È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Miografia a filo per l'aorta dorsale e le arterie di resistenza mesenterica di topi e ratti

569 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

27 febbraio 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Forniamo un protocollo dettagliato per la miografia a filo affiancata per valutare la reattività vascolare nelle arterie condotta rispetto a resistenza isolate da topi e ratti.

Abstract

La miografia a filo è una tecnica ex vivo ampiamente utilizzata per la valutazione quantitativa della funzione vascolare in arterie isolate. Poiché le arterie di grandi condotti e quelle di piccola resistenza differiscono fondamentalmente per struttura e ruolo fisiologico, analizzare entrambe le classi di vasi in parallelo utilizzando arterie prelevate dallo stesso topo o ratto consente confronti accoppiati che riducono la variabilità inter-animale e rivelano cambiamenti funzionali specifici per vaso. Questo articolo presenta un protocollo passo dopo passo per valutare la reattività vascolare in arterie isolate di condotti murini e di resistenza utilizzando la miografia a filo isometrico. Descriviamo la preparazione di un tampone fisiologico fresco e ossigenato; accurata dissezione, pulizia e montaggio dei segmenti arteriosi; e la normalizzazione per impostare le navi vicino alla lunghezza ottimale per la generazione attiva di forza. Sono fornite una guida alla risoluzione dei problemi e un esempio di sequenza sperimentale per generare curve cumulative concentrazione-risposta per vasocostrittori e vasodilatatori standard. Questo protocollo consente la misurazione quantitativa sia della funzione endoteliale che della muscolatura liscia e facilita la rilevazione di alterazioni specifiche per vasi nella reattività vascolare associate a malattie vascolari, come l'ipertensione.

Introduzione

L'ipertensione è caratterizzata da alterazione della reattività vascolare, come disfunzione endoteliale e iperreattività del muscolo liscio vascolare versoi vasocostrittori 1. Questi cambiamenti funzionali, insieme al rimodellamento microvascolare e alla rarefazione, contribuiscono a una perfusione tissutale compromessa e a una pressione sanguignadisregolata 2,3,4. Gli saggi ex vivo di vasi isolati sono strumenti potenti per dissezionare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano il tono vascolare in condizioni di salute e malattia, poiché consentono un controllo preciso del microambiente vascolare e la manipolazione farmacologica selettiva dei percorsi di segnalazione muscolare liscia e endoteliali.

La reattività vascolare nelle arterie isolate viene comunemente valutata utilizzando due tecniche complementari ex vivo: miografia a filo e miografia da pressione 5,6. Nella miografia dei fili, anelli o segmenti di vaso sono montati su perni o fili, e la forza isometrica vieneregistrata 7,8. Nella miografia a pressione, i segmenti intatti del vaso vengono cannulati e pressurizzati a una pressione intraluminale definita, e il diametro del vaso viene monitorato tramitevideomicroscopia 9. A differenza della miografia a filo, la miografia a pressione consente il controllo della pressione transmurale e del flusso intraluminale. Pertanto, riproduce più da vicino l'ambiente emodinamico in vivo delle arterie di resistenza ed è comunemente utilizzato per studiare il tono miogenico, le risposte mediate dal flusso e le proprietà strutturali o meccanichevascolari 9,10. Al contrario, la miografia a filo è tecnicamente più facile da implementare (senza cannulazione o videomicroscopia), supporta una maggiore capacità di produzione utilizzando sistemi multi-camera commerciali ed è ben adatta per generare curve di concentrazione-risposta farmacologica riproducibili in arterie piccole e medie con diametri compresi tra decine e diverse centinaia dimicrometri 5,6. Di conseguenza, la miografia a filo è spesso preferita per il profilaggio farmacologico affiancato della reattività vascolare nelle arterie di condotti e di resistenza isolate da topi o ratti.

