Articolo metodologico

In vitro Valutazione degli effetti potenzianti delle molecole di origine vegetale sui biocidi convenzionali

DOI:

10.3791/70172

⸱

8 maggio 2026

 ,  ,  , 
1LEPABE, ALiCE, Faculty of Engineering, University of Porto, 2DEQB-Department of Chemical and Biological Engineering, Faculty of Engineering, University of Porto, 3LAQV/REQUIMTE, BioSIM, Department of Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Porto, 4Department of Chemical Engineering, Faculty of Science and Technology, University of Coimbra

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce un quadro sistematico per valutare come i fitochimici possano potenziare gli effetti battericidi dei biocidi tradizionali utilizzando la modellazione dell'attività battericida e i saggi di interazione combinatoria, che mirano a identificare miscele sinergiche che migliorano il controllo microbico e riducano l'uso complessivo di biocidi.

Abstract

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Sviluppare approcci innovativi ed efficienti per potenziare l'attività antimicrobica dei biocidi convenzionali è una strategia promettente per migliorare il controllo microbico a scopo di disinfezione sanitaria. In questo contesto, descriviamo un protocollo dettagliato per valutare gli effetti potenzianti dei fitochimici di origine vegetale sui biocidi sintetici. Questi prodotti di origine vegetale sono candidati interessanti come adiuvanti biocida grazie alla loro diversità strutturale, bioattività e spesso minore tossicità. Il flusso di lavoro qui descritto consente di determinare le concentrazioni battericida minime (MBC) e la generazione sistematica sia delle curve dose-risposta che di quella tempo-risposta per ciascun prodotto testato singolarmente (biocidi e fitochimici) e per le loro combinazioni doppie o triplice. I dati risultanti permettono una modellazione matematica avanzata, inclusa la determinazione dell'indice di concentrazione battericida frazionaria (FBCI) e la valutazione delle interazioni tra i prodotti testati in base agli effetti sinergici, additivi o antagonistici utilizzando il software Combenefit. In questo senso, è possibile identificare prodotti naturali promettenti come potenziatori del biocida, ottimizzare l'efficacia antimicrobica e progettare strategie di disinfezione più sostenibili e sicure che possano ridurre le concentrazioni richieste di biocidi sintetici. Questo migliora il controllo microbico e riduce i rischi ambientali e per la salute pubblica associati all'uso eccessivo di biocida.

Introduzione

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Le infezioni associate all'assistenza sanitaria (HAI) sono tra le sfide di salute pubblica più gravi e preoccupanti a livellomondiale. Allarmante, sono fortemente associati alla diffusione di microrganismi multi-resistenti ai farmaci (MDR) e alla persistenza del biocarico batterico sulle superfici ospedaliere, spesso a causa di pratiche di disinfezione inappropriateo inefficaci 2,3. Inoltre, la contaminazione incrociata tra pazienti, personale sanitario e apparecchiature mediche amplifica ulteriormente questo problema 4,5. In Europa, ad esempio, si stima che quasi 80.000 pazienti ricoverati soffrano di almeno un HAI in un dato giorno, per circa 16 milioni di giorni ospedalieri aggiuntivi ognianno. La pandemia di COVID-19 ha ulteriormente complicato questa questione, contribuendo a un aumento delle infezioni batteriche MDR dovuto all'alto uso di agenti antimicrobici/disinfettanti e all'aumento deiricoveri 6,7. L'ascesa dei batteri resistenti agli antibiotici, tra cui Escherichia coli produttori di β-lattamasi (ESBL) a spettro esteso e Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA), ha portato a un crescente onere per la salute e l'economia a livello mondiale. Infatti, questi ceppi sottolineano l'urgenza di sviluppare soluzioni innovative per la prevenzione e il controllo delleinfezioni 1,8,9.

Tenendo conto di ciò, i biocidi sono diventati strumenti fondamentali per controllare la diffusione di batteri resistenti e infezioni batteriche, essendo ampiamente applicati per disinfettare le superfici ospedaliere, sterilizzare le apparecchiature, trattare i sistemi idrici e prevenire la contaminazione dei dispositivimedici 10,11. A differenza degli antibiotici, che agiscono su specifici bersaglimicrobici 12, i biocidi interrompono contemporaneamente più strutture cellulari, inclusi membrane, enzimi, RNA ribosomico e viemetaboliche 13,14,15. Questa azione ad ampio spettro era inizialmente ritenuta come riducesse il rischio di resistenza. Tuttavia, le evidenze mostrano che i microrganismi possono adattarsi all'esposizione ai biocidi, portando a tolleranza, persistenza e persino resistenza incrociata agliantibiotici 10,16. Ad esempio, l'esposizione di Pseudomonas aeruginosa al cloruro di benzalconio ha selezionato varianti resistenti a ciprofloxacina e novobiocina tramite la sovraespressione delle pompe di efflusso17. Allo stesso modo, il triclosan ha dimostrato di attivare le pompe di efflusso nella maltofilia di Stenotrophomonas, mentre l'esposizione alla clorexidina è stata associata a un aumento della resistenza agli antibiotici in S. aureus18.

