Flusso di lavoro computazionale riproducibile per la scoperta di farmaci per standardizzare la farmacologia di rete e le analisi di docking molecolare

Sommario

Questo protocollo standardizzato unifica la farmacologia di rete e il docking molecolare con simulazioni di Molecular Dynamics (MD) per la scoperta di farmaci. Stabilisce criteri quantitativi di screening e passaggi riproducibili, adatti per lo screening multi-bersaglio di farmaci utilizzando dataset pubblici e migliorando l'affidabilità dei risultati.

Abstract

La farmacologia di rete e il docking molecolare sono ampiamente applicati nella scoperta di farmaci, ma flussi di lavoro frammentati e operazioni incoerenti spesso minano la riproducibilità dei risultati. Qui viene descritto un protocollo standardizzato che integra questi approcci in un quadro riproducibile per lo screening dei farmaci e l'esplorazione dei meccanismi, con il flusso di lavoro organizzato in tre fasi sequenziali: preparazione dei dati, analisi computazionale e validazione. Nella fase di preparazione, le librerie di composti provenienti da database pubblici vengono filtrate tramite criteri di Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, and Toxicity (ADMET), inclusi biodisponibilità orale, similitudine farmacologica e previsione di tossicità, mentre potenziali target terapeutici vengono ottenuti tramite predizione e integrazione di database di malattie per identificare in modo completo i candidati di interazione farmaco-malattia. Nella fase di analisi computazionale, i target sovrapposti sono sottoposti ad analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e analisi topologiche di interazione proteina-proteina per identificare bersagli centrali; il docking molecolare è configurato con due strategie opzionali standardizzate con vantaggi distinti. La strategia progressiva in due fasi impiega AutoDock Vina per lo screening preliminare ad alto throughput della libreria di composti, seguito da un ri-accoccaggio preciso con YASARA, che elimina falsi positivi dallo screening ad alto throughput e genera complessi proteina-ligando compatibili nativamente con le successive simulazioni di dinamica molecolare (MD) di YASARA per evitare deviazioni strutturali causate dalla conversione di formato cross-software. La strategia a un solo passo completa il processo di docking tramite YASARA, semplificando il flusso di lavoro operativo, migliorando l'efficienza sperimentale ed è pienamente applicabile per obiettivi di ricerca specifici. Nella fase di validazione, simulazioni MD standardizzate valutano la stabilità del complesso ligando-proteina tramite metriche core di deviazione quadrata media (RMSD) e fluttuazione quadratica media radice (RMSF). Questa pipeline unificata e riproducibile migliora l'affidabilità della farmacologia di rete e degli studi di docking e facilita confronti incrociati nella scoperta computazionale di farmaci.

Introduzione

La farmacologia delle reti rappresenta un approccio di ricerca che decifra i modelli di interazione tra farmaci e organismo da una prospettiva olistica^{di rete.} Costruendo e analizzando la rete di interazione che comprende la via farmaco-componente-bersaglio-malattia-biologica, identifica quantitativamente le molecole chiave, le vie centrali e i meccanismi sinergici attraverso cui i farmaci esercitano i loro effetti. Questo quadro analitico è in linea con lo standard internazionale per la farmacologia di rete, che enfatizza l'integrazione multi-omica dei dati e l'analisi topologica delle reti, e in ultima analisi chiarisce gli effetti terapeutici complessivi dei farmaci, prevede potenziali effetti collaterali o fornisce indicazioni sistematiche per lo sviluppo di nuovi farmaci. Questa strategia è stata applicata con successo in diversi campi, tra cui la decifrazione delle vie di segnalazione associate alle proteine target di farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) contro il COVID-19, e l'esplorazione del meccanismo d'azione per trattare malattie come l'osteosarcoma e il diabete mellito di tipo^{2 2,3,4}. Questo vantaggio guida il cambiamento di paradigma dalla scoperta di farmaci a bersaglio singolo a quella multi-bersaglio nella farmacologia moderna.

L'aggancio molecolare è una tecnica di simulazione computazionale che impiega modellazione algoritmica per valutare la compatibilità spaziale e la forza di interazione tra composti di piccole molecole e bersagli macromolecolari biologici, prevedendo così configurazioni di legame^{ottimali 5,6}. Morris et al. hanno introdotto AutoDock4 e AutoDockTools4, che consentono l'aggancio automatico con flessibilità selettiva dei recettori; questi strumenti si basano sulla dinamica molecolare e sulla geometria molecolare, e valutano la stabilità e l'affinità del legame calcolando le differenze di energia tra^{molecole 7}. Strumenti classici come AutoDock utilizzano la modellazione semi-flessibile dei ligandi-recettori e sono diventati uno standard d'oro per valutare l'affinità di legame in tali^{simulazioni 7}.

Nella scoperta di farmaci, le tecniche di screening in farmacologia di rete sono frequentemente impiegate per identificare componenti chiave, che vengono poi validate tramite docking molecolare per valutare il loro legame con le proteine bersaglio, stabilendo infine la relazione tra il farmaco e la^malattia. Tuttavia, le applicazioni attuali soffrono comunemente di progettazione sperimentale incoerente, procedure operative non standardizzate e passaggi di validazione mancanti. Una valutazione sistematica degli studi di farmacologia di rete legati alla medicina erboristica ha documentato questo problema diffuso, osservando che l'eterogeneità dei dati tra database e la validazione sperimentale inadeguata portano a risultati^{irriproducibili 9}. Queste limitazioni non solo minano la riproducibilità e l'affidabilità dei risultati della ricerca, ma ostacolano anche la traduzione delle previsioni computazionali nella validazione sperimentale o di workflow frammentati con parametri arbitrari, questo protocollo integra entrambi gli approcci con soglie standardizzate e operazioni passo dopo passo. Questo quadro elimina la selezione soggettiva dei parametri, garantendo che il flusso di lavoro possa essere replicato da diversi operatori con risultati coerenti.

Pertanto, stabilire procedure operative standardizzate per identificare potenziali target e vie farmacologiche tramite screening farmacologico di rete, combinato con l'aggancio molecolare per validare l'attività di legame farmaco-bersaglio, può fornire prove sperimentali per studiare i meccanismi d'azione dei farmaci e per lo screening dei candidati farmaci¹⁰. Questo protocollo è particolarmente adatto per lo screening multi-target di componenti del farmaco e piccole molecole sintetiche utilizzando database omici, chimici e di strutture proteiche disponibili pubblicamente; non è applicabile a target senza strutture cristalline risolte, o a screening di farmaci orfani a singolo bersaglio senza reti di interazione correlate a malattie conosciute.

Protocollo

Questo protocollo coinvolge solo analisi computazionali di database pubblici e non prevede l'uso di soggetti umani, vertebrati o tessuti biologici. Tutti i flussi di lavoro riassuntivi descritti in questa sezione sono illustrati nella Figura 1.