Le arterie condotte (grandi elastiche) e di resistenza (piccole arteria muscolari) differiscono fondamentalmente per struttura e funzione, e queste differenze dettano considerazioni sperimentali distinte e endpoint. Le arterie condotte (ad esempio, l'aorta toracica discendente) contengono grandi quantità di tessuto elastico e una notevole massa muscolare liscia; Le arterie di resistenza (ad esempio, arterie mesenteriche) hanno rapporti muscolo-luci relativamente maggiori e sono determinanti principali della resistenza periferica e dell'autoregolazionelocale 11,12. Poiché lo stesso agonista può attivare risposte molecolari diverse in questi letti vascolari, il confronto fianco a fianco tra condotti e vasi di resistenza dello stesso animale fornisce informazioni complementari utili. Ad esempio, nelle arterie conduttive, il rilascio di ossido nitrico derivato dall'endotelio è la via rilassante predominante attraverso cui l'acetilcolina (ACh) induce lavasorilassazione 13,14. Al contrario, nelle arterie a piccola resistenza, l'ACh induce il rilassamento tramite ossido nitrico, prostaciclina e, cosa importante, fattori iperpolarizzanti derivati dall'endotelio (EDHF)15,16. Di conseguenza, la miografia a filo affiancata delle arterie di condotto e resistenza prelevate dallo stesso topo o ratto consente confronti accoppiati che facilitano la rilevazione di cambiamenti funzionali specifici per vaso, riducendo al contempo la variabilità interanimale.

L'interpretazione accurata dei dati miografici a filo dipende da un'attenta attenzione a un insieme di variabili tecniche: composizione e ossigenazione della soluzione fisiologica salina (PSS), manipolazione e dissezione dei tessuti, tecnica di montaggio, pretensione ottimale a riposo (normalizzazione), temperatura del bagno e selezione dei controlli farmacologiciappropriati 6. La normalizzazione si riferisce alla procedura tecnica di impostazione del punto di funzionamento meccanico della nave in modo che lo sviluppo della forza attiva sia ottimizzato e approssimi le condizioni fisiologicheoperative 5. Praticamente, per gli anelli aortici, è prassi comune utilizzare una pretensione fissa, spesso determinata empiricamente per evitare l'iperdistensione e fornire risposte stabili. Per le arterie di piccola resistenza, la normalizzazione viene effettuata determinando prima la circonferenza interna corrispondente a una pressione transmurale equivalente di 100 mmHg (IC100). Il recipiente viene quindi impostato a una frazione definita di questo valore per stabilire la circonferenza interna normalizzata (IC1). In pratica, molti protocolli fissano IC1 vicino a 0,9 × IC100 per la MRA del ratto e circa 1,0 × IC100 per la MRA del topo, anche se questi valori possono essere regolati in base al tipo di recipiente, alla specie e agli obiettivisperimentali 5,17.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Il seguente protocollo segue le linee guida stabilite ed è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali del Campus di Scienze della Salute dell'Università di Toledo.

ATTENZIONE: Prima di iniziare, si prega di seguire sempre le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) e del Comitato per la Biosicurezza Istituzionale (IBC); utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati); esercitare attenzione quando si usano strumenti chirurgici o altri strumenti appuntissi; consultare e rispettare le relative Schede Dati di Sicurezza (SDS) durante la gestione di sostanze chimiche e tessuti biologici; maneggiare il carbogenio come una bombola di gas pressurizzata utilizzando regolatori approvati e una conservazione sicura; e smaltimento dei rifiuti biologici e chimici secondo le procedure istituzionali.

1. Preparazione del buffer PSS/bicarbonato di Krebs modificato (Krebs)

NOTA: Composizione tampone di Krebs (concentrazioni finali, pH 7,4): 130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mMKH 2PO4, 1,6 mMCaCl 2, 25 mMNaHCO 3, 5,5 mM glucosio e 0,03 mM EDTA.

  1. Prepara stock di grande volume: sciogli tutti i costituenti tranneNaHCO 3, glucosio eCaCl 2 in acqua doppiamente distillata per ottenere un stock. Conserva questo stock a 4 °C.
  2. Il giorno dell'esperimento, si verifica il volume richiesto di stock (ad esempio, 1 L), si aggiunge sequenzialmenteNaHCO 3, glucosio e CaCl2, e si ossigena continuamente con carbogeni (95% O2/5% CO2).
    NOTA: Per minimizzare la precipitazione di sale di calcio, prepara e conserva un deposito di CaCl2 da 1 M a 4 °C e aggiungi lentamente il volume richiesto al tampone solo dopo che il NaHCO3 è completamente dissolto, mescolando continuamente. Mantenere la bolla di carbogeni durante l'aggiunta di CaCl2 (vedi passo 1.3) per ridurre la formazione di carbonato di calcio. Se si verificano precipitazioni visibili, si scarta e si prepara un nuovo tampone.
  3. Per l'equilibrio del pH, si fa bollire il tampone con carbogeni per almeno 20 minuti, poi misura il pH e si aggiutica a pH 7,4 se necessario.
    NOTA: pH tipico pre-bolle ≈ 7,7; il bolle continua riduce il pH a ≈7,4 fisiologici.
  4. Prepara le camere del miografo riempendole con un tampone Krebs appena preparato e inizia a far bollire dolcemente con carbogeni. Regola la velocità di bolle per garantire uno scambio di gas adeguato senza agitazione vigorosa.
  5. Riserva un'aliquota di cuscinetto Krebs fresco e ossigenato e raffreddalo sul ghiaccio per la dissezione dei tessuti. Riscaldare il residuo tampone ossigenato a 37 °C (con bolle continue di carbogeni) per l'uso durante gli esperimenti.

