiva (ICU). A livello globale, ogni anno si registrano 48,9 milioni di casi di sepsi, con 11 milioni di decessiassociati 4. Nonostante i recenti progressi nella terapia anti-infettiva e nelle tecnologie di supporto agli organi, la patogenesi della sepsi rimane incompletamente compresa e mancano opzioni di trattamento specifiche. Di conseguenza, la sepsi è diventata un focus e una sfida chiave nella ricerca medicaclinica 4.

I modelli animali svolgono un ruolo insostituibile nella ricerca medica di base e traslazionale, fungendo da strumenti essenziali per indagare la patogenesi della sepsi e valutare nuove strategie terapeutiche. Simulando i processi fisiopatologici della sepsi umana, questi modelli non solo facilitano l'esplorazione di meccanismi chiave come disturbi immunitari e disfunzioni degli organi, ma forniscono anche una piattaforma sperimentale per lo screening farmacologico e lo sviluppo di strategie di intervento. Tra i vari modelli animali, i topi sono i più comunemente utilizzati nella ricerca sulla sepsi grazie al loro background genetico ben definito, alle ricerche approfondite sul sistema immunitario e alla facilità di manipolazione.

Attualmente sono disponibili diversi modelli animali per sepsi basati su diversi paradigmi, tra cui modelli di endotossina, modelli di infusione batterica, modelli di legatura e puntura cecalare (CLP) e modelli di peritonite per stent del colon ascendente (CASP) 5. Tuttavia, questi modelli non dispongono di vie naturali di infezione, rendendo difficile riflettere davvero il processo clinico di infezione. Negli Stati Uniti gli studi hanno riportato che la polmonite è la causa principale disepsi 6. Pertanto, stabilire un modello di sepsi nei topini che imiti le vie naturali di infezione, presenti caratteristiche immunosoppressive e sia facile da operare con alta riproducibilità è di grande importanza per una ricerca approfondita sui meccanismi immunitari della sepsi e per valutare potenziali strategie di intervento.

Klebsiella pneumoniae (KP) rappresenta dal 3% all'8% di tutte le infezioni batteriche acquisitein ospedale 7,8,9. Questo batterio può entrare nel corpo attraverso vari portali, tra cui le vie respiratorie, gastrointestinali e urinarie, così come la pelle, e le infezioni causate dalla KP hanno una prognosi negativa, specialmente nei pazientiimmunodepressi 7,10. Dato che la polmonite è la principale causa di sepsi e la KP è un patogeno respiratorio comune associato a esiti negativi, la KP è un candidato ideale per stabilire un modello di sepsi clinicamente rilevante.

Sebbene in precedenza siano stati stabiliti diversi modelli animali di infezione da KP, incluso il metodo intranasale, solo pochi studi si sono concentrati sull'ottimizzazione del modello per indurre l'immunosoppressione associata alla sepsi o sulla definizione della concentrazione ottimale di KP per l'istituzione del modello. Questa lacuna limita l'utilità dei modelli KP esistenti nello studio della disfunzione immunitaria indotta dalla sepsi.

Per rispondere a questa esigenza, abbiamo stabilito un modello di immunosoppressione indotta dalla sepsi nei topi tramite instillazione intranasale di KP. Rispetto ai modelli esistenti, questo modello simula le vie naturali delle infezioni respiratorie. Il modello è stato ulteriormente convalidato per fornire un metodo per ricerche successive.

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Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali descritte in questo articolo sono state approvate dal Comitato per il Benessere e l'Etica degli Animali da Laboratorio della Terza Università Medica Militare (SCXK(PLA)20120031).

1. Animali sperimentali

  1. Utilizzare topi C57BL/6 maschi, di età compresa tra 8 e 10 settimane, con un peso di 23–28 g (Licenza animale n.: SCXK (Xiang) 2019-0004). Ospita i topi in un ambiente specifico privo di patogeni (SPF) con libero accesso a cibo e acqua. Mantenere le condizioni abitative come segue: temperatura ambiente di (24 ± 2ºC), umidità del 50%–55% e un ciclo chiaro-buio di 12 h/12 h.