Inoltre, composti ammoniaci quaternari (QAC), clorexidina, diamidine, acridine e triclosan sono stati indicati come possibili cause della selezione e persistenza della resistenza batterica a diversiantibiotici 19,20. Geni di resistenza come qacA/B e SMR sono noti per conferire tolleranza alle QAC, e fallimenti clinici come la batteriemia legata a cateteri conservati in soluzioni contaminate di QAC e la contaminazione microbica intrinseca degli iodoforisono stati inoltre segnalati 16,17,21. Questi risultati evidenziano l'urgente necessità di un uso ottimizzato del biocida, supportato da studi meccanicistici e strategie razionali di disinfezione.

I biofilm, che sono comunità batteriche ad alta densità cellulare e ben strutturate incorporate in una matrice extracellulare di polisaccaridi, proteine e acidi nucleici, rappresentano un ulteriore e significativo ostacolo al controllo delleinfezioni 22,23. Mostrano una tolleranza notevole agli antibiotici e ai biocidi, contribuendo alla persistenza delle infezioni nei pazienti. Inoltre, i biofilm sono spesso associati alla persistente contaminazione di dispositivi medici, strumenti chirurgici e superficiospedaliere 24. Nonostante la loro importanza clinica, i biofilm sono stati riconosciuti come principali contributori alle infezioni croniche e alla resistenza agli antimicrobici solo negli ultimi decenni. La loro resilienza è tale che anche gli agenti disinfettanti aggressivi spesso non riescono a eliminarli, lasciando cellule persistenti capaci di riseminareinfezioni 20,25,26. Pertanto, trovare strategie efficaci di antibiofilm è fondamentale per controllare le IA e ridurre il carico di salute pubblica ed economico dei patogeniMDR 27,28.

Come soluzione promettente, i fitochimici, che sono metaboliti secondari prodotti ed estratti dalle piante, rappresentano una risorsa in gran parte inesplorata per nuovi agenti antimicrobici e antibiofilm29. Tuttavia, nessun fitochimico viene utilizzato come antibiotico, a causa della sua modesta attività antimicrobica rispetto agli antibiotici convenzionali. I fitochimici sono regolarmente classificati come antimicrobici basandosi su test di suscettibilità che producono la concentrazione inibitoria minima (CMI) nell'intervallo di 100-1000 μg/mL, valori molto più alti rispetto a quelli degli antibioticiconvenzionali 30,31. È importante sottolineare che i fitochimici hanno già dimostrato attività antibiofilm quando usati da soli o come potenziatori dei biocidi convenzionali. Ad esempio, la quercetina può inibire la produzione di alginati, portando a una diminuzione dell'adesione durante lo sviluppo del biofilm 32,33,34. L'emodin inibiva lo sviluppo di biofilm da parte di P. aeruginosa, E. coli e S. aureus attraverso la diminuzione dell'espressione di geni chiave coinvolti nella formazionedei biofilm 35. Combinare i fitochimici con biocidi usati convenzionalmente ma sempre meno efficaci, come agenti modificatori della resistenza, rappresenta una strategia promettente per aumentare l'efficaciaantimicrobica 36. Tali interazioni sinergiche possono interferire con i meccanismi di resistenza microbica, riducendo le concentrazioni minime efficaci di biocidi necessarie per ottenere una disinfezionesoddisfacente 37. Questo approccio ottimizza le prestazioni biocida, riduce la pressione selettiva per lo sviluppo della resistenza e riduce gli impatti ecologici e tossicologici associati all'applicazione eccessiva di biocida15,20. I fitochimici sono strutturalmentediversificati 38,39,40, ampiamente disponibili 38,39,41, economici 38,39,42, e spesso meno tossici per l'uomo e per l'ambiente rispetto ai biocidisintetici 38,39. Sono prodotti naturali spesso derivati da fonti vegetali rinnovabili e, in alcuni casi, sono stati segnalati come presentanti una persistenza ambientale inferiore e profili di tossicità ridotti rispetto a certi biocidisintetici 43,44,45. Sebbene i loro profili di costo, disponibilità e tossicità varino a seconda del composto e del processo di estrazione, diversi fitochimici hanno dimostrato caratteristiche di sicurezza e ambientali favorevoli rispetto a certi biocidiconvenzionali 46,47.