2. Dissezione dell'aorta toracica discendente e dell'arcade mesenterica

  1. Eutanasia l'animale secondo le linee guida IACUC. Standardizzare il momento dell'eutanasia animale e del prelievo dei tessuti entro una finestra di 2 ore per minimizzare i potenziali effetti circadiani.
  2. Aprire immediatamente le cavità toracica e addominale tramite un'incisione mediana e riflettere lateralmente la parete toracica per esporre il cuore e i grandi vasi.
    NOTA: Non eseguire perfusione sistemica in condizioni standard, poiché potrebbe causare danni endoteliali involontari. Inoltre, il sangue trattenuto nei vasi mesenterici aumenta la discriminazione visiva tra arterie e vene e facilita la valutazione dell'integrità arteriosa. Tuttavia, in alcuni modelli patologici (ad esempio, disturbi trombotici), una perfusione gentile a bassa pressione con un buffer fisiologico eparinizzato e gelido può essere consigliata per eliminare i tromboni ostruenti minimizzando al contempo il danno endoteliale.
  3. Eliminare l'aorta toracica discendente. Per facilitare la dissezione, rimuovere polmoni ed esofago per migliorare la visualizzazione. Non afferrare direttamente l'aorta toracica discendente; invece, tieni delicatamente l'arco aortico o il grasso periadventiziale, solleva leggermente e recidi con cura i rami intercostali da sotto l'aorta. Espellere l'aorta toracica discendente tagliando poco prima che passi attraverso il diaframma e posizionarla in una piastra di Petri rivestita di Sylgard contenente un tampone di Krebs ossigenato e gelido.
    NOTA: Mantieni una temperatura fredda per minimizzare il tono spontaneo e preservare la vitalità. Il Black Sylgard aumenta il contrasto per la dissezione dei vasi.
  4. Eliminare tutta la sala giochi mesenterica. Sollevare delicatamente l'arcade mesenterica per localizzare l'arteria mesenterica superiore che si dirama dall'aorta caudale addominale al diaframma. Tagliare l'arteria mesenterica superiore prossimalmente e liberare l'arcade mesenterica dal tessuto connettivo circostante senza manipolazione diretta dei vasi. Posizionare l'arcade mesenterica in una piastra di Petri separata rivestita di Sylgard contenente un tampone di Krebs ossigenato e gelato.