2. Preparazione batterica

  1. Usa un ceppo adatto. Qui, utilizza il ceppo 43816 della American Type Culture Collection (ATCC) di Klebsiella pneumoniae .
  2. Prepara un mezzo di coltura appropriato (brodo Luria-Bertani [LB]).
  3. Prepara i batteri per l'instillazione.
    1. Scegli una singola colonia e inoculala in 5 mL di LB di brodo, poi incuba durante la notte (12 ore) in uno shaker a 37 °C e 220 giri al minuto.
    2. Trasferire la coltura batterica notturna al brodo fresco LB e coltura per 3–4 ore fino a raggiungere la fase di crescita ad alta densità (densità ottica a 600 nm [OD600] ≈ 0,8).
    3. Dopo aver diluito la soluzione batterica, prendi 100 μL e aggiungili sul fondo della teglia di coltura contenente il mezzo solido per coltura. Metterlo in un incubatore a 37 °C per 12 ore, contare il numero di colonie e ottenere la concentrazione di KP a 2 × 109 CFU/mL, cioèOD 600 ≈ 0,8.
    4. Regola la concentrazione dei batteri usando una soluzione di NaCl allo 0,9%. Prepara tre sospensioni batteriche con concentrazioni di 1 × 108 CFU/mL, 1 × 106 CFU/mL e 1 × 104 CFU/mL per un uso successivo.

3. Infezione da instillazione intranasale (Figura 1)

  1. Anestetizzare il topo tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 2% a una dose di 2 μL/g (Figura 1A,B).
  2. Quando il topo mostra una coscienza ridotta ma mantiene il riflesso di deglutizione, aspirare 50 μL della sospensione batterica (o soluzione di NaCl allo 0,9% come controllo) utilizzando una micropipetta.
  3. Tieni delicatamente il collo del topo con il pollice posizionato sulla parte anteriore del manico e afferra delicatamente il corpo del topo con il resto delle dita. Inclina la testa del mouse all'indietro (Figura 1C).
  4. Instillare lentamente la sospensione batterica nelle narici del topo usando una pipetta (circa 5–10 μL per goccia). Inserisci una goccia in una narice alla volta (Figura 1D).
  5. Dopo aver osservato che il topo ha inalato la sospensione, sollevare rapidamente il topo verso l'alto e poi abbassarlo lentamente per favorire l'inalazione della sospensione nei bronchi (Figura 1E,F).
  6. Ripeti i passaggi sopra, alternando le instillazioni nell'altra narice finché il topo non ha completamente inalato la sospensione batterica da 50 μL.
  7. Se il topo tossisce, sospira o non riesce a inalare la soluzione batterica durante l'operazione, lascia che il topo riposi e osserva. Dopo che la situazione si è stabilizzata, continua la fase di inalazione per assicurarti che il topo inali tutta la soluzione batterica (o 0,9% di NaCl).
  8. Fissa il mouse in posizione supina su una tavola inclinata a 60°. Se la temperatura della stanza è bassa, usa un riscaldamento per aiutare il topo a riprendersi. Monitora il topo finché non si riprende completamente dall'anestesia, poi riportalo nella gabbia con condizioni di temperatura ottimali, acqua e cibo sufficienti.

4. Valutazione del modello

NOTA: Quattro gruppi di modelli murini sono stati stabiliti tramite il metodo di instillazione intranasale menzionato, ovvero il gruppo di controllo (gruppo A, instillato con PBS), il gruppo di concentrazione 1 × 10da 4 KP (gruppo B), il gruppo di concentrazione 1 × 10da 6 KP (gruppo C) e il gruppo di concentrazione 1 × 10da 8 KP (gruppo D). Il modello è stato valutato utilizzando i seguenti metodi:

  1. Valuta gli indicatori infiammatori a 12 ore.
    1. A 12 ore dall'instillazione intranasale della KP, si raccoglie sangue (≥ 300 μL) tramite puntura cardiaca (n = 5 per gruppo). Separare il siero tramite centrifugazione (1000 × g, 10 min) e usarlo per la rilevazione della citochina interleucina-6 (IL-6).
  2. Valutazione dei danni agli organi 24 ore su 24
    1. A 24 ore dall'instillazione intranasale di KP, si utilizza il siero per la rilevazione degli indicatori biochimici (n = 5 per gruppo). Tra questi indicatori, si utilizza alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) per valutare i danni epatici, creatina chinasi (CK) per i danni muscolari e azoto ureico nel sangue (BUN) per i danni renali.
  3. Valutazione dei sintomi
    1. Monitora quotidianamente il peso corporeo del topo e osserva le condizioni dei peli, il livello di attività e altri parametri.
  4. Citochine a 7 giorni e cellule immunitarie
    1. A 7 giorni dalla modellazione (n = 10 [A/B], n = 15 [C], n = 40 [D]), si raccolga il sangue periferico tramite puntura cardiaca per l'analisi della citometria a flusso per valutare le percentuali di linfociti, la proporzione di espressione del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II) nei monociti, la media di intensità di fluorescenza MFI di IL-10 e TGF-β1 nelle cellule T CD4+ .
    2. Lavorazione dei tessuti
      1. Miscelare campioni di sangue (100 μL) con tampone per la lisi dei globuli rossi (300 μL) a un rapporto di volume di 1:3. Dopo 15 minuti di lisi eritrocita a temperatura ambiente, centrifugare la miscela a 400 × g per 5 minuti e scartare il soprannatante.
      2. Risospendere il pellet in 200 μL di tampone di lisi dei globuli rossi (rapporto di volume = 1:2) e incubare per 10 minuti per la lisi secondaria.
      3. Dopo un'altra centrifugazione a 400 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di tampone di colorazione cellulare.
      4. Aggiungere 1 μL di ciascun anticorpo di citometria di flusso ai campioni. Brevemente, aggiungere CD45 per la colorazione dei linfociti; Anticorpi CD45, CD116, Ly6G, Ly6C e MHC-II per la rilevazione di MHC-II; Anticorpi CD45, CD3, CD4, CD8 e CD25 per la misurazione di IL-10 e TGF-β1. Il rapporto di diluizione per ciascun anticorpo elencato sopra è 1:100.
      5. Incubare tutti i campioni a 4 °C per 30 minuti al buio. Successivamente, aggiungere 1 mL di tampone per colorazioni cellulari, poi centrifugare a 400 × g per 5 minuti; Scartate il soprandatante.
      6. Per la rilevazione di linfociti e MHC-II, si risospendono 400 μL di tampone di colorazione cellulare prima dell'analisi della citometria a flusso.
      7. Successivamente, eseguire procedure per il rilevamento di IL-10 e TGF-β1 seguendo i passaggi 4.4.2.8–4.4.2.12:
      8. Aggiungi 1 mL di buffer di fissazione e incuba i campioni a 4ºC al buio per 60 minuti.
      9. Dopo aver aggiunto 1 mL di tamponamento permanente, centrifugare la miscela a 400 × g per 5 minuti e eliminare il soprandante.
      10. Risospendere la pellet cellulare in 100 μL di tampone permanente, seguita dall'aggiunta di 1 μL ciascuno degli anticorpi Foxp3, IL-10 e TGF-β1. Incubare i campioni a 4 °C per 30 minuti al buio.
      11. Successivamente, aggiungi 1 mL di tampone permanente e centrifuga a 400 × g per 5 minuti prima di rimuovere il soprandante.
      12. Infine, risospendere le cellule in 400 μL di tampone di colorazione cellulare e rilevare tramite citometria a flusso.
    3. Strategia di cancellazione
      1. Per rilevare linfociti, escludere detriti e doppietti sul grafico FSC-A/FSC-H. Identificare il totale dei leucociti come eventi CD45⁺. Porta i linfociti in base a bassi FSC/SSC all'interno della popolazione CD45⁺.
      2. Per rilevare MHC-II, si introdurranno prima i leucociti a gate su FSC-A/SSC-A per escludere i detriti, seguiti dalla selezione delle cellule CD45⁺. Identificare le cellule mieloidi come CD11b⁺, con i neutrofili esclusi dalla negatività di Ly6G. Definire i monociti classici come cellule Ly6G⁻ Ly6Chi e valutare l'espressione di MHC-II all'interno di questa popolazione.
      3. Per rilevare IL-10 e TGF-β1, escludere detriti e doppietti tramite FSC-A/SSC-A e FSC-A/FSC-H. Identificare le cellule T totali come eventi CD45⁺CD3⁺. All'interno della popolazione CD4⁺CD8⁻, identificare i Treg come cellule CD25⁺FOXP3⁺. Quantificare le cellule TGF-β⁺ nel sottoinsieme Treg e valutare l'espressione di IL-10 in tutte le cellule T CD4⁺. Imposta tutte le porte positive usando i controlli FMO.
  5. Conteggio batterico nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) a 24 ore dopo un'infezione secondaria
    1. Al giorno 7 dopo l'istituzione del modello (n = 5 [A/B], n = 10 [C], n = 40 [D]), si sottopone il topo a un'instillazione intranasale di 50 μL di Pseudomonas aeruginosa (PA) (a una concentrazione di 6,8 ×10 CFU /mL) utilizzando il metodo di instillazione intranasale menzionato.
    2. A 24 ore dall'infezione secondaria da PA, raccogliere 1,5 mL di liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF). Diluire serialmente il BALF, impiattarlo su un mezzo liquido LB e incubarlo in un incubatore a temperatura costante a 37 °C per 24 ore prima del conteggio della colonia.
    3. Segui questi passaggi per la raccolta dei BALF.
      1. Anestesiare profondamente (2,5 μL/g 2% pentobarbital di sodio) o eutanasiare (7,5 μL/g 2% pentobarbital di sodio) in modo umano e posizionarlo in posizione supina con il collo iperesteso.
      2. Fai un'incisione cervicale mediana per esporre la trachea. Inserisci un catetere smussato 24-G nella trachea appena oltre la carina e fissalo con una sutura.
      3. Immergi lentamente e ritira delicatamente PBS sterile e gelida (0,5 mL per aliquota) usando una siringa da 1 mL. Ripeti questo ciclo di lavaggio 3–5 volte. Esegui questo processo 3 volte, ottenendo un volume totale di lavaggio di 1,5 mL.
  6. Analisi della sopravvivenza
    1. Utilizzare una coorte separata di topi per l'analisi di sopravvivenza (n = 10 [A/B/C], n = 40 [D]).
    2. Registra lo stato di sopravvivenza dei topi entro 7 giorni dall'infezione.
    3. Dopo l'infezione secondaria da PA, si osserva il tasso di mortalità dei topi dal giorno 7 al giorno 14.
    4. Dopo l'osservazione, si anestetizzano profondamente i topi con isoflurano (5%) e li si sopporta tramite iniezione intraperitoneale di un'overdose di pentobarbital sodio (150 mg/kg), con la morte confermata da lussazione cervicale.
  7. Analisi statistica
    1. Eseguire test di normalità e di omogeneità di varianza sui dati quantitativi.
    2. Per confronti tra gruppi, si utilizza l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) se i dati sono normalmente distribuiti e presentano varianza omogenea; altrimenti, usa test non parametrici.
    3. Eseguire un'analisi di sopravvivenza utilizzando il metodo Kaplan-Meier. Utilizzare i modelli a effetti misti per testare le differenze nei cambiamenti di peso corporeo tra gruppi in diversi momenti temporali. Consideriamo un valore p ≤ 0,05 statisticamente significativo.