Figura 1: Riepilogo del flusso di lavoro. I rettangoli verdi rappresentano componenti alternativi dei farmaci, i rettangoli rossi rappresentano le malattie, le ellissi gialle contengono i siti web e i software utilizzati, i rettangoli arancioni contengono i file o i dati ottenuti, così come i passaggi chiave, e i diamanti viola rappresentano i risultati finali richiesti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Acquisizione di componenti e bersagli di farmaci

1. Cerca nel database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) usando nomi chimici come parole chiave per ottenere le corrispondenti stringhe SMILES (Simplified Molecular-Input Line-Entry System).
2. Accedi al sito ADMETlab 3.0 (https://admetlab3.scbdd.com/), seleziona l'opzione Valutazione ADMET nella scheda Servizi, inserisci le stringhe SMILES e clicca sul pulsante INVIA .
3. Filtra i risultati dell'ADMET in base agli indicatori: Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo, Escrezione, Tossicità, Chimica Medicinale e Regole sul Tossicoforo. Conserva solo i composti che soddisfano tutti i criteri di soglia predefiniti per ciascun indicatore (Tabella 1).
4. Accedi al sito ProTox 3.0 (https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home), inserisci le stringhe SMILES dei composti filtrati, seleziona il modulo TOX PREDICTION , seleziona tutte le opzioni di previsione desiderate (ad esempio, tossicità degli organi, carcinogenicità) ed esegui la previsione.
5. Seleziona i composti con tossicità previste che superano le soglie di sicurezza predefinite basate sui risultati ProTox 3.0 (Tabella 2).
6. Compila i composti che superano sia lo screening ADMET che ProTox 3.0 in un database strutturato dei componenti del farmaco (ad esempio, formato Excel o CSV) con colonne per nome del composto, SMILES e stato di screening.
7. Accedi al sito SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/), seleziona Homo sapiens dal menu a tendina degli organismi, inserisci le stringhe SMILES dei componenti nel database dei componenti del farmaco, clicca sul pulsante Prevedere obiettivi e raccogli tutti i target previsti con un punteggio di Probabilità superiore a 0.
8. Accedi al sito web SEA (Similarity Ensemble Approach) (https://sea.bkslab.org/) e inserisci le stesse stringhe SMILES usate sopra per la previsione del target e filtra i risultati per mantenere solo le voci nel campo Target Key che terminano con _Human e hanno un p-valore inferiore a 0,05.
9. Combinare le liste di obiettivi ottenute da SwissTargetPrediction e SEA in un'unica libreria di bersagli per azione di farmaci. Rimuovere i bersagli duplicati e standardizzare i nomi dei bersagli con simboli genici ufficiali (ad esempio, utilizzando le linee guida HGNC) tramite Uniprot (https://www.uniprot.org/).
   NOTA: La libreria target drug-action può essere salvata come file CSV per un uso successivo.

Tabella 1: Criteri di soglia ADMETlab 3.0 per lo screening della sicurezza dei farmaci. La tabella riassume i valori di soglia raccomandati e gli intervalli di classificazione per le proprietà fisicochimiche chiave, i parametri ADME, le interazioni metaboliche, gli endpoint di tossicità, i percorsi di tossicità e le regole tossicofore. Le previsioni sono suddivise in tre livelli di rischio (basso, medio e alto) in base ai valori di probabilità (< 0,3, 0,3 - 0,7, > 0,7) o intervalli quantitativi, consentendo una valutazione sistematica dei profili di sicurezza dei composti durante la scoperta precoce del farmaco. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Tabella 2: Criteri di soglia ProTox-3.0 per la previsione della tossicità nella scoperta di farmaci. La tabella riassume i principali endpoint di tossicità previsti da ProTox 3.0, con particolare attenzione ai parametri critici per la valutazione della sicurezza del farmaco durante la scoperta precoce. Ogni endpoint restituisce una classificazione binaria (Attiva o Inattiva) accompagnata da un punteggio di probabilità (0-1), dove Attivo indica potenziale rischio di tossicità. La priorità dovrebbe essere data alle tossicità degli organi (epatotossicità, cardiotossicità), agli endpoint di tossicità (carcinogenicità, mutagenicità, immunotossicità) e all'inibizione del metabolismo del CYP, poiché queste sono cause principali di abbandono clinico. Molteplici corrispondenti attivi tra endpoint suggeriscono un ampio potenziale potenziale di tossicità. La tossicità acuta viene valutata tramite la classe LD50 e GHS previste, con la Classe 1 - 3 (< 300 mg/kg) considerata altamente tossica. I punteggi di probabilità forniscono livelli di fiducia per ogni previsione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

2. Acquisizione di obiettivi per la malattia

NOTA: Quando si esaminano i database, standardizza le convenzioni di denominazione dei geni target per prevenire omissioni causate da discrepanze di nomenclatura.

1. Accedi a cinque database correlati alle malattie: OMIM (https://www.omim.org/), Disgenet (https://disgenet.com/), TTD (https://ttd.idrblab.cn/), GeneCards (https://www.genecards.org/) e PharmGkb (https://www.pharmgkb.org/). Applica i seguenti criteri di screening specifici per il database: per le GeneCard, filtrare le voci con un punteggio di rilevanza ≥ 1.0; per DisGeNET, selezionare le voci associate alla malattia target; per PharmGKB, limitare i risultati alle voci legate ai geni selezionando l'opzione Gene ; per TTD, mantenere le voci in cui la colonna Malattia corrisponde alla malattia target.
2. Per ogni database, usa il nome ufficiale della malattia target (ad esempio, Alzheimer) come parola chiave di ricerca per recuperare tutti i target associati.
3. Raccogli le liste dei target di tutti e cinque i database in un unico foglio di calcolo. Rimuovi i target duplicati confrontando i simboli genici tra le liste.
4. Standardizzare tutti i nomi dei target rimanenti in simboli genici ufficiali tramite Uniprot per risolvere le incongruenze di nomenclatura. Salvare la lista standardizzata e deduplicata come libreria target per malattie (formato CSV o Excel).
   NOTA: La libreria target per malattie può essere salvata insieme alla libreria target d'azione farmacologica (Passo 1.9) per un uso successivo nel Passo 3.

3. Acquisizione di bersagli comuni per malattie farmaceutrici

1. Accedi allo strumento web Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). Importa la libreria target di azione farmacologica (Passo 1.9) e la libreria target di malattie (Passo 2.4) nei due campi di input di Venny 2.1.0 per creare un diagramma di Venn che mostri la sovrapposizione tra i due set target.
2. Estrai gli obiettivi di intersezione dai risultati del diagramma di Venn. Etichettali come target comuni tra farmaci e malattie (potenziali punti di interazione) e salvali come file CSV.