3. Isolamento e montaggio degli anelli aortici su miografie a perni

  1. Fissare le estremità prossimale e distale dell'aorta toracica discendente con perni di dissezione per raddrizzare il vaso. Evita di allungare troppo per evitare danni meccanici.
    NOTA: Posizionare i perni nel grasso periavvenziale invece che attraverso la parete del vaso per minimizzare i danni.
  2. Sotto uno stereomicroscopio con una fonte di luce esterna, rimuovere con cura il grasso periadventiziale e il tessuto connettivo utilizzando forbici Vannas fini e pinze. Evitare danni alla parete del recipiente.
    NOTA: È prassi comune rimuovere il grasso periaventiale a meno che l'obiettivo non sia studiare il ruolo dei tessuti perivascolari avventici nella regolazione del tono vascolare.
  3. Taglia anelli aortici da 2 mm, facendo tagli puliti e perpendicolari. Scartare gli anelli che sono perforati o visibilmente danneggiati. Quando possibile, campiona le località comparabili tra gli animali per minimizzare la variabilità.
  4. Scollegare una camera contenente il tampone Krebs ossigenato dalla macchina per miografia e trasportarla con cura allo stereomicroscopio.
    NOTA: Scuotere la camera può influire sul trasduttore e modificare i risultati, quindi tieni la camera con attenzione e posizionala delicatamente.
  5. Sotto lo stereomicroscopio, si utilizza il micrometro per unire i perni del miografo e far scorrere l'anello aortico sui perni, minimizzando la manipolazione della superficie luminale.
  6. Nota la lettura del micrometro con l'anello completamente rilassato; Applica un leggero allungamento per assicurare il trasporto del tessuto.
  7. Collega la camera allo strumento e ripristina il recipiente alla lettura originale del micrometro.
  8. Dopo che tutti gli anelli sono stati montati, riscaldare le camere a 37 °C e monitorare la temperatura con la sonda fornita (tipicamente 20-30 minuti per raggiungere i 37 °C).
  9. Azzera le letture di forza sull'interfaccia utente, avvia il software di acquisizione dati e inizia la registrazione.
  10. Applicare incrementalmente la pretensione agli anelli aortici a un valore fisso appropriato per il vaso usando il micrometro.
    NOTA: Un valore tipico di pretensione per gli anelli aortici del topo è 5 milliNewton (mN)5. Sebbene i valori di pretensione riportati per gli anelli aortici del ratto varino tra gli studi, l'ottimizzazione precedente supporta una pretensione di 10 mN in questoprotocollo 18.
  11. Equilibrare gli anelli aortici per 45-60 minuti alla pretensione selezionata, con ripetuti cambi di buffer usando Krebs a 37 °C.
    NOTA: È comune che gli anelli aortici perdano parzialmente la tensione e quindi richiedano una fine regolazione della pretensione più volte con il micrometro prima che la tensione si stabilizzi.
  12. Azzera le letture di forza sull'interfaccia utente prima di iniziare i protocolli sperimentali.

4. Isolamento e montaggio di MRA su miografi a filo

  1. Fissa l'arcade mesenterica in senso orario per raddrizzare i rami mesenterici. Inizia fissando il ceco, poi fissa con i perni i tratti successivi dell'intestino tenue in senso orario per tendere delicatamente la vascolatura mesenterica senza sovraccaricare. Sostituisci il buffer con Krebs nuovo se necessario per rimuovere sangue o detriti.
  2. Identifica l'arteria mesenterica superiore al centro della piatta, dove irradiano le arcate.
  3. Selezionare un MRA appropriato per l'isolamento; Bersagli tipici: diametro interno 200-250 μm (determinato successivamente durante la normalizzazione).
    NOTA: Negli animali sperimentali adulti, ciò corrisponde generalmente a due rami diordine di secondo ordine nei topi e a3-4 rami di ordine di secondo ordine nei ratti. L'ordine dei rami è definito da biforcazioni sequenziali dall'arteria mesenterica superiore. I rami di1° ordine nascono direttamente dall'arteria mesenterica superiore, i rami disecondo ordine nascono da rami di 1° ordine, e così via.
  4. Al microscopio stereomicroscopio, seziona la vena accompagnante e rimuovi il grasso periadventiziale e il tessuto connettivo usando forbici Vannas e pinze sottili.
    NOTA: Le ARM si distinguono dalle vene per le pareti più spesse e i lumen più piccoli, che sono facilmente visualizzabili dalla presenza di sangue intraluminale residuo.
  5. Rilassa i perni intestinali vicini che stanno allungando la parete intestinale adiacente al vaso selezionato prima di estirre l'arteria per evitare il rinculo del vaso.
  6. Eliminare l'intera lunghezza del MRA selezionato (deve essere lungo >2 mm), effettuando tagli puliti e perpendicolari. Usando pinze sottili, afferra un'estremità dell'arteria e trasferiscila in una piastra di Petri pulita contenente un tampone di Krebs gelato (le piastre normali, non rivestite di Sylgard, facilitano il montaggio successivo). Ispezionare l'arteria per eventuali danni; La presenza di sangue intraluminale facilita la valutazione visiva dell'integrità.
  7. Espelle un segmento di circa 2 mm da una regione non danneggiata. Scartare qualsiasi area che sia stata maneggiata durante il trasporto o che mostri danni visibili.
    NOTA: L'uso di piatti trasparenti non rivestiti di Sylgard permette di posizionare un righello sotto il piatto per misurare accuratamente la lunghezza del recipiente.
  8. Prepara due lunghezze di 2,5 cm di filo d'acciaio inox da 40 μm per il montaggio.
  9. Usando pinze fine, infila con cura i fili, uno alla volta, attraverso il lumen in modo che ci sia abbastanza filo che sporga da entrambe le estremità per il montaggio. Minimizza il trauma endoteliale. Dopo aver inserito entrambi i fili, registrare la lunghezza esatta con un righello per l'uso nella procedura di normalizzazione (vedi passo 5.2).
    NOTA: Questo è uno dei passaggi più tecnicamente impegnativi e che richiedono più tempo del protocollo e richiede pazienza e pratica ripetuta per minimizzare i danni endoteliali. Dopo aver inserito il primo filo, spesso è più facile stringere entrambi i fili insieme e avanzarli attraverso il recipiente.
  10. Scollegare una camera contenente il tampone Krebs ossigenato dalla macchina per miografia e trasportarla con cura allo stereomicroscopio.
  11. Sotto lo stereomicroscopio, trasferire il MRA (fili di mantenimento a entrambe le estremità) alla camera del miografo. Usando il micrometro, unisci le ganasce del miografo per bloccare le estremità del filo tra le mascelle, così che l'arteria sia sospesa liberamente tra di esse.
    NOTA: In questa fase, è consigliabile fissare i fili in modo che si appoggino uno sopra l'altro. Questo fissa i fili in posizione e ne impedisce di attorcigliarsi.
  12. Fissare il filo superiore sotto le viti di montaggio sul lato vicino al micrometro avvolgendo le estremità in senso orario; Ripeti per il secondo filo sul lato trasduttore.
    NOTA: Stringi le viti delicatamente ma con fermezza. Se le viti sono troppo allentate, il recipiente può scivolare; Se troppo stretto, il filo o il trasduttore possono danneggiarsi. Dopo aver fissato la prima estremità, apri leggermente lo spazio tra le ganasce del miografo prima di fissare l'estremità opposta per garantire una tensione uniforme del filo.
  13. Allarga leggermente le ganasce e allinea i fili in modo che siano paralleli e coplanari, quasi toccandosi.
    NOTA: Eseguire tutte le regolazioni dei fili lontano dal contenitore montato per minimizzare i danni.
  14. Ripeti il montaggio per tutti gli MRA.
  15. Camere di riscaldamento a 37 °C e monitorare la temperatura (20-30 min in media).
  16. Azzera le letture di forza sull'interfaccia utente prima di avviare la procedura di normalizzazione.

