Imaging a superrisoluzione e gestione condivisa: un protocollo per la microscopia confocale con rilevamento multiplex

Summary

Questo protocollo dettaglia le applicazioni avanzate di imaging e la gestione delle risorse condivise di un sistema di microscopio confocale a scansione laser integrato con un rivelatore a matrice multiplexata per imaging cellulare e subcellulare ad alta risoluzione. Il flusso di lavoro consente imaging multimodale da confocale a super-risoluzione (~120 nm) all'interno di un'unica piattaforma, rendendo la visualizzazione su scala nanometrica più accessibile.

Abstract

La microscopia a super-risoluzione (SRM) supera il limite di diffrazione della microscopia a luce convenzionale, permettendo la visualizzazione su scala nanometrica delle strutture subcellulari. Tuttavia, l'adozione diffusa di tecniche come la microscopia a esaurimento di emissione stimolata (STED), la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM) / la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) e la microscopia a illuminazione strutturata (SIM) può essere ostacolata da fattori come un'elevata fototossicità, la preparazione specializzata del campione o l'operazione complessa. Qui presentiamo un protocollo completo che sfrutta una piattaforma confocale a scansione laser integrata con un rivelatore multiplexato a super-risoluzione. Questo sistema, combinato con l'elaborazione computazionale, consente una transizione diretta tra imaging confocale e super-risoluzione all'interno dello stesso flusso di lavoro. Il protocollo offre un approccio intuitivo per immagini rapide, ad alta risoluzione e a bassa fototossicità. Il metodo dettagliato comprende capacità di imaging multimodale, tra cui fluorescenza multicolore, contrasto differenziale di interferenza (DIC), ricostruzione tridimensionale dello stack Z, imaging live-cell in time-lapse, tiling su grandi aree e varie modalità di super-risoluzione offerte dal rivelatore a matrice multiplexata. Confronti sistematici dimostrano che le modalità a super-risoluzione raggiungono una risoluzione laterale di circa 120 nm, rappresentando un miglioramento di circa due volte rispetto al limite di diffrazione della microscopia a campo ampio convenzionale e un miglioramento significativo sia della risoluzione che del rapporto segnale-rumore (4-8 volte) rispetto al funzionamento confocale standard sulla stessa piattaforma. La discussione copre anche i punti chiave di un modello condiviso di gestione delle risorse essenziale per supportare il funzionamento sostenibile di questa tecnologia. Questa guida integrata rappresenta una risorsa preziosa sia per ricercatori nuovi che esperti e per i responsabili di strutture che mirano ad adottare e massimizzare il potenziale di questa forma accessibile di imaging avanzato nella ricerca nelle scienze della vita.

Introduction

La visualizzazione delle strutture subcellulari dinamiche è fondamentale per far avanzare la ricerca nelle scienze della vita. Tuttavia, la risoluzione della microscopia ottica tradizionale è limitata dalla diffrazione a circa 200 nm lateralmente, limitandone la capacità di risolvere processi subcellulari dinamici. Per superare questa barriera, sono state sviluppate varie tecniche di super-risoluzione. Tuttavia, tecniche come la microscopia STED, PALM/STORM e SIM spesso rappresentano ostacoli all'adozione diffusa in ambienti multiutente, tra cui alta fototossicità, necessità di fluorofori specializzati o preparazione del campione, procedure di allineamento complesse o elaborazione computazionale^{intensiva 1,2,3}.

In questo contesto, i sistemi di microscopio confocale dotati di un rivelatore a matrice multiplexata offrono un'alternativa interessante consentendo l'imaging a super-risoluzione tramite rilevamento multi-pixel e riassegnazione computazionale, abbassando significativamente la soglia^{tecnica 4}. Questo approccio sfrutta un array di rivelatori di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP) a 32 elementi per raccogliere più fotoni da ogni punto di scansione. Algoritmi di deconvoluzione intelligenti successivi riassegnano queste informazioni, riducendo di fatto il volume di rilevamento. Questo processo raggiunge risoluzioni spaziali di circa 120 nm lateralmente e 350 nm assiale, rappresentando un miglioramento di circa 2 volte rispetto al limite di diffrazione della microscopia a campo ampio e producendo un aumento di 4-8 volte del rapporto segnale-rumore rispetto alla modalità confocale standard sullo stesso^{strumento 4,5,6}. Questa combinazione unica di risoluzione migliorata, qualità del segnale superiore e compatibilità con etichette fluorescenti comuni e protocolli costituisce il suo principale vantaggio per l'applicazione su larga scala.