4. Costruzione di reti di interazione proteina-proteina (PPI) e analisi dei bersagli principali

1. Accedi al database STRING (https://cn.string-db.org/). Seleziona Homo sapiens come Organismo dal menu a tendina.
2. Importare i target comuni di malattie farmacologiche (Passo 3.2) nel campo di input STRING. Impostare il parametro minimo richiesto del punteggio di interazione ad alta fiducia (0,700) e cliccare su Ricerca per generare dati PPI. Esportare i dati PPI come file TSV (valori separati da tabulazione).
3. Apri il software Cytoscape con il plugin CytoNCA preinstallato. Importa il file PPI TSV in Cytoscape usando File > Import > Network dal menu File .
4. Avvia il plugin CytoNCA cliccando su Apps > CytoNCA > Open. Seleziona cinque metriche di riferimento per lo screening dei target principali: Betweenness, Closeness, Degree, Eigenvector e LAC.
   NOTA: Cinque metriche topologiche chiave utilizzate sono: Betweenness (centralità di intermedio, che misura la frequenza di un bersaglio che appare su tutti i percorsi più corti della rete), Closeness (centralità di vicinanza, che riflette la lunghezza media del percorso più breve da un bersaglio a tutti gli altri target della rete), Degree (grado locale di connessione, che quantifica il numero di interazioni dirette tra un bersaglio e altri bersagli), Autovettore (centralità dell'autovettore, ponderando sia la connettività del bersaglio sia l'importanza dei suoi bersagli connessi), e LAC (connettività media locale, che valuta la densità di connessione tra i nodi vicini diretti di un bersaglio).
5. Avvia l'analisi di rete cliccando su Strumenti > menu Analizza Rete , poi clicca su OK. Esporta i risultati dell'analisi in una tabella CSV.
6. Calcola il valore mediano per tutte e cinque le metriche e conserva gli obiettivi che raggiungono o superano la mediana. Ripeti il Passo 4.5 più volte finché non restano 10-20 bersagli.
7. Classifica i target rimanenti in base alla metrica di grado (dal più alto al più basso) e seleziona preliminarmente i primi 10 target come geni core. Salva la lista dei geni core come file CSV.
   1. Per ridurre i falsi positivi e garantire che solo bersagli strutturalmente idonei procedano all'agganciamento, eseguire ulteriori valutazioni per la fattibilità strutturale e la farmacologia: controllare il database PDB per strutture cristalline ad alta risoluzione disponibili (≤ 2,5 Å) o valutare se è possibile costruire un modello di omologia affidabile; utilizzare strumenti di previsione tascabile per confermare la presenza di siti di legame adeguati; e incrociare il riferimento con la letteratura o i database funzionali per verificare la rilevanza documentata per il percorso della malattia.
   2. Deprioritizza i target che non hanno disponibilità strutturale, sacche farmacologiche o rilevanza per la malattia per gli studi di attracco. L'analisi di arricchimento GO e KEGG può comunque essere eseguita utilizzando l'elenco completo dei core target di questo passaggio, poiché non richiede informazioni strutturali.
      NOTA: Il numero di geni nei Passaggi 4.6 e 4.7 può essere modificato secondo necessità. Tipicamente, dopo lo Passo 4.6 rimangono da 10 a 20 bersagli, e si raccomanda mantenere almeno 10 geni core nello Passo 4.7 per garantire un volume di dati sufficiente per un'analisi affidabile dell'arricchimento GO e KEGG e tendenze di visualizzazione coerenti.

5. Analisi e visualizzazione dell'arricchimento GO e KEGG

NOTA: Questa parte chiarisce le funzioni geniche a livello di componente cellulare, funzionale e via intracellulare.

1. Accedi allo strumento web DAVID (https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp). Seleziona Gene List come tipo di input e importa i geni core nel campo di input.
2. Imposta l'Identificatore su OFFICIAL_GENE_SYMBOL e seleziona Homo sapiens in Specie Selezionata. Poi, clicca su Invia Lista per caricare i geni principali.
3. Per l'analisi di arricchimento GO, seleziona le categorie GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT e GOTERM_MF_DIRECT .
4. Per l'analisi di arricchimento KEGG, selezionare la categoria KEGG_PATHWAY . Impostare la soglia di significatività a p < 0,05 sia per le analisi GO che KEGG.
5. Clicca sul Diagramma di Annotazione Funzionale per generare i risultati di arricchimento. Esporta i risultati GO e KEGG come file CSV. Usa il software R Studio con ggplot2 per creare grafici a barre o bubble plot per i 10 termini/percorsi arricchiti principali.
   NOTA: Il numero di termini/percorsi visualizzati può essere regolato in base alle esigenze.

6. Attracco molecolare usando Autodock Vina

NOTA: Il Passo 6 e il Passo 7 sono entrambi passaggi di aggancio molecolare. Il Passo 6 utilizza il software AutoDock Vina 1.1.2, mentre il Passo 7 utilizza YASARA 10.3.16. L'uso di YASARA facilita la successiva simulazione della dinamica molecolare di YASARA. Se sono necessari i risultati di attracco di AutoDock Vina, i risultati di aggancio in YASARA dovrebbero essere coerenti con quelli di AutoDock Vina. Questo evita discrepanze causate dal cambio software e garantisce anche l'affidabilità dei risultati di validazione della simulazione della dinamica molecolare, con un metodo dettagliato: apri il risultato "result.pdb" dello Passo 6.31 usando LigPlot+ (Versione 2.3) per generare un diagramma di interazione 2D, identifica i residui chiave che interagiscono con il ligando, poi seleziona i residui chiave nel passo di attracco 7.18 di YASARA e imposta la dimensione della scatola per coprire la tasca di legaggio, in modo da massimizzare la consistenza dei siti di attracco tra Vina e YASARA. Successivamente, quando si selezionano i risultati di docking ottimali nel Passo 7.19, assicurarsi che i residui chiave di interazione tra ligando e recettore rimangano coerenti con quelli identificati dai risultati di AutoDock Vina. Questo requisito di coerenza si concentra sulla conservazione dei modelli di interazione essenziali piuttosto che sulla corrispondenza atomica esatta; sono previste variazioni minori nelle conformazioni dei residui periferici dovute a differenze nella parametrizzazione del campo di forza e nella flessibilità della catena laterale. Finché le interazioni critiche con i residui chiave del sito attivo sono conservate, i risultati dell'aggancio possono essere considerati coerenti per scopi di validazione incrociata. Se l'attracco Vina AutoDock (Passo 6) non è richiesto, il Passo 7 può essere eseguito direttamente.