5. Procedura di normalizzazione per l'ARM

NOTA: Gli anelli aortici sono montati a una pretensione fissa e predefinita. Pertanto, non viene eseguito un passaggio di normalizzazione separato.

  1. Impostare parametri di normalizzazione nel software di acquisizione dati: calibrazione dell'oculare = 1; pressione target = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg); circonferenza interna normalizzata (IC1) = 0,9 per MRA di ratto e 1,0 per MRA di topo; tempo medio = 2 s; ritardo = 60 s.
  2. Inserisci i parametri specifici del vaso nel modulo di normalizzazione come segue:
    1. Per gli endpoint tissutali (mm): impostare a1 = 0 e a2 = la lunghezza misurata dell'ARM in millimetri (la lunghezza esatta registrata durante l'escissione).
    2. Diametro del filo di ingresso: 40 μm.
    3. Lettura del micrometro: inserisci il valore di base del micrometro registrato con il recipiente montato e completamente rilassato.
  3. Inizia la procedura di normalizzazione allungando a passo a passo il MRA montato in incrementi di 50 μm. Dopo ogni stretch, inserisci la nuova lettura del micrometro nel modulo di normalizzazione e attendi 60 secondi tra gli incrementi.
    NOTA: I cali improvvisi di tensione dopo una regolazione del micrometro di solito indicano scivolamento del recipiente. Le viti di montaggio vanno strette delicatamente ma con fermezza.
  4. Aspettare che il modulo di normalizzazione rappresenti la tensione della parete a riposo (mN/mm) rispetto alla circonferenza interna (μm) e adatti una curva esponenziale. Utilizzando il micrometro, si continua a stirare a passo a passo finché la curva di tensione-circonferenza non interseca l'isobaro da 100 mmHg. Quando si è vicini all'incrocio, ridurre la dimensione del passo a 10-30 μm per evitare di sovraccaricare il recipiente.
  5. Quando la curva interseca l'isobaro da 100 mmHg, si noti la circonferenza interna calcolata dal software e imposta il micrometro al valore corrispondente calcolato dal modulo in modo che la preparazione si stabilisca sulla circonferenza interna normalizzata target (IC₁).
    NOTA: Un adattamento scadente delle curve di solito indica parametri errati inseriti nel software, come lunghezza del tessuto, diametro del filo o letture del micrometro.
  6. Ripetere la procedura di normalizzazione per tutti i MRA montati, poi lasciare che i vasi si equilibrino per 30-45 minuti con ripetuti cambi di buffer usando Krebs a 37 °C.
  7. Azzera le letture di forza sull'interfaccia utente immediatamente prima di iniziare gli esperimenti.
    NOTA: Le differenze chiave tra topi e ratti sono riassunte nella Tabella 1.
ParametroMouseTopo
Valore di pretensione per gli anelli aortici5 mN10 mN
Rapporto IC1 del bersaglio per MRA10.9
Ordine tipico di ramo MRA per diametro interno di 200-250 μm2°3º-4º