Di conseguenza, questa forma di microscopia a super-risoluzione accessibile ha trovato ampio impiego nella ricerca nelle scienze della vita, permettendo studi dettagliati sulla morfologia degli organelli, la dinamica del citoscheletro, le interazioni virus-ospite e la co-localizzazione molecolare sia in cellule fisse che^{viventi 7,8}. La sua relativa delicatezza lo rende particolarmente adatto per osservazioni a lungo termine di campioni vivi.

L'integrazione di sistemi così avanzati nelle strutture principali è cruciale per democratizzare l'accesso, ma il loro funzionamento sostenibile ed efficace presenta sfide distinte. Nelle strutture istituzionali di base, come presso la Scuola di Medicina dell'Università di Zhejiang, la performance ottimale e l'impatto dipendono in modo critico da tre pilastri: (1) protocolli di imaging standardizzati e riproducibili, (2) rigorosa manutenzione di routine e (3) un quadro di gestione efficace per l'accesso condiviso. Sebbene esistano risorse preziose per aspetti specifici, come i metodi di imaging per sistemi^{precedenti 9}o i principi generali di gestione delle strutture^10,11, attualmente manca una guida completa che integri protocolli dettagliati e riproducibili per le moderne piattaforme di rilevatori a array multiplexati con un modello comprovato di gestione delle risorse condividete. Questo articolo sul protocollo mira a colmare questo divario.

L'obiettivo generale è fornire una guida completa e passo dopo passo per implementare e utilizzare efficacemente un sistema confocale con un rivelatore a matrice multiplexata per immagini a super-risoluzione in un contesto di risorse condivide. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; e i responsabili della struttura che stabiliscono o ottimizzano tale servizio. Qui, dettagliamo sistematicamente la configurazione del sistema, i protocolli di imaging multimodale (che coprono modalità multicolore, 3D, live-cell, tiling e super-resolution) e un modello di gestione condivisa collaudato. Questa guida integrata funge da risorsa per massimizzare il potenziale e l'accessibilità di questa potente modalità di imaging.

Protocol

Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto campioni biologici sono stati condotti in conformità con le linee guida e i regolamenti delle Strutture Centrali della Facoltà di Medicina dell'Università di Zhejiang e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (Certificato di Approvazione n. BSL20235710079).

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono colture cellulari devono essere eseguite in condizioni sterili in un armadietto di sicurezza biologica di Classe II, salvo diversa specificazione. Questo protocollo presuppone che il sistema di microscopio sia installato e che le potenze laser siano calibrate. Specifiche dettagliate e fornitori consigliati per reagenti chiave, consumabili e attrezzature (ad esempio, piatti per immagini, vetro di copertura, mezzo di montaggio) sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione del campione

NOTA: L'imaging super-risoluzione riuscito inizia con la preparazione ottimale del campione. L'uso di piastre di vetro di alta qualità con spessore di 1,5 (0,17 mm) è essenziale per adattarsi al collare correttivo degli obiettivi di immersione in olio ad alto NA ed evitare le anomalie sferiche. Tutti i passaggi di centrifugazione devono essere eseguiti a 300 × g per 5 minuti, salvo indicazione.