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Risultati

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A 12 ore dall'instillazione intranasale, il livello siero di IL-6 nel gruppo 1 × 108 KP è aumentato significativamente (p < 0,0001, n = 5) (Figura 2A). A 24 ore dall'instillazione intranasale, i livelli sierici di ALT (p < 0,01, n = 5) (Figura 2B), AST (p < 0,01, n = 5) (Figura 2C), CK (p < 0,01, n = 5) (Figura 2D) e BUN (p < 0,001, n = 5) (

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Discussione

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La sepsi è una sindrome clinica complessa, e lo stato immunosoppressivo caratteristico durante la sua fase avanzata è un fattore chiave che porta alla morte del paziente12,13. Pertanto, modelli preclinici che simulano accuratamente la fisiopatologia dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi sono fondamentali per un'esplorazione approfondita dei suoi meccanismi e per lo sviluppo di nuove terapie. In questo studio, abbiamo stabil...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82222038 e 81970259), dagli Outstanding Young Talents of National Defense Biotechnology (2023-JCJQ-ZQ-001 e 01-SWKJYCJJ06) e dal Chongqing Science Fund for Distinguished Young Scholars (CSTB2022NSCQ-JQX0017).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Biochemical incubatorYSEISHH-150LIncubazione batterica
Topi C57BL/6JVital River Laboratories8-10 settimane, maschio
CD116bBioLegend101257Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
CD25BD bioscience740447Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
CD3BioLegend100203Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
CD4BioLegend100544Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
CD45BioLegend103116Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
CD8BioLegend100752Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
Cell stain buffer BioLegend420201
Agitatore a temperatura costanteHonourHNY-100BColtivazione batterica
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEXAnalisi di flow cytometry
Centrifugatrice ad alta velocitàBeckman CoulterAIIEGRA
IDEXX catalyst oneIDEXXCatalyst OneAnalisi biochimiche
IL-10BioLegend505026Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
Seringa per insulina WEGO1mLRaccolta del sangue
Klebsiella pneumoniae ATCC 43816biobw.orgbio-81659
LB Broth (polvere)SolarbioL1010LB liquid culture medium
LB Broth (polvere)SolarbioL1015LB agar plate
LY6CBioLegend128010Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
Ly6GBioLegend127606Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
MHC-IIBioLegend107622Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
MicropipetteEppendorfP100
Buffer per lisi dei globuli rossiSolarbioR1010
SpectrophotometerEppendorfEppendorf6131Misura della densità ottica
Software statisticoGraphPad SoftwareGraphpad Prism10.0
Pipette sterili e prive di enzimiBiosharp200μL
TF diluent bufferBD Pharmingen51-90008101
TF fix/perm bufferBD Pharmingen51-90008100
TF perm/wash bufferBD Pharmingen51-90008102
TGF-β1BioLegend141406Anticorpi per flow cytometry (Anti-Mouse)
Varioskan LUX multimodemicroplate readerThermo ScientificVarioskan LUX 

Riferimenti

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