Tabella 1: Differenze chiave tra topi e ratti.

6. Protocollo sperimentale (sequenza di esempio)

  1. Controllo di vitalità: Suscitare una risposta contrattile con una sfida depolarizzante ad alto K⁺ (ad esempio, 120 mM KCl).
    NOTA: Il tampone ad alto K⁺ (KPSS) è preparato tramite sostituzione equimolare di NaCl con KCl proveniente dal tampone Krebs standard per mantenere l'osmolarità ed è continuamente ossigenato con 95% O2/5% CO2. Per evitare shock da freddo, riscalda il KPSS a 37 °C prima dell'uso. Composizione del tampone KPSS (concentrazioni finali, pH 7,4): 120 mM KCl, 14,7 mM NaCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mMKH 2PO₄, 1,6 mMCaCl 2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glucosio e 0,03 mM EDTA.
  2. Eseguire almeno tre lavaggi consecutivi con un tampone Krebs ossigenato fresco a 37 °C fino a quando una tensione basale passiva stabile non viene ripristinata.
    NOTA: Tutti i passaggi di lavaggio si effettuano rimuovendo completamente la soluzione da bagno e sostituendola con un nuovo tampone Krebs ossigenato a 37 °C. I miografi commerciali hanno comunemente una funzione di lavaggio integrata che drena le camere miografiche.
  3. Generare una curva cumulativa concentrazione-risposta (CRC) alla fenilefrina (PE), aggiungendo concentrazioni crescenti (esempio intervallo 10⁻9 a 10⁻4 M). Lascia che ogni concentrazione si stabilizzi prima di aggiungere la successiva fino a raggiungere un plateau massimo stabile.
  4. Eseguire almeno tre lavaggi consecutivi con un tampone Krebs ossigenato fresco a 37 °C fino a quando una tensione basale passiva stabile non viene ripristinata.
  5. Valutare la funzione endoteliale: preconstringere con una concentrazione submassimale di PE, permettere la risposta di stabilizzarsi e poi valutare il rilassamento dipendente dall'endotelio con ACh (esempio intervallo 10⁻⁹ a 10⁻⁵ M). Lascia che ogni concentrazione si stabilizzi prima di aggiungere la successiva concentrazione fino a raggiungere un rilassamento massimo stabile. Registrare la percentuale di rilassamento rispetto al tono precostritto (vedi passo 7.4). Le preparazioni che mostrano un rilassamento del <70% sono escluse.
    NOTA: Le malattie della parete vascolare, come l'ipertensione, sono comunemente associate a disfunzioni endoteliali, che spesso portano a una risposta di vasorilassamento endoteliale dipendente dall'endotelio all'ACh19. In queste condizioni, i preparati che mostrano un rilassamento del <70% non dovrebbero essere esclusi automaticamente, poiché ciò potrebbe rappresentare una vera disfunzione endoteliale legata alla malattia piuttosto che un fallimento tecnico.
  6. Eseguire almeno tre lavaggi consecutivi con un tampone Krebs ossigenato fresco a 37 °C fino a quando una tensione basale passiva stabile non viene ripristinata.
  7. Testare altri agenti vasoattivi, con e senza inibitori specifici per le vie, come richiesto dalla domanda sperimentale.
  8. Al termine dell'esperimento, rimuovere tutti i recipienti montati, pulire tutte le camere con acido acetico all'8%, seguito da tre lavaggi d'acqua e infine spegnere il serbatoio del gas e la macchina.
  9. Smaltire i rifiuti biologici e chimici secondo le procedure istituzionali.