1. Preparazione del campione cellulare fissa per immagini multicolore a super-risoluzione (ad esempio, celle COS7)
   NOTA: Questo protocollo descrive l'immunocolorazione per microtubuli (Alexa Fluor 568) e mitocondri (Alexa Fluor 488), con controcolorazione nucleare 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), come mostrato nella Figura 1.
   1. Coltivare cellule COS7 nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco, integrate con siero bovino fetale al 10% (FBS) a 37°C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
   2. Cellule a piastra su piatti di imaging con fondo di vetro da 35 mm a una densità di 1,0 × 10⁵ cellule per piatto. Permettere alle cellule di aderire e crescere fino a una confluenza del 60-70% (tipicamente 24 ore).
   3. Aspirare il mezzo di coltura e lavare delicatamente le cellule una volta con soluzione salina fosfatata (PBS) preriscaldata (37°C). Fissare le cellule aggiungendo 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% nel PBS e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
   4. Aspira la soluzione PFA (trattala come rifiuto pericoloso). Lava le cellule tre volte con 2 mL di PBS, incubando per 5 minuti per lavaggio con un dondolio leggero.
   5. Permeabilizzazione e blocco: Incubare le cellule con 1 mL di tampone di permeabilizzazione/blocco (0,1% v/v) Triton X-100, 1% (v/v) albumina sierica bovina (BSA) in PBS) per 30 minuti a RT.
   6. Incubazione primaria degli anticorpi: Incubare le cellule con una miscela di anticorpi primari contro α-tubulina (monoclonale del topo) e TOMM20 (policlonale di coniglio) in tampone di diluizione degli anticorpi (1% di BSA nel PBS) a 4°C durante la notte (o 1-2 ore a RT). Usa 300 μL per piatto per coprire la superficie del vetro.
   7. Lavaggio: aspirare con cura la soluzione primaria degli anticorpi. Lavare le cellule tre volte con 2 mL di PBS contenente 0,05% Tween-20 (PBST), 5 min per lavaggio.
   8. Anticorpi secondari e colorazione nucleare: Prepara una miscela di anticorpi secondari fluorescenti e DAPI in un buffer di diluizione di anticorpi (1% BSA/PBS), protetto dalla luce.
      1. Usa IgG anti-topo per asini coniugato con Alexa Fluor 568 (1:500) e IgG anti-coniglio per asini coniugato con Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Includere DAPI a una concentrazione finale di 1 μg/mL per la colorazione nucleare. Applicare 300 μL di questa miscela sulle cellule e incubare per 1 ora a RT al buio.
   9. Lavaggio finale: aspirare la soluzione di colorazione e lavare le cellule tre volte con 2 mL di PBS, 5 min per lavaggio.
   10. Applicare il mezzo di montaggio: aspirare con attenzione il PBS dal piatto di richiamo, lasciando il campione leggermente umido. Applicare immediatamente una piccola goccia (~20 μL) di medium di montaggio anti-decolorazione temprato (ad esempio, ProLong Gold) direttamente sulla zona del fondo del vetro.
   11. Coprire e asciugare: Abbassare delicatamente un bicchiere di copertura ad alta precisione #1.5 sulla goccia, evitando bolle. Lascia asciugare il montante durante la notte a RT al buio, oppure per 2-4 ore a 37°C se è necessario un indurimento più veloce.
2. Preparazione di campioni di cellule vive per immagini in time-lapse (ad esempio, cellule Hep3B che esprimono un tag proteico fluorescente).
   NOTA: Questo protocollo descrive l'imaging delle cellule Hep3B che esprimono stabilmente una proteina fluorescente (ad esempio, EGFP) mirata ai mitocondri.
   1. Coltura delle cellule Hep3B in mezzo essenziale minimo (MEM) integrato con FBS al 10%. Cellule a piastra su piatti di imaging con fondo di vetro da 35 mm (1,5 copre vetro) a una densità di 0,8 × 10⁵celle/piatto. Permettere alle cellule di crescere fino a circa il 70-80% di confluenza per una salute ottimale e una densità di imaging (tipicamente 18-24 ore).
   2. Preparazione per l'imaging: Il giorno dell'imaging, sostituire delicatamente il mezzo di coltura standard con 2 mL di mezzo di sparo pre-equilibrato (37°C, 5% CO₂ ) per almeno 30 minuti, privo di fenolo rosso, a bassa fluorescenza, integrato con FBS al 10% e, se necessario, 25 mM di buffer HEPES per la stabilizzazione del pH all'esterno di un incubatore di_CO-2 . Questo minimizza la fluorescenza di fondo e mantiene il pH fisiologico durante l'imaging (imaging).
      NOTA: Lasciare che il piatto si acclimati sul palco del microscopio preriscaldato all'interno della camera ambientale per almeno 30-45 minuti prima di iniziare l'acquisizione in time-lapse, per garantire la temperatura, la concentrazione e la stabilizzazione della salute cellulare.

2. Avvio, inizializzazione e allineamento di base del sistema microscopico

1. Alimenta l'unità principale del microscopio, il modulo di lancio laser (contenente laser a stato solido a 405, 488, 561 e 640 nm), la sorgente luminosa LED e il computer di controllo.
   1. Lascia riscaldare e stabilizzare i laser per almeno 15-20 minuti. Questo è fondamentale per una potenza laser stabile, specialmente per esperimenti quantitativi o time-lapse.
2. Avvia il software operativo del microscopio.
3. Dall'interfaccia principale, seleziona 'Microscope' > 'Inizializza' oppure segui il wizard di avvio del software.
4. Nel software, naviga fino al pannello 'Acquisizione'. Dal menu a tendina delle obiettivi, seleziona 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ' o l'obiettivo appropriato per il tuo esperimento.
5. Applicare una goccia di olio a immersione (indice di rifrazione = 1,518) direttamente sulla lente frontale dell'obiettivo. Evita di introdurre bolle.
6. Per l'imaging delle cellule vive, attiva la camera ambientale e il sistema di stabilizzazione attiva a fuoco (ad esempio, 'Definite Focus' >) almeno 45-60 minuti prima dell'imaging. Imposta la temperatura a 37°C, il_CO2 al 5% e l'umidità al >60%. Permette al sistema di stabilizzarsi. Verifica la stabilità usando i sensori della camera.
7. Il sistema è ora pronto per il caricamento del campione e per l'impostazione dei parametri di immagini.