Questo protocollo mira a valutare il potenziale dei fitochimici, singolarmente e in combinazione con i biocidi convenzionali, per la disinfezione sanitaria. In breve, il protocollo valuta le interazioni biocida-fitochimiche su ampie concentrazioni. I biocidi sono stati inizialmente testati tra 0,1 e 500 mg/L e i fitochimici tra 50 e 10.000 mg/L per determinare le concentrazioni battericidi minime (MBC) (Tabella 1). Per le combinazioni doppie, le concentrazioni subbattericide sono state selezionate come segue: cloruro di benzalkonio (BAC) a 0,1, 0,5 e 0,75 mg/L; acido peracetico (PAA) a 0,1, 0,3 e 0,5 mg/L; acido salicilico (SAL) a 50, 100 e 250 mg/L; e eugenolo (EUG) a 100, 250 e 750 mg/L (Tabella 1). Sono state effettuate combinazioni triple utilizzando BAC (0,75 mg/L) o PAA (0,5 mg/L) combinati con SAL (100 o 250 mg/L) ed EUG (250 o 750 mg/L) (Tabella 1). I test a risposta temporale sono stati eseguiti in 1–90 minuti, seguiti da una valutazione della ricrescita batterica di 24 ore. Le interazioni antimicrobiche vengono quantificate utilizzando l'indice di concentrazione battericida frazionario (FBCI) e analizzate con il software Combenefit, mentre la cinetica di disinfezione viene modellata utilizzando i modelli Chick-Watson e Weibull per caratterizzare la dipendenza da concentrazione e la dinamica di inattivazione.

L'innovazione risiede nella progettazione razionale di interazioni stabili e doppie e triple tra fitochimici e biocidi, ottimizzando l'attività di disinfezione minimizzando al contempo tossicità e impatto ambientale dovuto a un uso ridotto dei biocidi convenzionali. Approcci matematici come il calcolo del FBCI e la valutazione della sinergia sono stati utilizzati anche per quantificare le interazioni fitochimica-biocida nel controllo microbico. Mentre FBCI offre un'interpretazione categorica dell'interazione (sinergia, antagonismo o indifferenza) a specifiche combinazioni di concentrazioni, Combenefit consente una valutazione più completa, basata sulla superficie di risposta, dei modelli di interazione in un intervallo di concentrazione più ampio. Ciò consente la visualizzazione e quantificazione degli effetti di interazione dipendenti dalla concentrazione che potrebbero non essere catturati dagli indici a singolopunto 48,49. Inoltre, la cinetica della disinfezione viene modellata utilizzando i modelli Chick-Watson (per dose-risposta) e Weibull (per la risposta al tempo) 50. Questi modelli forniscono modellizzazione cinetica dell'inattivazione microbica, fornendo parametri quantitativi che descrivono i tassi di disinfezione e il comportamento della curva disopravvivenza 50. Aiutano a definire se l'uccisione segue dinamiche log-lineari o non lineari e permettono un'interpretazione più meccanicistica degli effetti del trattamento, che va oltre la descrizione diFBCI 51,52.

Questo protocollo garantisce l'identificazione sistematica delle promettenti combinazioni fitochimiche-biocida e lo sviluppo di una strategia efficiente e sostenibile per la disinfezione sanitaria. A differenza dei classici saggi MIC o a scacchiera che forniscono misurazioni statiche degli endpoint, questo protocollo integra modellazione battericida dinamica e analisi di interazione per catturare la magnitudine e la cinetica della potenziazione. Sebbene i classici saghi a scacchiera forniscano informazioni preziose sulle interazioni inibitorie basate sugli endpoint della MIC, sono limitati a misurazioni di crescita e singoli indici di interazione. Il protocollo qui descritto va oltre questo quadro quantificando l'attività battericida piuttosto che l'inibizione della crescita, valutando la ricrescita post-trattamento per valutare effetti antimicrobici duraturi, valutando sia combinazioni biocida-fitochimiche doppie che triple, modellando la cinetica di disinfezione tramite approcci Chick-Watson e Weibull e applicando l'analisi delle superfici concentrazione-risposta usando Combenefit. Questa strategia multidimensionale consente una valutazione più robusta e predittiva della potenziazione biocida-fitochimica.

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Protocollo

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NOTA: La metodologia proposta è stata adattata dalla norma europea EN 127653.