7. Analisi e reportistica dei dati

  1. Definizione e registrazione di base. Registra la tensione di base immediatamente prima dell'inizio di qualsiasi sfida vasocostrittrice (ad esempio, sfida ad alto K⁺, CRC vasocostrittore o precostrizione prima di una CRC vasodilatatrice).
    NOTA: Per un'analisi successiva, è praticamente più facile azzerare le letture di forza sull'interfaccia utente dopo un adeguato lavaggio di qualsiasi stimolazione precedente, immediatamente prima dell'inizio di qualsiasi sfida vasocostrittrice (cioè, tensione di base visualizzata = 0).
  2. Sfida High-K⁺. Calcolare la forza attiva come: Forza attiva = Tono massimo dopo KCl - Tensione di base (unità: mN). Esprimi la forza attiva normalizzata a lunghezza unitaria (mN/mm) o area della sezione trasversale (mN/mm 2) del segmento arterioso montato. La misurazione dell'area della sezione trasversale richiede un'analisi istologica successiva dei segmenti dell'arteria montata per determinare lo spessore della parete.
    NOTA: Poiché gli anelli aortici spesso producono una risposta non plateau, si misura la risposta massima ad alto K⁺ entro un tempo predefinito (ad esempio, 10 minuti) in tutte le preparazioni, per minimizzare la variabilità. Nelle MRA, la massima risposta ad alto K⁺ viene solitamente raggiunta entro pochi secondi dalla stimolazione.
  3. CRC contrattili. Per ogni concentrazione in un CRC cumulativo contrattile (ad esempio, PE), calcola la forza attiva come segue. Esprimi la forza attiva a ogni concentrazione come percentuale della risposta suscitata dalla sfida ad alto K⁺. Utilizzare questi valori percentuali per adattare i CRC contrattili (vedi passo 7.5).
    Forza attiva = Tono massimo dopo l'applicazione del farmaco - Tensione di base (unità: mN)
    NOTA: Alcune condizioni possono causare variabilità nelle risposte massime ad alto K⁺ tra le preparazioni (ad esempio, cambiamenti nella massa muscolare liscia o nello stato di differenziazione derivanti da patologie). In queste circostanze, esprimi la forza attiva a ciascuna concentrazione normalizzata a unità, lunghezza (mN/mm) o area della sezione trasversale (mN/mm2) del segmento arterioso montato.
  4. CRC rilassanti. Per i CRC di rilassamento dopo una precostrizione submassimale (tono di precostrizione), calcolare la percentuale di rilassamento a ogni concentrazione come segue. Utilizzare questi valori percentuali per adattare i CRC di rilassamento (vedi passo 7.5).
    Rilassamento = (Tono di precostrizione - Tono dopo l'applicazione del farmaco) / (Tono di precostrizione - Tensione di base) × 100.
  5. Adattamento della curva. Per CRC cumulative sia contrattili che rilassanti, si traccia il log [concentrazione agonista] sull'asse x rispetto alla risposta normalizzata sull'asse y. Adatta la curva tracciata con un modello logistico a quattro parametri usando la regressione non lineare. Estrarre Emax (effetto massimo) e pEC50 (−logEC50) per confronti statistici, dove EC50 è la concentrazione di agonista che produce il 50% di Emax.
  6. Presentazione dei dati: Presentare i CRC normalizzati. Per ciascuno dei punti dati sulla curva, si utilizza la media del gruppo ± errore standard della media (SEM) o della deviazione standard (SD). Includere tracce originali rappresentative e fornire una tabella dei parametri che riassuma i valori di Emax e pEC50 (media ± SEM o SD).
  7. Analisi statistica:
    1. Confrontare i CRC tra gruppi sperimentali utilizzando l'analisi di varianza a due vie con misure ripetute (ANOVA) con un test post-hoc appropriato (ad esempio, Bonferroni). Tuttavia, controlla le assunzioni (sfericità, normalità) e utilizza approcci alternativi (ad esempio, modelli a effetti misti) quando i dati sono mancanti o sbilanciati.
    2. Confrontare pEC50 ed Emax tra due gruppi sperimentali utilizzando un test t non accoppiato, o ANOVA unidirezionale se si confrontano più di due gruppi sperimentali. In alternativa, si usano test non parametrici quando le assunzioni di omogeneità e normalità della varianza vengono violate. Imposta la significanza statistica a p < 0,05.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Uno schema che rappresenta il flusso di lavoro complessivo della miografia a filo nelle arterie di condotti e di resistenza isolate da topi o ratti è mostrato nella Figura 1. Immagini rappresentative dell'isolamento e del montaggio di un anello aortico toracico del topo e di una ARM di secondo ordine sono mostrate rispettivamente nella Figura 2 e nella Figura 3. Screenshot software che mo...