3. Imaging a fluorescenza multicolore

1. Posiziona il campione preparato sul palco del microscopio. Alza con attenzione il palco finché il vetro di copertura non entra in contatto con l'olio a immersione.
2. Nel software di acquisizione, naviga nella scheda 'Acquisizione' e seleziona Crea un nuovo esperimento.
3. Aggiungi più piste di imaging (canali) corrispondenti ai fluorofori utilizzati. Per l'esempio nella Figura 1, configurare:
   1. Traccia 1 (DAPI): Eccitazione 405 nm, rilevamento 410-480 nm.
   2. Traccia 2 (Alexa Fluor 488): Eccitazione 488 nm, rilevamento 495-550 nm.
   3. Traccia 3 (Alexa Fluor 568): Eccitazione 561 nm, rilevamento 570-620 nm.
4. Per ogni traccia, imposta il diametro del foro stenopeico confocale a 1 Unità di Aria (1 AU).
5. Ottimizzare la potenza laser e il guadagno del rilevatore per ogni canale utilizzando il seguente processo iterativo:
   1. Seleziona il primo canale (ad esempio, DAPI). Passa alla modalità di scansione 'Live'.
   2. Imposta la potenza laser iniziale a un valore basso (ad esempio, 0,1-0,5%). Imposta il guadagno del rilevatore a un livello moderato all'interno del suo intervallo lineare (ad esempio, 700 V per un PMT GaAsP).
   3. Aumentare gradualmente la potenza del laser finché le strutture del bersaglio non sono chiaramente visibili sopra lo sfondo nell'immagine live.
   4. Apri il display Istogramma . Assicurati che non ci sia saturazione dei pixel (l'istogramma non si accumula sul bordo destro). Riduci la potenza del laser se necessario.
   5. Regola il guadagno del rilevatore per ottenere un'immagine luminosa e a basso rumore. Evita aumenti superiori a 850 V per evitare rumori eccessivi.
   6. Ripeti i passaggi 3.5.1-3.5.5 per tutti i canali di fluorescenza rimanenti.
      NOTA: Bilanciare potenza laser, guadagno e tempo di permanenza dei pixel per massimizzare il rapporto segnale-rumore minimizzando il fotodanno. Per le celle vive, dà priorità a una potenza minore e tempi di permanenza più brevi.
6. Imposta il formato immagine (numero di pixel) e il tempo di permanenza dei pixel.
   1. Imposta la dimensione del pixel per soddisfare il criterio di Nyquist: dimensione del pixel ≤(risoluzione / 2.3). Per l'imaging confocale standard (risoluzione laterale ~250 nm), imposta la dimensione del pixel ≤108 nm.
   2. Usa il pulsante di campionamento 'Nyquist ' del software per calcolarlo automaticamente se disponibile.
   3. Imposta il tempo di permanenza dei pixel. Utilizzare un tempo di permanenza più lungo (ad esempio, 1,0-2,0 μs) per un rapporto segnale-rumore più elevato, oppure un tempo di permanenza più breve (ad esempio, 0,5-1,0 μs) per immagini più rapide.
7. Assicurati che la modalità 'Scansione Sequenziale' sia selezionata tra le tracce per minimizzare la diafonia.
8. Clicca su 'Start' per acquisire una singola immagine. Salva l'immagine con i metadati pertinenti.