1. Ottieni l'SDF (Structure Data File) dei composti farmacologici chiamati ligand.sdf dal database PubChem cercando le corrispondenti stringhe SMILES (Passo 1.1).
2. Apri file SDF utilizzando il software Chem3D. Nell'opzione Calcolo, seleziona MM2 e clicca su Minimizza Energia per effettuare la minimizzazione dell'energia libera della struttura composta.
3. Salva la struttura minimizzata come file ligand.mol2 selezionando File > Salva come. Ottieni il file di formato PDB (Protein Data Bank) del recettore proteico del gene centrale dal database RCSB PDB (https://www.rcsb.org/; cerca per ID PDB o nome gene) denominato receptor.pdb.
   1. Prioritizza strutture con risoluzione ≤ 2,5 Å e siti di legame risolti se disponibili. Quando si seleziona una struttura, si esamina la voce per completezza (ad esempio, presenza di tutti i domini attesi, assenza di grandi anelli irrisolti), potenziali mutazioni che potrebbero influenzare il legame dei liganti e se sono inclusi cofattori funzionalmente importanti (ad esempio, eme, ioni metallici) o liganti co-cristallizzati.
   2. Per bersagli con assemblaggi oligomerici noti, si consideri se la forma monomerica o multimerica sia appropriata per la domanda di ricerca; l'assemblaggio biologico può essere scaricato se sono rilevanti interazioni dimeriche o di ordine superiore. La struttura scelta sarà preparata ulteriormente nelle fasi successive, quindi l'ispezione iniziale aiuta a evitare complicazioni a valle.
4. Apri il receptor.pdb usando il software PyMOL. Digita remove organic nella riga di comando e premi Invio per eliminare i liganti a piccole molecole dalla struttura proteica.
   NOTA: Se si utilizza il ligando co-cristallizzato per definire il sito di legame, prima registra le coordinate centrali 3D del ligando, poi digita remove organic nella riga di comando di PyMOL e premi Invio per eliminare piccole molecole co-cristallizzate; altrimenti, esegui direttamente il comando remove organic per rimuovere piccole molecole co-cristallizzate.
5. Tipare rimuovere solvente nella riga di comando e premere Invio per rimuovere molecole d'acqua libere dalla struttura proteica; utilizzare il comando select metal_cofactor, resn [nome residuo del cofattore target] per identificare ioni o cofattori metallici funzionalmente critici (ad esempio, HEM, Zn²⁺, Mg²⁺) e confermarne la ritenzione nella struttura.
6. Esporta il recettore pulito da PyMOL come receptor_clean.pdb cliccando su File > Esporta molecola > Salva.
7. Apri receptor_clean.pdb in UCSF Chimera 1.19. Visualizza la sequenza cliccando su Strumenti > Sequenza > Sequenza per ispezionare la presenza di anelli mancanti adiacenti al sito di collegamento (le regioni mancanti sono indicate da riquadri rossi dei contorni). Se sono presenti anelli mancanti, ricostruiscili selezionando Struttura > Modellatore (anelli/raffinamento) dal menu della finestra della sequenza, scegliendo la struttura mancante non terminale, impostando un numero appropriato di modelli (ad esempio 5) e procedendo con il calcolo. Dopo il completamento, seleziona il modello più ragionevole.
8. Ottimizza la struttura in Chimera. Usa lo strumento Rotamers (libreria Dunbrack) su residui selezionati per ottimizzare le catene laterali, aggiungendo Clash e H-Bonds tramite il menu Columns per la valutazione e selezionando conformazioni con scontri minimi (0 - 1 preferito) e legami H favorevoli. Poi aggiungi idrogeno e assegna cariche usando Dock Prep (AMBER ff14SB). Infine, effettua la minimizzazione dell'energia con lo strumento Minimize Structure, fissando gli atomi della backbone selezionandoli (sel @ca,c,n,o), invertendo la selezione e abilitando gli atomi fissi. Salva la struttura elaborata come receptor_optimized.pdb selezionando File > Save PDB.
   NOTA: Saltare l'ottimizzazione della catena laterale per residui ben ordinati. La preparazione del dock gestisce automaticamente la protonazione. La minimizzazione deve essere eseguita con la spina dorsale fissata.
9. Riapri receptor_optimized.pdb in PyMOL e definisci il sito di legame canonico. Se è presente un ligando co-cristallizzato, usa le sue coordinate per centrare la griglia: registra il centro del ligando, poi rimuovilo con rimuovere organico. Se non è disponibile un ligando co-cristallizzato, definisci il sito di legame basandosi sui residui chiave noti dalla letteratura (ad esempio, seleziona binding_site, resi XXX-XXX) oppure identificando visivamente la presunta tasca di legame utilizzando strumenti di previsione delle tasche per validare la valutazione visiva. Registra le coordinate centrali 3D (x/y/z) del sito definito per l'installazione della scatola della griglia.
   NOTA: Le coordinate qui registrate sono utilizzate per centrare la griglia AutoDock Vina. Per una definizione basata sui residui, il centro geometrico dei residui selezionati deve essere calcolato; per una tasca identificata visivamente o da strumenti di previsione, si impiega il centro della cavità. Quando si definisce il sito di legame, bisogna considerare se la strategia di aggancio prevista mira il sito ortosterico (attivo) o un sito allosterico. Per il targeting ortoterico, il sito di legame dovrebbe essere definito in base a un ligando co-cristallizzato o residui a sito attivo conservati riportati in letteratura. Per il targeting allosterico, possono essere utilizzati strumenti di previsione delle tasche per identificare potenziali siti allosterici, in particolare per target con regolazioni allosteriche note. In assenza di informazioni pregresse, il collegamento globale seguito da un clustering di hotspot di legame previsti può aiutare a identificare potenziali siti allosterici. Questa flessibilità consente al protocollo di accogliere campagne di scoperta di farmaci sia ortoteriche che allosteriche.
10. Esporta la struttura ottimizzata finale da PyMOL come receptor.pdb cliccando su File > Esporta molecola > Salva.
11. Apri receptor.pdb in AutoDock Tools 4.2.6 cliccando su File > Leggi molecola. Definisci residui flessibili. Clicca su Modifica > Residui flessibili > Seleziona Residui e scegli residui del sito di legame che si prevede subiranno cambiamenti conformazionali al momento del legame dei liganti (seleziona ≤ 10 residui).
    NOTA: Questo passaggio permette a alcune catene laterali selezionate di muoversi durante l'attracco, tenendo conto degli effetti di adattamento industi.
12. Salva il recettore con residui flessibili come file PDB. Clicca su File > Salva, seleziona Scrivi PDB dal menu a tendina. Nella finestra dei record PDB disponibili, seleziona ATOM e CONNECT, clicca su ADD, poi su OK. Salva il file come receptor.pdb.
    NOTA: Questo file PDB contiene informazioni sui residui flessibili e sarà utilizzato per generare il file PDBQT.
13. Prepara la macromolecola per l'aggancio. Clicca su Griglia > Macromolecola > Scegli, seleziona il file receptor.pdb e seleziona Molecola. Salva il recettore come file PDBQT cliccando su File > Salva come e chiamalo receptor.pdbqt.
    NOTA: AutoDock Tools assegna cariche e tipi di atomi, salvando il recettore nel formato nativo PDBQT di AutoDock, pronto per la generazione di grid box e i calcoli di docking.
14. Clicca sul menu Ligando , seleziona Input, poi clicca su Apri. Seleziona ligando.mol2 e clicca OK. Clicca sul menu Ligando , seleziona Torsioni, poi clicca su Rileva Torsioni. AutoDock Tools identificherà automaticamente i legami rotabili nella struttura del ligando (ad esempio, legami singoli nelle catene alchiliche, legami ammidi esclusi i legami peptidici).
15. Nella finestra di Selezione di Torsione, verifica i legami rotabili rilevati (conserva tutti i legami rotabili validi, escludendo legami rigidi come quelli ad anello aromatico). Clicca su Imposta per confermare le definizioni di torsione, poi clicca su Chiudi.
    NOTA: Il mantenimento di legami rotabili validi garantisce che il ligando possa adottare conformazioni diverse durante l'aggancio (ligando flessibile), mantenendo il recettore rigido — questo è il nucleo dell'attracco semi-flessibile in AutoDock Vina.
16. Clicca di nuovo sul menu Ligando, seleziona Output, poi clicca su Salva come PDBQT. Nomina il file ligand.pdbqt e salvalo nella stessa directory di receptor.pdbqt.
17. Clicca sul menu Visualizzazione , seleziona Struttura Secondaria. Clicca su Solo Visualizzazione, poi seleziona Linee e clicca su Rimuovi per semplificare la visualizzazione proteica.
18. Clicca sul menu Griglia , seleziona Riquadro della Griglia. Regola i valori di x, y, z (coordinate centrali) e Spaziatura (Å) per posizionare la casella sopra il sito attivo della proteina.
    NOTA: Se il sito di legame è sconosciuto, utilizzare strumenti di previsione delle tasche (ad esempio, CASTp, DoGSite) per identificare le tasche di legame presunte. Coprire l'intera proteina aumenta significativamente i falsi positivi e i costi computazionali e non è raccomandato.
19. Clicca su File > Chiudi il momento di salvataggio corrente, poi clicca su Griglia > Output > Salva GPF per salvare le impostazioni della griglia come Grid.gpf.
20. Apri Grid.gpf con un editor di testo e registra il centro della griglia (valori x, y, z) e gli npt (valori di dimensioni x, y, z) dal file.
21. Crea un nuovo file di testo chiamato Config.txt e scrivi il seguente contenuto:
    recettore = recettore.pdbqt
    ligando = ligando.pdbqt
    center_x = [valore x centro della griglia da Grid.gpf]
    center_y = [valore y del centro della griglia da Grid.gpf]
    center_z = [valore z del centro della griglia da Grid.gpf]
    size_x = [npts x valore da Grid.gpf]
    size_y = [npts valore y da Grid.gpf]
    size_z = [npts z valore da Grid.gpf]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    Sostituisci il testo tra parentesi con valori da Grid.gpf (Passo 6.19).
    NOTA: Il parametro energy_range dovrebbe essere impostato come la differenza massima di energia ammissibile rispetto al modello combinato ottimale, con unità in kcal/mol. Ad esempio, impostarlo a 5 significa che AutoDock Vina terminerà i calcoli una volta che la differenza energetica rispetto al modello ottimale raggiunge 5 kcal/mol. Inoltre, num_modes specifica il numero di modelli di legame da generare, che è tipicamente impostato a 10.
22. Inserisci i file vina_split.exe e vina.exe nella stessa cartella di receptor.pdbqt, ligand.pdbqt e Config.txt.
23. Apri la Console di Sistema Windows, naviga nella directory usando il comando cd (ad esempio, cd C:\DockingFiles).
24. Digita il seguente comando e premi Enter: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
25. Aspettare che l'attracco sia completato (la durata varia a seconda del sistema). Appariranno due file: log.txt (risultati dell'attracco) e output.pdbqt (struttura dei liganti a energia più bassa). Per garantire la riproducibilità, vengono eseguite tre corse di attracco indipendenti con diversi semi casuali. Un RMSD < 1,0 Å tra le posizioni principali conferma la coerenza.
    NOTA: Come riferimento empirico, le energie di legame Vina dell'AutoDock (kcal/mol) possono essere interpretate come: ≤ -7 (alta affinità, potenziali conformazioni attive), -7 a -5 (affinità moderata), ≥ -5 (bassa affinità). Queste soglie dipendono dal sistema e devono essere validate con dati sperimentali.
    1. Per valutare la precisione dell'aggancio e la capacità di discriminazione per un bersaglio specifico, sono raccomandati due approcci di validazione complementari. Utilizzare la validazione del reaccoppiamento utilizzando liganti cristallografici per valutare se il protocollo può riprodurre modalità di legame osservate sperimentalmente, con RMSD < 2.0 Å come criterio standard di accettazione.
    2. Utilizzare l'analisi di arricchimento utilizzando dataset di benchmark pubblici (ad esempio, DUD-E) per valutare la capacità del protocollo di distinguere composti attivi veri da esche abbinate a proprietà; ciò comporta il calcolo delle curve ROC (che fornisce una misura globale delle prestazioni di classificazione) e di fattori di arricchimento come EF1% (quantificazione dell'arricchimento degli attivi nella frazione più alta). Insieme, questi passaggi di validazione aiutano a stabilire i cutoff di affinità appropriati e a garantire prestazioni di screening affidabili per la classe target di interesse.
26. Apri il software PyMOL. Importa output.pdbqt e receptor.pdbqt cliccando su File > Apri. Salva la struttura combinata come result.pdb cliccando su File > Salva come.
27. Libera lo spazio di lavoro PyMOL cliccando su File > Nuova Sessione, poi riapri result.pdb per visualizzare il complesso ligando-proteina.