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La miografia a filo rimane un approccio potente e ad alta risoluzione per interrogare la funzione vascolare ex vivo. Se eseguito con attenzione, questo metodo fornisce endpoint quantitativi affidabili che affrontano questioni biologiche distinte, consentendo al contempo un confronto rigoroso tra letti macro- e microvascolari all'interno dello stesso animale. Gli studi sulle arterie condotte rivelano cambiamenti nella meccanica arteriosa globale e nella reattività dei grandi vasi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Il lavoro è stato sostenuto da un premio NHLBI (R00 HL153896 a I.O.) e da fondi iniziali dell'Università di Toledo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi centrifughe conici da 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-70C
Tubi centrifughe conici da 50 mLThermo Fisher Scientific14-959-49A
Acido aceticoThermo Fisher ScientificA490-212
AcetilcolinaMillipore SigmaA6625-100G
Bilanciamento AnaliticoMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Carbogeni (95% O2/5% CO2)AirgasCD USP50
Microscopio della dissezione ZEISSZEISS Stemi 305
Dissezione della piastra di PetriStrumentazione dei Sistemi ViventiDD-90-S-BLK
Perni di dissezioneTecnologia danese Myo400626
Kit di strumenti per la dissezioneTecnologia danese Myo101017Il kit consiste in forbici per la dissezione (1), forbici multiuso (1), piastre di Petri (5), pinze (3) e perni per la dissezione (1).
Dumont #5 - Pinza fineStrumenti scientifici di qualità11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Freezer (-20 °C; C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
Scatole a cerniera per congelatoriUSA Scientific2310-5848
Guanti (Grande)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Guanti (Medi)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Guanti (Piccoli)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlucosioThermo Fisher ScientificD16-500
Cilindro graduatoThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad PrismGraphPad SoftwareN/AAnalisi dei dati e presentazione grafica
Soluzione di acido cloridricoThermo Fisher ScientificSA48-1
Secchio di ghiaccioThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
LabChart 8 SoftwareAD InstrumentsN/ASoftware di acquisizione dati
Frigorifero da laboratorioThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
Sorgente luminosa LEDThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Agitatore magneticoThermo Fisher ScientificFB30786159
Barre magnetiche di agitazione (Grandi)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Barre magnetiche di agitazione (Medie)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Set di campionamento Micro Cucchiai e SpatoleThermo Fisher ScientificS43322
Tubi microcentrifugheUSA Scientific1615-5510
Mini microcentrifugaThermo Fisher Scientific07-203-954
Mini-cacciaviteThermo Fisher ScientificNC1349489
Sistema miografo multifiloTecnologia danese MyoDMT 620M
NaCl Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
Misuratore di pHThermo Fisher Scientific01-912-351Include misuratore di pH, sensore LE420, QuickGuide per installazione e pacco starter per il tamponamento di pH
Fenilefrina Millipore SigmaP6126-5G
Controller a pipetteThermo Fisher Scientific01-001-023
Punte di pipette nei rack (10 & micro; L)USA Scientific1111-3810
Punte di pipette nei rack (1000 & micro; L)USA Scientific1111-2830
Punte di pipette nei rack (200 & micro; L)USA Scientific1111-1810
Bottiglie di conservazione per supporti riutilizzabili PYREXThermo Fisher Scientific06-414-1D
Pipette sierologiche (10 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Pipette sierologiche (25 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Micropipetta a canale singolo Multi-PackThermo Fisher Scientific13-684-2503 pipette (0,5-10 e mu; L, 10-100 μ L, 100-1000 μ L)
Filo d'acciaio inox (40 & mu; m)Tecnologia danese Myo400447
TimerThermo Fisher Scientific02-261-840
Sistema Ultra Puro AcquaSartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Forbici a Primavera VannasStrumenti scientifici di qualità15000-00
Fiaschetta volumetricaThermo Fisher Scientific13-756-400
Miscelatore a vorticeThermo Fisher Scientific10-320-807
Bagno d'acquaThermo Fisher Scientific07-202-155
Pesare i piattiThermo Fisher Scientific02-202-101

Riferimenti

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Reattività VascolareArterie MesentericheMiografia IsometricaDissezione ArterialeFunzione VascolareFunzione EndotelialeFunzione della Muscolatura Liscia

Questo articolo è stato pubblicato

Video in arrivo

Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.