4. Imaging con contrasto differenziale di interferenza (DIC)

1. Nella scheda 'Acquisition' del software di acquisizione, seleziona 'Aggiungi un nuovo canale ' e configuralo per il rilevamento della luce trasmessa.
2. Seleziona il rilevatore di luce trasmessa appropriato (spesso chiamato T-PMT (tubo fotomoltiplicatore di luce trasmessa) o ESID (rilevatore di interfaccia di sistema esterno) nel software).
3. Configurazione del prisma DIC e del polarizzante:
   1. Dal pannello di controllo hardware o dall'interfaccia software, seleziona il prisma DIC corrispondente al tuo obiettivo (ad esempio, 'DIC III' per un obiettivo 63x).
   2. Inserisci il prisma selezionato nel percorso della luce.
4. Regola il polarizzatore e il cursore DIC per un contrasto ottimale:
   1. Ruota l'analizzatore (polarizzatore) finché lo sfondo nell'immagine 'Live' non appare scuro o molto fioco.
   2. Durante l'osservazione dell'immagine in tempo reale, regola lentamente la posizione dello slider DIC in piccoli incrementi.
   3. Ottimizzare finché le caratteristiche cellulari (ad esempio, membrane, nuclei) non appaiono con un rilievo ombreggiato, pseudo-tridimensionale, su uno sfondo grigio neutro.
5. Imposta la lunghezza d'onda di illuminazione per il DIC a un valore nell'intervallo visibile (ad esempio, 488 nm o 546 nm).
6. Regolare l'intensità di trasmissione (potenza del laser o della lampada) e il guadagno del rivelatore per il canale luminoso trasmesso per ottenere un'immagine chiara senza saturazione.
7. Acquisire l'immagine DIC.

5. Acquisizione Z-stack per la ricostruzione tridimensionale

NOTA: Prima di definire lo Z-stack, configura tutti i parametri di imaging (potenza laser, guadagno, foro stenopeico, dimensione dei pixel) su un unico piano focale ottimale come descritto nella Sezione 3. Questo garantisce impostazioni coerenti su tutte le sezioni ottiche.

1. Nella scheda 'Acquisizione', seleziona la modalità 'Z-stack'.
2. Definisci il volume di interesse:
   1. Utilizzando una scansione live ad alta velocità, concentrati sulla struttura più alta di interesse.
   2. Clicca su 'Imposta per primo' (o 'Top').
   3. Concentrati attentamente sulla struttura più bassa di interesse.
   4. Clicca su 'Imposta l'ultimo' (o 'Sotto'). Il software mostrerà la profondità totale.
3. Imposta la dimensione del passo Z per soddisfare il criterio di campionamento di Nyquist nella direzione assiale. (tipicamente d_r/2.3, dove d_r è la risoluzione assiale). Per un obiettivo olio 63x/1,4 NA, si usa 0,3-0,4 μm.
4. In alternativa, usa il pulsante 'Optimal' o 'Nyquist' del software per calcolare automaticamente la dimensione del passo.
5. Configurare i parametri di imaging (potenza laser, guadagno, foro stenopeico = 1 UA) per ogni canale come descritto nella Sezione 3. Per segnali deboli, si consideri un leggero aumento della potenza o del guadagno laser rispetto a una singola immagine 2D.
6. Avvia l'acquisizione per raccogliere l'intera pila di immagini.
   NOTA: Tempo totale di acquisizione = (Tempo di frame da una singola fetta) × (Numero di fette)
   Pianifica di conseguenza, soprattutto per campioni vivi.
7. Ricostruzione e visualizzazione 3D:
   1. Usa il modulo 'Processing' del software (ad esempio, funzione di proiezione 3D) oppure apri lo stack di immagini in software dedicati come ImageJ/Fiji.
   2. Genera proiezioni di massima intensità (MIP) per visualizzare tutti i segnali a fuoco in un'unica immagine 2D.
   3. Per una vera rappresentazione 3D, applica il volume rendering. Regola luminosità, opacità e illuminazione secondo necessità.
   4. Genera viste ortogonali (sezioni trasversali XZ e YZ) per ispezionare l'estensione assiale e la registrazione.