7. Aggancio molecolare usando YASARA

NOTA: Questo passaggio funge da ri-docking preciso e pre-processing per la successiva simulazione della dinamica molecolare (MD) ed è una verifica progressiva dei risultati preliminari ad alta produttività dello Step 6. Il Step 6 utilizza AutoDock Vina, lo strumento standard per lo screening virtuale ad alta produttività, per selezionare rapidamente le molecole candidate con eccellente affinità di legame dalla libreria di composti. Questo passaggio adotta YASARA per l'aggancio, poiché il suo modulo di docking è pienamente compatibile con la piattaforma di simulazione MD YASARA, che può evitare deviazioni strutturali causate dalla conversione del formato file e dal cambio software, fornendo una struttura complessa iniziale standardizzata per simulazioni MD successive. Per tutte le molecole candidate selezionate da AutoDock Vina nello Step 6, i risultati dell'aggancio (inclusa la posizione di legame nella tasca attiva e le interazioni chiave degli amminoacidi) ottenuti in questo passaggio devono essere coerenti con quelli di AutoDock Vina, e la classificazione relativa dell'affinità di legame deve mantenere la stessa tendenza prima di procedere con la simulazione MD. I punteggi assoluti di docking non sono direttamente comparabili tra i due software a causa di algoritmi di calcolo differenti. Questo requisito di coerenza può eliminare i falsi positivi causati da differenze software, garantire la stabilità delle caratteristiche di legame delle molecole candidate e garantire l'affidabilità e la continuità logica della successiva validazione della simulazione MD.