1. Preparazione della cultura

  1. Criopreserva i ceppi batterici testati, Escherichia coli CECT 434 e Staphylococcus aureus CECT 976, conservandoli in cryovial con glicerolo 30% (v/v) a -80 °C.
  2. Per il recupero, si coltura i batteri nelle placche di agar a conteggio di placche (PCA) e si lascia crescere, per 24 ore a 25 °C, incubando le placche.
  3. Preparare colture coltivate durante la notte dei ceppi in studio inoculando una colonia batterica da una piastra striata in brodo di soia triptico (TSB) per raggiungere la fase di crescita esponenziale (secondo la curva di calibrazione ottenuta nei passaggi successivi), e incubare su un incubatore a scuotimento a 100 giri/min e 25 °C.
  4. Utilizzando uno spettrofotometro, si ottiene una curva di calibrazione delle unità formative di colonie (CFU)/mL in funzione della densità ottica a 600 nm (OD600) per ciascun ceppo batterico nelle condizioni di coltura sopra menzionate.
    1. Coltiva una coltura batterica durante la notte in TSB a 25 °C con agitazione (100 rpm).
    2. Prepara diluizioni seriali di 10 volte della coltura in soluzione salina sterile (0,85% w/v NaCl).
    3. Misurare il diametrodiametro 600 di ogni diluizione usando uno spettrofotometro.
    4. Diluizioni appropriate per piastre su PCA. Incubare le piastre a 25 °C per 24 ore.
    5. Seleziona le lastre che presentano tra 10 e 100 colonie e determina i corrispondenti valori CFU/mL.
    6. Tracciare i valori CFU/mL rispetto alle corrispondenti letture OD600 all'interno dell'intervallo lineare (0,04–0,8).
    7. Eseguire almeno due test indipendenti con almeno due repliche. Eseguire un'analisi di regressione lineare per ottenere l'equazione di calibrazione.
    8. Utilizzare l'equazione risultante per stimare le concentrazioni batteriche negli esperimenti successivi.
  5. Centrifugare l'inocula a 3772 x g per 10 minuti, e lavare una volta con soluzione salina tamponante fosfato (PBS) (8 g/L di NaCl, 0,2 g/L di KCl, 1,44 g/L di Na2HPO4 e 0,24 g/L diKH 2PO4).
  6. Utilizzando uno spettrofotometro, regolare il diametro diametro600 dell'inocula in PBS a 1 x 10unità formative di 8 colonie (CFU)/mL.

2. Preparazione e controllo delle soluzioni molecolastici

  1. Considera la selezione, lo studio e la preparazione delle molecole testate come segue: utilizzare due biocidi – BAC e PAA (15% (w/v) – e due fitochimici – SAL ed EUG 99%.
    NOTA: Il BAC è stato scelto in questo studio perché è un QAC ampiamente utilizzato, efficace contro i batteri tramite la rottura dellamembrana 54,55. L'acido peracetico è un disinfettante ossidante ad ampio spettro sempre più utilizzato per la sterilizzazione di strumentimedici 56,57. L'acido salicilico è un composto fenolico di interesse perché mostra attività antibatterica e antibiofilm e influenza la virulenza batterica e i meccanismi di resistenza agli antibiotici, suggerendo potenziali ruoli nella disinfezione e nel controllomicrobico 58,59. L'eugenolo è un composto aromatico terpenoide/fenolico naturale con proprietà antimicrobiche riconosciute che può agire come alternativa più sicura ed ecologica ai disinfettantisintetici 60,61.
  2. Prepara BAC e PAA freschi in acqua ultrapura.
  3. EUG e SAL disciolti sono stati disciolti nel dimetilsolfosido (DMSO), assicurando che le cellule non fossero mai esposte a una concentrazione di DMSO superiore al 5%.
  4. Preparare le concentrazioni testate di BAC, PAA, EUG e SAL, secondo la Tabella 1.
  5. Preparare le concentrazioni testate in tubi centrifughe da 15 mL regolando i volumi di soluzione stock e sospensione cellulare per ottenere la concentrazione finale desiderata delle molecole e la densità cellulare.
  6. Per tutti i test successivi, includere due controlli negativi: (i) batteri senza trattamento e (ii) batteri esposti al 5% di DMSO (poiché questa è la concentrazione massima di DMSO a cui le cellule sono esposte durante i saggi).

3. Esposizione batterica a biocida o fitochimico

  1. Aggiungi 1 mL di sospensione a 1 mL di acqua ultrapura e aspetta 2 minuti.
  2. Poi, aggiungi 8 mL di biocida o soluzione fitochimica (in acqua ultrapura o DMSO al 5%) e incuba su un incubatore a 100 giri/min e 25 °C, per 30 minuti.
  3. Mescola i composti con le cellule tramite vortice.