6. Imaging in time-lapse per cellule vive

1. Preparare le cellule vive come descritto nella Sezione 1.2. e montare il piatto sul palco del microscopio preriscaldato all'interno della camera ambientale.
2. Lasciare che il campione si acclimati per almeno 45-60 minuti come descritto nella Sezione 2.6 per garantire la stabilizzazione.
3. Naviga in un campo visivo con celle sane e ben distanziate e acquisisci un singolo snapshot di alta qualità utilizzando parametri ottimizzati secondo la Sezione 3.5.
4. Attiva il sistema di stabilizzazione attiva a messa a fuoco (ad esempio, Definite focus o simili). Questo è non negoziabile per esperimenti a lungo termine volti a compensare la deriva termica.
5. Nella scheda 'Acquisizione', seleziona la modalità 'Serie Temporale'.
6. Seleziona la modalità di imaging appropriata in base al bilanciamento richiesto tra velocità, risoluzione e fototossicità:
   1. Per la massima risoluzione spaziale in processi meno dinamici, seleziona la modalità 'SR' (SuperResolution).
   2. Per un bilanciamento adatto a molte dinamiche di organelli, si seleziona 'SR 2 Y ' o 'SR 4 Y ' (modalità superrisoluzione accelerate).
   3. Per immagini ad altissima velocità senza superrisoluzione, seleziona la modalità 'Confocale' o 'Co 2 Y'.
7. Definire la timeline sperimentale: stabilire la durata totale dell'esperimento e l'intervallo di tempo (Δt) tra fotogrammi consecutivi. (ad esempio, 5-30 s per la motilità mitocondriale)
8. Ottimizzare i parametri di imaging per minimizzare i danni fotografici:
   1. Inizia con la potenza laser più bassa che fornisce un segnale rilevabile.
   2. Regolare il guadagno del rivelatore all'interno del suo intervallo lineare (600-850 V) per ottenere un livello di segnale funzionante, preferendo il guadagno rispetto agli aumenti di potenza laser.
   3. Usa la velocità di scansione più veloce (tempo di permanenza pixel più breve) compatibile con i requisiti di qualità dell'immagine.
9. Inizia l'acquisizione in time-lapse. Monitora i primi fotogrammi per la stabilità della messa a fuoco e la salute cellulare.

7. Imaging di scansione delle piastrelle su grandi aree

1. Nella scheda 'Acquisizione', seleziona la modalità 'Scansione delle Tile'.
2. Definisci la tilingRegion usando uno di due metodi:
   1. Basato sulla disizione: Specifica il numero di tessere nelle direzioni X e Y (ad esempio, 3 x 3).
   2. Base sul ROI: Disegna manualmente un rettangolo sopra l'immagine 'Live' per definire la regione di interesse. Il software calcolerà automaticamente il numero di tessere necessarie.
3. Imposta la sovrapposizione tra le tessere adiacenti al 10-15%.
   NOTA: Questa sovrapposizione fornisce informazioni sufficienti per l'algoritmo di cucitura del software per creare un'immagine composita senza soluzione di continuità.
4. Configura i parametri di imaging (potenza laser, guadagno, risoluzione) per una singola tile come faresti per un'immagine statica.
   NOTA: Per aree tisolate molto grandi, si consideri l'uso di una modalità di scansione più veloce (ad esempio, 'Co 2 Y') per mantenere pratico il tempo totale di acquisizione e minimizzare il fotosbiancamento.
5. Inizia l'acquisizione delle piastrelle. Il software acquisirà e cucirà automaticamente le tessere.
6. Dopo l'acquisizione, ispezionare attentamente l'immagine cucita, specialmente ai confini delle piastrelle, per eventuali reperti. Usa gli strumenti manuali di regolazione delle cuciture del software se necessario.