1. Utilizza OpenBabel per convertire il file ligand.sdf nel file ligand.pdb.
   NOTA: OpenBabel viene utilizzato qui solo per la conversione di formati. La parametrizzazione effettiva del ligando per la dinamica molecolare sarà eseguita automaticamente da YASARA nei passaggi successivi.
2. Apri il software YASARA. Clicca su File > Carica e seleziona ligand.pdb per importare il ligando. Clicca su Modifica > Pulire > Tutto per rimuovere i difetti strutturali dal ligando.
   NOTA: Questo passaggio esegue la pulizia geometrica di base. YASARA assegnerà quindi automaticamente i parametri del campo di forza al ligando utilizzando la sua tecnologia AutoSMILES integrata, che applica le cariche General AMBER Force Field (GAFF) e AM1-BCC per garantire la compatibilità con il campo di forza AMBER14 utilizzato per la proteina. Questa parametrizzazione è essenziale per calcoli energetici accurati sia nelle simulazioni di attracco che in quelle MD.
3. Clicca su Opzioni > pH predefinito, seleziona il pH appropriato (ad esempio, 7,4 per condizioni fisiologiche) e clicca OK.
4. Clicca su Dock > campo di forza per impostare il campo di forza di attracco, garantendo la coerenza dei parametri con le simulazioni MD successive.
   NOTA: AMBER14 è il campo di forza raccomandato per questo flusso di lavoro di scoperta di farmaci in YASARA 10.3.16, poiché fornisce una copertura completa dei parametri per le proteine ed è pienamente compatibile con i protocolli standard di simulazione MD. Per i residui proteici standard, i parametri sono assegnati automaticamente dai template integrati del campo di forza. Per i liganti a piccole molecole, YASARA esegue automaticamente la parametrizzazione utilizzando la sua tecnologia AutoSMILES integrata, che assegna tipi di atomi GAFF (General AMBER Force Field) e cariche AM1-BCC. Questo garantisce compatibilità tra parametri proteici e liganti, consentendo calcoli energetici accurati sia in simulazioni di docking che MD. Un campo di forza più appropriato può essere selezionato in base alla versione effettiva di YASARA utilizzata e alle caratteristiche specifiche del sistema.
5. Clicca su Simulatore > Definisci la cella di simulazione > attorno a tutti gli atomi per impostare il confine di lavoro. Clicca su Simulatore > Limiti della cella > Periodico per abilitare condizioni al contorno periodiche.
6. Clicca su Opzioni > Scegli esperimento > minimizzazione dell'energia, poi clicca su Esegui per minimizzare l'energia del ligando.
7. Clicca su File > Salva come, nomina il file ligand.pdb e clicca OK per sovrascrivere il file PDB originale del ligando. Clicca su File > Nuovo per liberare lo spazio di lavoro, poi su File > Carica e seleziona il file receptor.pdb.
8. Ripeti i passaggi 7.2 a 7.7 per il recettore proteico, salvando il file elaborato come nuovo file receptor.pdb.
9. Clicca su File > Nuovo, poi su File > Carica e seleziona sia ligand.pdb che receptor.pdb. Ripeti i passaggi da 7.3 a 7.5 per impostare il pH, definire la cella di simulazione e abilitare i confini periodici per il complesso.
10. Clicca su Processori > Imposta CPU e seleziona il numero di core CPU da utilizzare. Clicca su Processori > Imposta GPU e seleziona il dispositivo GPU per accelerare i calcoli.
11. Clicca su File > Salva come > scena YASARA, dai un nome al file sce\nesult.sce (crea la cartella sce se non esiste) e clicca su OK.
12. Clicca su Opzioni > Macro&Film > Imposta target, seleziona sce\nesult.sce e clicca OK. Clicca su Opzioni > macro & Film > Play, seleziona il file macro dock_run.mcr e clicca OK.
13. Clicca su Simulatore > Definisci la cella di simulazione > attorno ad atomi selezionati e ripeti 7.5, poi clicca su Continua per iniziare l'aggancio.
14. Attendere il completamento dell'agganciamento. Verranno generati file con il suffisso yob; name.log contiene l'energia di legame e i Residui del Recettore di Contatto.
    NOTA: Per garantire la razionalità della validazione della simulazione della dinamica molecolare, seleziona il risultato dell'attracco in YASARA che sia coerente con il risultato dell'attracco di AutoDock Vina.