4. Neutralizzazione, diluizione seriale e placcatura

  1. Eseguire la neutralizzazione di ogni biocida o fitochimico a ogni concentrazione testata utilizzando il metodo di diluizione-neutralizzazione e il neutralizzante universale: 30 g/L di polisorbato 80, 30 g/L di saponina, 1 g/L di L-istidina, 3 g/L di lecitina e 5 g/L di tiosolfato di sodio in tampone fosfato 0,0025 M.
  2. Aggiungere 1 mL del campione da neutralizzare a 8 mL di neutralizzatore universale e 1 mL di acquaultrapura 53.
  3. Eseguire una diluizione seriale dieci volte aggiungendo 100 μL di una diluizione specifica a 900 μL di soluzione salina sterile per ottenere la diluizione successiva (ripetere dalla diluizione 10-1 alla diluizione 10-7), e determinare le cellule sopravvissute sui campioni neutralizzati impiacciando 10 μL di ciascuna diluizione sulla PCA, secondo il metodo della piastraa caduta 62.
  4. Incubare le placche a 25 °C senza agitazione per 24 ore per il conteggio cellulare.
  5. Le CFU sono state contate visivamente per le lastre contenenti più di 10 e meno di 100 colonie, e la concentrazione alla quale avviene una riduzione completa della culturabilità viene registrata come MBC. Secondo l'Equazione (1), si calcola la CFU/mL, dove n è il numero di CFU contate, SV è il volume di campione placcato (0,01 mL) e Dil è la diluizione in cui sono state conteggiate le CFU.
    CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
  6. Valutare la riduzione logaritmica, la riduzione logaritmica, secondo l'Equazione (2), dove X0 e X sono rispettivamente la CFU/mL per il batterio non trattato (controllo) e quello trattato.
    Riduzione logaritmica = log (X0) - log (X) = log (X 0/X) (2)

5. Valutazione delle combinazioni doppie e triple

  1. Applicare la metodologia descritta sopra per valutare l'attività di tutte le possibili combinazioni duali e triple di un biocida e un fitochimico (per combinazioni doppie) o due fitochimici (per combinazioni triple) per cercare possibili effetti di potenziazione/sinergia.
  2. Si consideri la seguente scelta di concentrazioni: per le combinazioni doppie, le concentrazioni testate per il BAC erano 0,1, 0,5 e 0,75 mg/L; per la PAA erano 0,1, 0,3 e 0,5 mg/L; per la SAL erano 50, 100 e 250 mg/L; e per l'EUG erano 100, 250 e 750 mg/L (Tabella 1). Per quanto riguarda la combinazione tripla, la concentrazione testata per il BAC è stata di 0,75 mg/L; per la PAA era 0,5 mg/L; per la SAL erano 100 e 250 mg/L; e per l'EUG erano 250 e 750 mg/L (Tabella 1).
  3. Seleziona le concentrazioni, scegliendo quelle valutate nel test dose-risposta per singole molecole che hanno prodotto effetti non battericida.

6. Valutazione della ricrescita batterica

  1. Per valutare la capacità di ricrescita batterica, si lascia crescere le cellule microbiche in mezzo liquido per più di 24 ore, a 25 °C e 100 rpm, dopo il trattamento e la neutralizzazione.
  2. Eseguire diluizione seriale dieci volte, placcatura, incubazione delle placche PCA e quantificazione della CFU/mL utilizzando le stesse tecniche e condizioni.

7. Interpretazione dei risultati combinatori – Indice Frazionario di Concentrazione Battericida (FBCI)

  1. Interpretare i risultati dell'analisi combinatoria come segue:
    1. Per le combinazioni duali, FBCI = FBC(A) + FBC(B), dove la concentrazione battericida frazionaria di A, FBC(A), è il rapporto tra il MBC di A nella combinazione duale e il MBC di A da solo (combinazione MBCA/MBCA), e FBC(B) è il rapporto tra il MBC di B nella combinazione duale e il MBC di B da solo (combinazione MBC B/solo MBC B) (Equazione 3).
    2. Per combinazioni triple, FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), dove FBC(A) è il rapporto tra il MBC di A in combinazione tripla e il MBC di A da solo (combinazione MBCA/MBC A da solo), FBC(B) è il rapporto tra il MBC di B nella combinazione tripla e il MBC di B da solo (combinazione MBCB/MBC B da solo), e FBC(C) è il rapporto tra la MBC di C in combinazione tripla e la MBC di C da sola (combinazione MBC C/MBC C da sola) (Equazione 4).
    3. Applicando la classificazione proposta da Fernandes et al.50, FBCI ≤ 0,5 corrisponde al sinergismo, 0,5 < FBCI ≤ 1 indica additività, 1 < FBCI ≤ 4 è classificato come indifferenza, e FBCI > 4,00 è considerato antagonismo.
      FBC(A) + FBC(B) = (combinazione duale MBC/MBC A da solo) + (combinazione duale MBCB/MBC B da solo) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (combinazionetripla MBC A/MBC A da solo) + (combinazione tripla MBCB/MBC B da solo) + (combinazione tripla MBCC/MBC C da solo) (4)