8. Imaging a super-risoluzione utilizzando il rivelatore a matrice multiplexata

1. Nella scheda 'Acquisizione', naviga al selettore delle modalità, clicca su 'Smart Setup' e seleziona la modalità 'Airyscan'. Poi scegli 'SuperResolution' come modalità operativa per il rivelatore a matrice multiplexata.
2. Scegli la modalità di acquisizione specifica in base alle priorità sperimentali:
   1. Modalità 'SR': Per la massima risoluzione spaziale possibile (~120 nm laterale). Da usare per campioni fissi.
   2. Modalità 'SR 2 Y': Fornisce un equilibrio tra risoluzione e velocità.
   3. Modalità 'SR 4 Y': Modalità super-risoluzione più veloce (fino a ~25 fps line rate, teoricamente), ottimizzata per immagini a cellule vive per minimizzare la dose di luce.
   4. Modalità 'Co 2 Y': Offre velocità di imaging simile a quella confocale con un rapporto segnale/rumore migliorato, quando non è richiesta super-risoluzione.
      NOTA: I valori di risoluzione (ad esempio, 120 nm) sono specifiche di sistema in condizioni^{ideali 12}. La risoluzione effettiva dipende dalla preparazione del campione, dal rapporto segnale-rumore e dalla corretta elaborazione.
3. Configura i parametri di imaging (potenza laser, guadagno del rilevatore).
   1. Per l'imaging livecell, si parte con una potenza laser inferiore rispetto alla modalità confocale per ridurre il fotodanno.
   2. Per campioni fissi e tenui, può essere necessario un aumento maggiore di potenza e/o guadagno laser per raggiungere un rapporto segnale/rumore sufficiente.
   3. Trova la potenza minima del laser che produca un'immagine pulita e ad alto contrasto in modalità 'Live'.
4. Imposta la dimensione dei pixel e il tempo di permanenza.
   1. Per catturare la risoluzione migliorata, impostare la dimensione dei pixel per soddisfare il criterio di Nyquist: dimensione dei pixel ≤(risoluzione desiderata / 2,3). Per la modalità SR (obiettivo 120 nm), imposta la dimensione del pixel ≤~52 nm.
   2. Usa il pulsante 'Optimal' o 'Nyquist' del software per calcolarlo automaticamente se disponibile.
5. Acquisire l'immagine. I dati grezzi contengono segnali multiplexati e non sono ancora superrisolti.
6. Elaborare i dati acquisiti per ottenere la superrisoluzione:
   1. Naviga fino al modulo di elaborazione del software.
   2. Seleziona il dataset e scegli la funzione 'SuperResolution Processing'.
   3. Inizia con le impostazioni 'Auto'. Per i dati lowSNR, regola manualmente 'Forza' e 'Filtro rumore' per aumentare la nitidezza senza introdurre artefatti.
   4. (Opzionale) Per la massima fedeltà, specialmente negli stack 3D, applica un ulteriore passaggio di deconvoluzione congiunta (jDCV).
   5. Esegui l'elaborazione. Confronta le visualizzazioni elaborate e non elaborate per verificare il miglioramento dei dettagli reali.
7. (Opzionale) Per un confronto quantitativo del rapporto segnale-rumore (SNR) tra le modalità:
   1. Acquisire immagini dello stesso campione in modalità diverse.
   2. Nei software di analisi, si definisce una regione di interesse (ROI) su una struttura uniforme e si misura l'intensità media del segnale.
   3. Definire un ROI di fondo e misurare la deviazione standard dell'intensità di fondo.
   4. Calcolare SNR = (Segnale Medio) / (Deviazione Standard del Fondo).
8. (Opzionale) Per la misurazione empirica della risoluzione del sistema utilizzando perle fluorescenti:
   1. Prepara un campione di sfere fluorescenti da 100 nm.
   2. Acquisire uno Zstack di una perla isolata in modalità SR con campionamento Nyquist.
   3. Elabora lo stack con superrisoluzione e (opzionalmente) jDCV.
   4. Usa lo strumento 'PSF Measurement ' del software per adattare una Gaussian 3D e registra la larghezza completa ai valori del massimo (FWHM).

Results

Imaging a fluorescenza multicolore
L'imaging a fluorescenza multicolore delle cellule COS7 fissa è stato effettuato come descritto nella Sezione 3. Sono stati utilizzati anticorpi contro α-tubulina (microtubuli) e TOMM20 (mitocondri) con controcolorazione nucleare DAPI. Come mostrato nella Figura 1, i nuclei (blu), i mitocondri (verde, Alexa Fluor 488) e i microtubuli (rossi, Alexa Fluor 568) sono stati chiaramente delineati con alta spec...