8. Simulazione della dinamica molecolare

1. Clicca su File > Nuovo per cancellare l'area di lavoro. Poi clicca su File > Carica > oggetto YASARA e seleziona result.yob.
2. Nel pannello CONTENUTO della Scena (a destra), espandi tutte le voci Mol. Clicca su Modifica > Divide > Oggetto, seleziona tutti i contenuti Mol nel pannello Sequenza e clicca OK.
3. Clicca su Modifica > Unisci > oggetto, seleziona tutti i contenuti Mol tranne la prima e l'ultima voce (ligando) e clicca su OK. Seleziona la prima voce Mol e clicca di nuovo su OK per ricollegare la proteina.
4. Procedi a rinumerare i componenti. Seleziona Rinumera sotto Modifica e clicca su Oggetti. Questo genera due parti: la prima è il complesso proteico-recettore, la seconda parte è il ligando a piccole molecole.
5. Clicca su Modifica > Trasferimento, poi clicca sull'opzione Oggetto dalla lista a tendina. Nel pannello Sequenzia, seleziona prima il contenuto di ligando a piccole molecole cliccando sulla voce corrispondente. Poi seleziona il contenuto del recettore proteico cliccando sulla sua voce e clicca su OK per confermare la coppia di selezione.
6. Nella finestra pop-up successiva, seleziona l'opzione che inizia con Correggi atomi sullo schermo durante il trasferimento e clicca su OK.
7. Ripeti i passaggi 7.2 a 7.5, poi clicca su Simulatore > Temperatura e seleziona 298K. Clicca su File > Salva come > scena YASARA, nomina il file sce\nesultrun.sce e clicca OK.
8. Clicca su File > Nuovo per cancellare l'area di lavoro. Poi clicca su Opzioni > Macro&Movie > Imposta il target, seleziona sce\nesultrun.sce e clicca OK.
9. Assicurati che il campo di forza selezionato nello Passo 7.4 sia utilizzato anche per la simulazione MD; la macro md_run.mcr eredita tipicamente le impostazioni attuali del campo di forza. Clicca su Opzioni > macro Macro&Film > Play, seleziona il file macro md_run.mcr e clicca OK per avviare la Simulazione della Dinamica Molecolare.
10. Eseguire tre simulazioni MD indipendenti (3 x 100 ns) con velocità iniziali diverse per il complesso proteina-ligando e condurre un'analisi statistica delle tre traiettorie per garantire l'affidabilità dei risultati. Durante l'operazione, verranno generati file in formato sim. Ad esempio, se la traiettoria viene salvata ogni 100 ps, una simulazione a 100 ns genererà 1000 file con il suffisso sim.
11. Una volta completato il Passaggio 8.10, clicca su Opzioni > Macro&Movie > Imposta il target, seleziona il file sce\nesultrun.sce e clicca OK.
12. Clicca su Opzioni > Macro e Film > Riproduci, seleziona md_analyze.mcr, md_analyzebindenergy.mcr e md_analyzeres.mcr e clicca OK.
13. Dopo che tutte e tre le analisi saranno completate, verranno generati i corrispondenti file di dati result_run_analysis.tab, result_run_bindenergy.tab e result_run_analysisres.tab.
14. Per prima cosa, analizza result_run_analysis.tab, che fornisce 10 parametri fondamentali: Energia (energia totale del sistema), Legame (energia del legame), Angolo (energia dell'angolo di legame), Diedro (energia dell'angolo diedrale), Planarità (energia di planarità), Coulomb (energia elettrostatica), VdW (energia di van der Waals), CA (Cα RMSD della proteina RMSD), Backbone (RMSD della colonna vertebrale proteica) e HeavyAtoms (RMSD di atomi pesanti).
15. Estrarre la colonna Tempo (ns) e le relative colonne dei parametri per valutare se il sistema raggiunge l'equilibrio energetico. Confermare la stabilità del sistema stabilizzando l'energia potenziale entro un intervallo di fluttuazione ristretto dopo i primi 10 - 20 ns. Valutare la stabilità conformazionale monitorando la deviazione quadratica media (RMSD) degli atomi di Cα, della dorsale proteica e degli atomi pesanti. La simulazione è stata ritenuta strutturalmente stabile una volta che questi valori RMSD hanno raggiunto un plateau.
16. Come punti di riferimento empirici per complessi proteina–ligando di dimensioni tipiche, i valori RMSD di Cα e della spina dorsale che si stabiliscono sotto 2,5 Å, insieme a RMSD di atomi pesanti sotto 3,5 Å, possono essere considerati indicatori di supporto della stabilità conformazionale. In modo fondamentale, si utilizza il criterio primario e obbligatorio e la presenza di una fase di plateau chiara nella traiettoria RMSD, piuttosto che una rigida aderenza a questi valori numerici da sola.
    NOTA: Questi valori di soglia sono empirici e devono essere interpretati nel contesto della dimensione e flessibilità specifica della proteina. L'indicatore decisivo della convergenza è un plateau sostenuto, che indica che la struttura si è stabilizzata attorno a un insieme conformazionale coerente.
17. Successivamente, analizza result_run_bindenergy.tab, che fornisce l'energia di legame tra il ligando e il bersaglio lungo la traiettoria della simulazione. Calcola l'energia media di legame per tutto il periodo di simulazione. Nell'implementazione MM-PBSA di YASARA, valori più positivi indicano un legame più forte. Un'interazione moderatamente forte e stabile è tipicamente indicata da un'energia di legame media positiva e sufficientemente grande (il valore numerico specifico dipende dal sistema ma può essere calibrato rispetto a leganti noti o dati sperimentali), insieme a una deviazione standard piccola rispetto alla media (ad esempio, coefficiente di variazione < 50 - 60%), riflettendo una fluttuazione limitata durante la simulazione.
    NOTA: L'energia di legame riportata in questo passaggio viene calcolata utilizzando il rigoroso metodo MM-PBSA, in contrasto con il macro di energia di legame predefinito YASARA che impiega un'approssimazione più rapida (BoundaryFast). L'approssimazione predefinita è adatta per screening rapido o confronti relativi, mentre il metodo MM-PBSA è raccomandato per ottenere energie assolute libere di legame più accurate. Come esplicitamente affermato dall'autore nell'intestazione macro YASARA: Più energie positive indicano un legame migliore, le energie negative NON indicano nessun legame. Pertanto, gli utenti dovrebbero interpretare i valori positivi come indici di un legame più forte, con la magnitudine numerica che dipende dal sistema specifico proteina-ligando.
18. Infine, analizza il file result_run_analysisres.tab, che fornisce dati per residuo inclusi ID residuo, RMSD, Backbone RMSD, HeavyAtoms RMSD e RMSF. Focalizza l'analisi sulla fase di produzione stabile identificata. Per prima cosa, identifica i residui all'interno del sito attivo del bersaglio (ad esempio, quelli entro 5 Å dal ligando). Poi, utilizza i dati per valutare la stabilità conformazionale di questi singoli residui del sito attivo durante la simulazione.
    NOTA: Come punti di riferimento empirici per residui stabili in sito attivo nei complessi proteina-ligando, valori RMSF inferiori a 1,0 Å e le fluttuazioni RMSD entro 1 - 1,5 Å durante la fase stabile sono generalmente considerati indicatori di conformazioni locali ben mantenute. I residui con RMSF superiore a 2,0 Å possono indicare maggiore flessibilità; tali residui dovrebbero essere mappati sulla struttura tridimensionale per determinare se corrispondono a regioni flessibili funzionalmente rilevanti (ad esempio, anelli o aree superficiali) o indicano una potenziale instabilità all'interno della tasca di legame. Queste linee guida numeriche non sono regole assolute; il criterio principale è l'assenza di una grande deriva conformazionale, che dovrebbe essere valutata in concomitanza con la convergenza complessiva del sistema stabilita.
19. Una volta organizzati i file dati, importare i dati organizzati in Prism per generare i grafici corrispondenti.

Risultati

Dopo l'analisi farmacologica di rete della loratadina contro la rinite allergica (AR), l'interazione tra loratadina e PTGS2 è stata selezionata come studio di caso rappresentativo per illustrare l'applicazione passo dopo passo del protocollo di docking molecolare e simulazione MD. Questo esempio è destinato a dimostrare l'esecuzione del flusso di lavoro e l'interpretazione dei dati, piuttosto che fornire una validazione biologica dell'interazione specifica. Per la valutazione quantitativ...