8. Procedura per il saggio di risposta nel tempo

  1. Preparare le colture notturne di E. coli CECT 434 e S. aureus CECT 976 secondo le condizioni di crescita precedentemente descritte (sezione 1).
  2. Aggiungi 1 mL di sospensione a 1 mL di acqua ultrapura e aspetta 2 minuti. A questo punto, aggiungere 8 mL di soluzione biocida/fitochimica (in acqua ultrapura o DMSO al 5%) per raggiungere le concentrazioni desiderate per ogni molecola: 1/4 di MBC e MBC, e per la sospensione batterica (regolando il diametro diametrale), a 100 giri/min e 25 °C. Mescola le molecole con le cellule tramite vortice.
  3. Valuta i seguenti tempi di esposizione: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 e 90 minuti.
  4. Come descritto nella sezione 4, valutare l'attività antimicrobica calcolando la riduzione logaritmica (CFU/mL) come log (X/X0).
  5. Eseguire il biocida o la neutralizzazione fitochimica per ogni coppia di concentrazione/tempo testata utilizzando il metodo di diluizione-neutralizzazione e il neutralizzante universale, la diluizione seriale e la placcatura, come descritto in precedenza nella sezione 4.

9. Analisi dei dati combinatori con il software Combenefit

  1. Apri il file fornito 'REPLICATE_TEMPLATE.xls', a https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ , per assicurarti della corretta struttura e formattazione.
  2. Organizza i tuoi dati in una matrice, secondo la Tabella Supplementare 1, dove:
    1. Aumentare le concentrazioni del prodotto A dall'alto verso il basso (dalla riga più bassa a quella con il numero più alto). Includere almeno tre diverse concentrazioni per il prodotto A.
    2. Aumentare le concentrazioni del prodotto B da sinistra a destra (dalla colonna più bassa a quella numerata più alta): includere almeno tre concentrazioni diverse per il prodotto B.
    3. Rappresenta il prodotto singolo B della riga superiore (0 mg/L prodotto) a agente singolo.
    4. Rappresentiamo la prima colonna (prodotto B) a singolo agente A.
    5. Rappresentare la cellula (0,0) come il controllo non trattato.
    6. Normalizzare, per ogni caso, i valori utilizzati, usando l'Equazione (5), dove il treat_0h è il logaritmo (CFU/mL) per un trattamento specifico, immediatamente dopo l'esposizione (0h); treat_24h è il logaritmo (CFU/mL) per un trattamento specifico, 24 ore dopo l'esposizione (ricrescita); control_0h è il logaritmo (CFU/mL) per il corrispondente controllo (solo cellule o cellule esposte al 5% di DMSO), immediatamente dopo l'esposizione (0 h); e control_24h è il logaritmo (CFU/mL) per il corrispondente controllo (solo cellule o cellule esposte al 5% di DMSO), 24 ore dopo l'esposizione (ricrescita).
    7. Eseguire, in tutti i casi, l'enumerazione delle CFU dopo 24 ore di incubazione di campioni placcati su PCA.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      NOTA: Includere controlli/condizioni non trattate che definiscono la vitalità del 100% e un controllo positivo che definisce l'inibizione massima (opzionale); Usa solo valori numerici, nessuna formula; Usa lo stesso numero di righe e colonne tra repliche; Usa '.' per i decimali.
  3. Salva il file come .xls o .xlsx.
  4. Crea un file Excel per ogni replica, come descritto prima e come nella Tabella Supplementare 1, e aggiungi tutti i file nella stessa cartella.
  5. Apri il software Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, versione 2.021, disponibile su https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
  6. Carica quella cartella sul Combenefit.
    1. Apri il software Combenefit
    2. Premi Seleziona cartella progetto e scegli quella corretta.
    3. Selezione del modello di riferimento: additività di Loewe che assume il meccanismo esatto per entrambi i prodotti; Bliss independence che presuppone azione indipendente, o HAS, che è un modello conservativo (confronta la combinazione con il miglior singolo agente). La buona pratica consiste nell'eseguire almeno due modelli e scegliere quello migliore.
    4. In questo caso, è stato selezionato il modello Bliss, dato il modo d'azione delle molecole testate.
    5. Seleziona gli output grafici desiderati, sapendo che devi selezionarne almeno un altro per la distribuzione Synergy.
    6. Analisi della corsa stampa (Figura supplementare 1). Consiglio: Nella finestra di Seleziona Salva durante l'analisi, seleziona Tutto per salvare tutti gli output grafici risultanti nella cartella originale.