Discussion

Il protocollo integrato presentato qui fornisce una roadmap completa per l'implementazione delle avanzate capacità di imaging di un moderno sistema di microscopio confocale dotato di un rivelatore a superrisoluzione multiplexed array, all'interno di un quadro sostenibile di risorse condivise. Questa sezione sintetizza gli aspetti critici del metodo, l'implementazione pratica e la sua posizione nel campo della bioimaging. L'esecuzione con successo di questo protocollo dipende da diversi p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celle COS7	ATCC (o simili)	CRL-1651	Linea cellulare di fibroblasti renali della scimmia verde africana. Utilizzato per la preparazione di campioni a cellula fissa per immagini multicolore a super-risoluzione
IgG anti-topo per asini, coniugato Alexa Fluor 568	Invitrogen (o simili)	A10037	Anticorpo secondario per la colorazione dei microtubuli. Usato a diluizione 1:500
Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM), alto livello di glucosio	Gibco (o simile)	11965092	Mezzo di coltura standard per cellule COS7, integrato con FBS al 10%.
Siero bovino fetale (FBS), inattivato dal calore	Gibco (o simile)	10082147	Integratore siero usato al 10% (v/v) in tutti i mezzi di coltura cellulare.
Pannello di imaging con fondo di vetro (35 mm, piatto µ-Dish, #1.5 copertura polimerica, spessore 0,17 mm)	ibidi (o simili)	81156	Substrato per la placcatura cellulare e l'imaging di immagini. Fondamentale per la compatibilità con obiettivi di immersione in olio ad alto NA.
Elaborazione delle immagini e software di analisi (moduli ZEN)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (blu)	Utilizzato per la ricostruzione 3D, l'elaborazione a super-risoluzione (ad esempio, elaborazione Airyscan), la misurazione PSF e l'analisi SNR.
ImageJ / Fiji	Open Source	N/A	Utilizzato per ulteriori ricostruzioni 3D, generazione di viste ortogonali e analisi generale delle immagini.
Olio a immersione (Indice di rifrazione = 1,518)	Carl Zeiss (o simile)	444960-0000-000	Da usare con obiettivi a immersione in olio (ad esempio, 63x/1,4 NA).
Sistema di microscopio confocale a scansione laser con rivelatore multiplex array (ad esempio, ZEISS LSM 900 con Airyscan 2)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	La principale piattaforma di imaging utilizzata per tutte le modalità confocali e super-risoluzione descritte nel protocollo.
Medium Essenziale Minimo (MEM) con Earle' s Sali	Gibco (o simile)	11095080	Mezzo di coltura standard per cellule Hep3B, integrato con FBS al 10%.
Anticorpo monoclonale anti-&alfa-tubulina del topo (Clone DM1A)	Sigma-Aldrich (o simili)	T6199	Anticorpo primario per la marcatura dei microtubuli. Usato a diluizione 1:500
Paraformaldeide (PFA), 4% nel PBS	Jinpan  (o simili)	TBS5083	Fissativo per le cellule. Usa a temperatura ambiente per 15 minuti. Gestisci con le dovute precauzioni.
Mezzo di imaging privo di fenolo rosso	Gibco (o simile)	21063029	Mezzo a bassa autofluorescenza utilizzato per l'imaging di cellule vive. Pre-equilibrato con il 5% di CO2 a 37° C prima dell'uso.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1X, pH 7,4	CellWorld (o simili)	C0162-311	Utilizzato come buffer di lavaggio e diluizione per tutto il protocollo.
Montante antifade d'oro ProLong	Invitrogen (o simili)	P36930	Mezzo di montaggio indurito per preservare la fluorescenza in campioni fissi.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (o simili)	T8787	Utilizzato allo 0,1% (v/v) per la permeabilizzazione cellulare
Preadolescente-20	Sigma-Aldrich (o simili)	P9416	Utilizzato allo 0,05% (v/v) nel PBS (PBST) per i passaggi di lavaggio dopo l'incubazione degli anticorpi.
Albumina sierica bovina (BSA), Frazione V	Sigma-Aldrich (o simili)	A7906	Usata all'1% (w/v) nel PBS per bloccare e come componente del tampone di diluizione degli anticorpi.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo)	Sigma-Aldrich (o simili)	D9542	Controcolorazione nucleare. Utilizzato a una concentrazione finale di 1 & micro; g/mL.
IgG anti-coniglio di Asino, coniugato Alexa Fluor 488	Invitrogen (o simili)	A21206	Anticorpo secondario per la colorazione mitocondriale. Usato a diluizione 1:500
Microsfere fluorescenti (Beads), diametro 100 nm	Invitrogen (ad esempio, TetraSpeck™) o simili	T7279	Utilizzato per la misurazione empirica del sistema' funzione di diffusione dei punti (PSF) e risoluzione.
Cellule Hep3B che esprimono in modo stabile EGFP-mitocondri	IMMOCELL	IM-H367	Linea cellulare di epatoma umana ingegnerizzata per esprimere stabilmente EGFP mirata alla matrice mitocondriale. Utilizzato per l'imaging time-lapse di cellule vive.
Soluzione tampone HEPES, 1 M	Gibco (o simile)	15630080	Utilizzato a una concentrazione finale di 25 mM in un mezzo di imaging per la stabilizzazione del pH durante immagini dal vivo all'esterno di un incubatore CO2.
Vetro coperto ad alta precisione (#1.5, spessore 0.17 mm)	Marienfeld (o simile)	107052	Utilizzato per montare campioni fissi.
Software operativo per microscopio (ad esempio, edizione ZEN blue)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (blu)	Utilizzato per il controllo di sistema, l'acquisizione di immagini e l'elaborazione di base.
Obiettivo obiettivo: Plan-apochromat 63x/1.40 NA DIC a olio	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Obiettivo principale utilizzato per l'imaging ad alta risoluzione.
Anticorpo policlonale anti-TOMM20 Rabbit	Abcam (o simile)	ab186735	Anticorpo primario per la marcatura dei mitocondri. Usato a diluizione 1:1000