Discussione

Importanza e passi critici
Questo protocollo combina farmacologia di rete, docking molecolare e simulazione della dinamica molecolare, offrendo vantaggi distinti rispetto ai metodi autonomi o ai flussi di lavoro a doppia combinazione, e può aiutare a colmare le principali inefficienze e lacune di affidabilità nella scoperta attuale dei farmaci. L'intero processo si basa su tre fasi critiche che ne garantiscono l'affidabilità, ognuno affrontando una sfida fondamentale ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ADMETlab 3.0	Istituto di Materia Medica di Shanghai (SIMM), Accademia Cinese delle Scienze	N/A	Piattaforma online per la previsione delle proprietà ADMET (Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo, Escrezione, Tossicità); Utilizzato per la valutazione dei profili farmacocinetici e tossicologici dei liganti (URL:  https://admetlab3.scbdd.com/)
Strumenti AutoDock (AutoDock 4)	L'Istituto di Ricerca Scripps	AutoDock 4.2.6	suite software per simulazioni di attracco molecolare; include AutoDock 4 per l'attracco e AutoDockTools (ADT) per la preparazione di file di input di proteine e liganni (aggiunta di idrogeni, assegnazione di cariche, impostazione di legami rotabili), definizione delle griglie di attracco e analisi dei risultati dell'attracco.
AutoDock Vina	L'Istituto di Ricerca Scripps	AutoDock Vina 1.1.2	software open-source per il docking molecolare; Utilizzato per prevedere affinità e posizioni di legame tra liganti a piccole molecole e recettori proteici
Chem3D	Informatica PerkinElmer	Chem3D 2024	Software di modellazione molecolare; Utilizzato per costruire, ottimizzare e visualizzare strutture 3D di liganti a piccole molecole
Cytoscape	Consorzio Cytoscape (Istituto per la Biologia dei Sistemi)	Cytoscape 3.10.3	software open source per visualizzare e analizzare reti biologiche; Utilizzato per costruire e modificare reti di interazione genico/proteina
DAVID (Database per Annotazione, Visualizzazione e Scoperta Integrata)	Istituto Nazionale di Allergie e Malattie Infettive (NIAID), USA	N/A	Strumento online per l'annotazione funzionale e l'analisi dell'arricchimento; utilizzata per eseguire analisi di arricchimento delle vie GO (Gene Ontology) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) dei geni target (URL:  https://david.ncifcrf.gov/)
DisGeNET Database	Centro di Supercalcolo di Barcellona (BSC)	N/A	Database delle associazioni geni-malattie; Utilizzato per identificare geni collegati a malattie specifiche (URL:  https://disgenet.com/)
GeneCards Database	Istituto Weizmann di Scienze	N/A	Database integrativo dei geni umani; Utilizzato per recuperare informazioni geniche complete (ad esempio, espressione, funzione, associazioni con malattie) (URL:  https://www.genecards.org/)
LigPlus	Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare - Istituto Europeo di Bioinformatica (EMBL-EBI)	LigPlus 2.3	Software per generare automaticamente diagrammi di interazione proteina-ligando 2D da file di coordinate 3D  . Rappresenta schematicamente legami idrogeno, contatti idrofobici e i residui del sito di legame. Disponibile alla registrazione con email accademica all'indirizzo   https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ .
OMIM Database	Scuola di Medicina dell'Università Johns Hopkins (in collaborazione con NCBI)	N/A	Eredità Mendeliana Online nell'Uomo; usata per recuperare informazioni sui disturbi genetici e sui loro geni associati (URL:  https://www.omim.org/)
OpenBabel	Team di sviluppo OpenBabel	N/A	Cassetta degli attrezzi chimici open source; Utilizzato per convertire formati di file molecolari (ad esempio, da .mol2 a .pdb) tra diverse piattaforme software
PharmGKB Database	Università di Stanford	N/A	Base di conoscenza sulla farmacogenomica; utilizzato per recuperare informazioni sulle interazioni geni-farmaco e sulle varianti farmacogenomiche (URL:  https://www.pharmgkb.org/)
Prisma	GraphPad Software	Prism 9	Utilizzato per la grafica scientifica, l'analisi dei dati (ad esempio, tracciare curve di distribuzione dell'energia di vincolaggio, analizzare barre di errore) e generare dati di qualità di pubblicazione.
ProTox 3.0	caritate; - Universitä Tsmedizin Berlino, Germania	N/A	Strumento online per prevedere gli endpoint tossicologici di piccole molecole; Utilizzato per valutare la potenziale tossicità dei liganti candidati (URL:  https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
PubChem Database	Centro Nazionale per l'Informazione Biotecnologica (NCBI), USA	N/A	Database pubblico di informazioni chimiche; usata per recuperare strutture 2D/3D e proprietà fisicochimiche di liganti a piccole molecole (URL:  https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
PyMOL	Schrö dinger, LLC	PyMOL 2.6.1	Software di visualizzazione molecolare; Utilizzato per visualizzare, modificare e generare immagini di alta qualità di complessi proteina-ligando
R Studio	Posit, PBC	Rstudio 2025.09.1+401	Ambiente di sviluppo integrato (IDE) per la programmazione R; Utilizzato per l'analisi statistica di dati biologici e la generazione di grafici GO/KEGG
RCSB PDB Database	Collaboratorio di Ricerca per la Bioinformatica Strutturale (RCSB)	N/A	Database delle strutture proteiche; usata per recuperare strutture 3D dei recettori proteici in formato PDB (URL:  https://www.rcsb.org/)
SEA (Approccio a Ensemble di Similarità)	L'Istituto di Ricerca Scripps	N/A	Strumento online per la previsione dei target basata sulla somiglianza chimica; usata per integrare SwissTargetPrediction per confermare i bersagli di ligando (URL:  https://sea.bkslab.org/)
STRING	Consorzio STRING (EBI, SIB, ecc.)	N/A	Database delle interazioni proteina-proteina conosciute e previste; Utilizzato per costruire reti di interazione genico/proteina (URL:  https://string-db.org/)
Previsione SwissTarget	Istituto Svizzero di Bioinformatica (SIB)	N/A	Server online per prevedere potenziali bersagli proteici di piccole molecole; Utilizzato per identificare i candidati recettori per i liganti (URL:  http://swisstargetprediction.ch/)
TTD Database	Istituto di Scoperta e Sviluppo di Farmaci (IDRBL), Università Sun Yat-sen	N/A	Database dei bersagli terapeutici; Utilizzato per recuperare informazioni su target di farmaci validati e potenziali (URL:  https://db.idrblab.net/ttd/)
UCSF Chimera	Risorsa per Biocomputing, Visualizzazione e Informatica (RBVI), Università della California, San Francisco	UCSF Chimera 1.19	Software per la visualizzazione e l'analisi molecolare; utilizzata per la preparazione della struttura proteica, inclusa la ricostruzione del loop mancante (tramite interfaccia Modeller), ottimizzazione delle catene laterali (libreria di rotamer di Dunbrack), aggiustamento dello stato di protonazione e minimizzazione dell'energia con campo di forza AMBER ff14SB. La versione 1.19 (rilasciata a marzo 2025) corregge le capacità di recupero della struttura PDB. Disponibile gratuitamente per uso non commerciale su   https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ .
UniProt Database	Consorzio UniProt (EBI, SIB, PIR)	N/A	Database completo di sequenze e funzioni proteiche; usata per recuperare sequenze proteiche, strutture e annotazioni funzionali (URL:  https://www.uniprot.org/)
Venny 2.1.0	Centro Nacional de Biotecnologie; a (CNB-CSIC), Spagna	N/A	Strumento online per generare diagrammi di Venn; Utilizzato per visualizzare sovrapposizioni tra insiemi genici (ad esempio, geni bersaglio da database diversi) (URL:  https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
YASARA	YASARA Biosciences	YASARA 10.3.16	Software di modellazione molecolare e simulazione; Utilizzato per l'aggancio molecolare (Passo 3.7) e per simulazioni successive di dinamica molecolare per validare i risultati dell'aggancio