10. Applicazione dei modelli Chick-Watson e Weibull ai dati di dosaggio e risposta temporale

  1. Prepara i tuoi dati formattando il dataset in Excel o CSV prima di importare: per la dose-risposta, la colonna A corrisponde alla dose (concentrazione, mg/L) e la colonna B corrisponde al log (X/X₀); Per i dati di risposta temporale, la Colonna A corrisponde al tempo (minuti) e la Colonna B corrisponde al logaritmo (X/X₀).
  2. Salva il tuo file in '.csv' o copia-incolla direttamente in Prism.
  3. Open GraphPad Prism (versione utilizzata: 9.0 per Windows 11; La Jolla, California, USA).
  4. In Nuova tabella e grafico, seleziona XY, e in Tabella Dati seleziona Inserisci o importa dati in una nuova tabella (Figura Supplementare 2).
  5. In Opzioni, per X, seleziona Numero, per Y seleziona Inserisci valori replicati in sottocolonne affiancate e premi Crea (Figura Supplementare 2).
  6. Inserisci i dati di dose/tempo in X e registra i dati di sopravvivenza in Y.
  7. Vai su Analizza, Regressione non lineare (adattamento della curva), seleziona i dataset che vuoi analizzare e premi OK (Figura Supplementare 2).
  8. Seleziona Nuovo e poi Crea nuova equazione.
  9. In Equazione, per Tipo di Equazione, si sceglie Equazione esplicita: Y = una funzione di X e parametri; per il Nome, scrivi Modello Chick-Watson/Modello Weibull; e nella definizione scrivi Y = -a*x^(n)*30 Modello di Chick-Watson (Figura Supplementare 3) e Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b) per il Modello di Weibull (Figura Supplementare 4).
    NOTA: Il modello di Chick-Watson è espresso dall'Equazione 6, dove X0 e X sono la CFU/mL per i batteri non trattati (controllo) e i batteri trattati, C è la concentrazione (dose), kdis è il coefficiente del tasso di inattivazione, C è la concentrazione (dose), n è l'esponente di concentrazione e t è il tempo di esposizione (in questo caso, 30 min)50. Il modello Chick-Watson è stato applicato per osservare la dose-risposta e per caratterizzare la relazione tra concentrazione di disinfettante e riduzione microbica.
    log (X/X₀) = -k dis · Cⁿ · t (6)
    NOTA: Il modello di Weibull è espresso dall'Equazione 7, dove X0 e X sono la CFU/mL per i batteri non trattati (controllo) e i batteri trattati, t è il tempo, α è il parametro di scala (tempo caratteristico) e β è il parametro di forma50. Il modello di Weibull è stato applicato per osservare la risposta temporale e per caratterizzare la forma delle curve di sopravvivenza. Il parametro di scala rappresenta il tempo caratteristico di inattivazione, mentre il parametro shape descrive le deviazioni dal comportamento log-lineare (β = 1 log-lineare; β < 1 coda; β > una spalla).
    log (X/X 0) = -1/2,303 (t/α)^β (7)
  10. In Ruoli per i Valori Iniziali, scegli 0 come Valore Iniziale per ogni parametro e (Valore Iniziale, da adattare) come Regola (Figura Supplementare 5).
  11. Mantieni il resto delle impostazioni come predefinito e premi OK.
  12. Esegui la misura e ispeziona i parametri stimati.

11. Replicazione biologica

  1. Esegui, per tutti gli saggi, almeno due esperimenti indipendenti con almeno due repliche.

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Risultati

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Questo studio ha valutato l'attività battericida di tutti e quattro i composti testati — BAC, PAA, SAL ed EUG — rispetto a E. coli CECT 434 e S. aureus CECT 976. Come mostrato nella Figura 1 e nella Figura 2, BAC, PAA, SAL ed EUG hanno mostrato un apparente effetto dipendente dalla concentrazione sulla culturabilità. La Tabella 2 presenta i valori di MBC per le molecole testate dopo l'esposizio...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presentato in questo studio fornisce un quadro integrato per valutare l'attività battericida di due biocidi comunemente usati – BAC e PAA – e di due promettenti fitochimici – EUG e SAL – singolarmente e in combinazione (combinazioni doppie e triple), contro E. coli e S. aureus. Diversi passaggi all'interno di questo protocollo sono particolarmente critici per garantire la riproducibilità e l'interpretazione accurata delle interazioni antimicrobiche. Questi includono la stan...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse nella stesura di questo articolo e di non avere nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da: Project InnovAntiBiofilm (rif. 101157363) finanziato dalla Commissione Europea (Horizon-Widera 2023- Access-02/Horizon-CSA); Progetti MultAntiBiofilm (rif. COMPETE2030-FEDER00852000; Nº 17121) e HCAI_Disinfect (rif. COMPETE2030-FEDER-00752300; Nº 16360) finanziata tramite il Programma Operativo Competitività dei Fattori - COMPETE, e fondi nazionali dalla Foundation for Science and Technology (FCT); LEPABE, UID/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/00511/2025) e UID/PRR/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/PRR/00511/2025) e ALiCE, LA/P/0045/2020 (https://doi.org/10.54499/LA/P/0045/2020), finanziati da fondi nazionali tramite la FCT/MCTES (PIDDAC; Lisbona, Portogallo). La borsa di dottorato di Mariana Sousa (2023.00337.BD; https://doi.org/10.54499/2023.00337.BD) è fornita dalla FCT.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di benzalkonio  Merck, Spagna8.14363.0100Biocidio
Mega Star 600R centrifugatoVWR, USAVWR Mega Star 600R-
Combenefit - Versione 2.021Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, Regno Unito-Software per la valutazione del sinergismo
CuvettesVWR, GermaniaVWRI634-0678Cuvette da 1,5 mL per la regolazione della densità ottica
Acqua smantellata--Per la preparazione ai media
Dimetile Solfossido (DMSO)VWR, Francia23500.322Solvente organico
Anelli di inoculazione usa e gettaVWR, ItaliaVWRI612-935710 & mu; Anelli di inoculazione L
Tubi di EppendorfVWR, CinaVWRI525-1164Tubi Eppendorf safe-lock da 1,5 mL  
Escherichia coliCollezione di Cultura di Tipo Spagnolo (CECT)434Ceppo di riferimento utilizzato in questo studio
EtanoloVWR, Francia83813.36Per la disisfeczione di pietà, materiali e mani
Eugenolo 99%Sigma-Aldrich, USA163333Fitochimici
Tubi FalconVWR, USAVWRI525-1085Tubi Falcon da 15 mL
Tubi FalconVWR, BelgioVWRI525-1109Tubi Falcon da 50 mL
GraphPad Prism 9.0 per Windows 11La Jolla, California, USA-Software per analisi matematica e statistica
LecitinaAlfa Aesar, GermaniaQ04A010-
L-istidinaMerck, USA1.04351.0025-
Incubatore orbitaleVWR, USAVWR 5000I Shaker incubante 230V-
Acido peracetico 15%AppliChem, Germania143495-1211Biocidio
Piastre di PetriVWR, ItaliaVWRI391-0582-
Pipetta 1 - 10 mLVWR, USA-
Pipette 100 - 1000 & mu; LVWR, USA-
Punte per pipette 100 - 1000 e mu; LFrilabo, Portogallo1-202-50-0-
Pippette 20 - 200 & mu; LVWR, USA-
Punte per pipette 1 - 10 mLVWR, BelgioVWRI613-7094-
Punte Pippette 2 - 200 μ LVWR, MessicoVWRI613-6418-
Conteggio delle placche AgarVWR, Belgio84608-0500Isolamento e coltivazione di microrganismi
Polisorbato 80VWR, USA20E2756726-
Cloruro di potassio - KCl VWR, Belgio11D110008-
Fosfato di Diidrogeno di Potassio - KH2PO4VWR, Germania26931.263-
Acido sacilicoSigma-Aldrich, USA84210-500GFitochimici
SaponinVWR, Germania21A124103-
Cloruro di sodio - NaClVWR, Belgio27788.297-
Fosfato di Idrogeno Sodio - Na2HPO4VWR, Belgio28026.26-
Tiosolfato di sodio - Na2S2O3VWR, USA18D2056589-
SpettrofotometroVWR, USASpettrofotometro UV-1600PCRegolazione della densità ottica
Staphylococcus aureusCollezione di Cultura di Tipo Spagnolo (CECT)976Ceppo di riferimento utilizzato in questo studio
Brodo di soia triptico Merck, Germania1.05459.0500Isolamento e coltivazione di microrganismi
Acqua ultrapura--Per la preparazione del campione

Riferimenti

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