Articolo metodologico

Flusso di lavoro di crio-tomografia elettronica per tessuti spessi dimostrato nell'ippocampo del topo

DOI:

10.3791/70192

⸱

27 marzo 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo standardizza la criotomografia elettronica (crio-ET) per tessuti spessi integrando il congelamento ad alta pressione (HPF) con il metodo waffle, il sollevamento criogenico del fascio di ioni a fuoco (crio-FIB) e l'acquisizione parallela a simmetria dose, producendo lamelle uniformemente sottili e campioni vitrificati per analisi riproducibili in situ nell'ippocampo del topo.

Abstract

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La crio-tomografia elettronica (crio-ET) consente la visualizzazione 3D dell'ultrastruttura cellulare nativa, ma la sua applicazione ai tessuti spessi è limitata dalla mancanza di una vitrificazione affidabile e dalla preparazione a bassa produttività delle lamelle. Qui viene presentato un flusso di lavoro end-to-end che integra il congelamento ad alta pressione (HPF; ~2100 bar; tempo di dissezione a congelamento ≤90 s) utilizzando un assemblaggio "waffle" con lamina di rame su tessuto pre-sottile, sollevamento crio-FIB e assottigliamento controllato a lamelle da 120–200 nm con compensazione per sovrainclinazione. Il rivestimento conduttivo è standardizzato (sputter-Pt 30 mA/15 s; Cappuccio GIS 0,5–1,0 μm) per minimizzare il sipping. Acquisizione automata e simmetrica in dose (0°, ±3°, ±6°... fino a ±60–66°; la dimensione del passo è di 2–3°; dose totale 100–150 e⁻/Å2) è implementata tramite script PACEtomo, con l'angolo di inclinazione iniziale derivato dall'angolo di fresatura e dall'orientamento del campione. L'elaborazione con AreTomo 3 fornisce funzioni per la correzione del movimento, la stima CTF, l'allineamento e la ricostruzione WBP in quasi tempo reale; IsoNet può opzionalmente ridurre l'anisotropia del wedge mancante. La media subtomografica (RELION 4.0) segue una strategia pseudo-subtomogramma con la segnalazione della risoluzione basata su un cutoff FSC di 0,143. Dimostrato su ippocampo di topo, il flusso di lavoro produce regolarmente campioni ben vitrificati e lamelle uniformi (spessore bersaglio 150 ± 40 nm) e raggiunge una raccolta ad alta velocità in serie inclinata (tipicamente serie 5–8 min/tilt). Questo protocollo offre una via riproducibile per studiare la biologia strutturale in situ direttamente da ambienti tissutali complessi.

Introduzione

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La criotomografia elettronica (crio-ET) è emersa come una tecnica fondamentale per visualizzare complessi macromolecolari e architetture cellulari nel loro stato nativo eidratato 1,2,3,4,5. Ricostruendo volumi tridimensionali da serie tilt di immagini proiettive, la crio-ET colma il divario tra il contesto cellulare e la risoluzione quasi atomica, offrendo intuizioni senza precedenti sulla biologia strutturale in situ6. Sebbene i flussi di lavoro di crio-tomografia elettronica per campionicellulari 7 (incluse cellule assottigliate per crio-FIB in sospensioni e cellule aderenti) siano ormai ben consolidati, la loro estensione diretta a tessuti spessi e architettonicamente intatti rimane altamenteimpegnativa 8,9,10. Questo è particolarmente vero per tessuti ad alto contenuto d'acqua come ilcervello 11, dove la vetrificazione affidabile e la preparazione di lamelle elettroni trasparenti (tipicamente <200 nm) continuano a rappresentare colli di bottigliapersistenti 12.

Ottenere la vitrificazione nei tessuti è difficile a causa dell'elevato contenuto d'acqua e del limitato trasferimento di calore. Sebbene il congelamento a immersione sia efficace per campioni sottili (≤20 μm)13, fallisce per la maggior parte dei tessuti. Il congelamento ad alta pressione (HPF) sopprime la nucleazione del ghiaccio applicando alta pressione, consentendo la vitrificazione di campioni fino a ~200 μm in teoria. Tuttavia, l'efficienza della HPF convenzionale è spesso subottimale per la vitrificazione dei tessuti. Per migliorare i risultati, sforzi recenti hanno adottato strategie come l'aggiunta di crioprotettivi14 e l'esecuzione della pre-sezionazione15,16 (ad esempio, usando un vibratome) per ridurre meccanicamente lo spessore del campione prima delcongelamento 11,17. Sebbene questi approcci possano migliorare la qualità della vitrificazione, spesso comportano una maneggiamento ex vivo prolungata e l'uso di additivi chimici che rischiano di alterare le strutture native. Per affrontare queste limitazioni, questo studio ha modificato la strategia dei portatori "waffle" originariamente sviluppata da Kelley et al.18 incorporando un'ottimizzazione critica: il tessuto cerebrale viene fisicamente compresso usando due portatori di rame lucidati prima del congelamento, che pre-assottigliano il campione mentre lo fissano contemporaneamente tra una griglia filmata e una lamina di rame. Questo design non solo promuove una vitrificazione rapida e uniforme, ma migliora anche significativamente la stabilità meccanica, prevenendo così efficacemente la rottura della griglia e la perdita di campioni durante la successiva manipolazione, stabilendo una solida base per ottenere campioni di tessuto congelato intatti e di alta qualità.

Dopo la vitrificazione, il diluizione rimane un ostacolo importante sia alla produzione che alla qualità. Come tecnica precoce e ampiamente adottata, la crio-ultramicrotomia consente numerosi studi strutturali fondamentali in situ. Tuttavia, introduce frequentemente manufatti di compressione e taglio19,20 che compromettono l'integrità strutturale. Al contrario, la fresazione a fascio di ioni criofocalizzato (crio-FIB) 21 offre una precisione superiore e una distorsione minima 7,22. Inizialmente, la fresatura crio-FIB veniva applicata direttamente a campioni vitrificati su griglie per produrre lamelle23; tuttavia, questo approccio in situ è principalmente efficace per campionisottili 24,25 (ad esempio, cellule coltivate o regioni di tessuto periferico) e non possono accedere a strutture più profonde all'interno di tessuti spessi e voluminosi. Per superare questa limitazione di profondità, sono state sviluppate26 strategie di sollevamento, che hanno permesso l'estrazione site-specific delle regioni di interesse (ROI) dall'interno dei campioni. I progressi metodologici successivi, tra cui il sollevamento seriale27 e la serializzazione su griglia (SOLIST)28, hanno ulteriormente migliorato la produttività, la stabilità lamellare e la precisione del targeting correlativo 3D nei tessuti complessi. Più recentemente, le innovazioni hanno continuato a far progredire il campo, tra cui il metodo di attacco a sei lati di Tang et al.29, che migliora la stabilizzazione meccanica durante sollevamento e diradamento, oltre a innovazioni di fresatura on-grid di Benjamin C. Creekmore et al.11 che permettono l'accesso a strutture profonde preservando il contesto del tessuto nativo. Nonostante questi progressi, i protocolli continuano a variare in efficienza, riproducibilità e adattabilità tra i diversi tipi di tessuto. Persiste una lacuna critica nell'istituzione di un flusso di lavoro standardizzato, facilmente replicabile e ampiamente applicabile che integri queste ottimizzazioni in una pipeline coerente per diversi tessuti spessi.

Questa lacuna viene qui colmata sintetizzando dettagli tecnici chiave di metodologie consolidate e perfezionandoli in una pipeline generalizzata end-to-end. Questo protocollo non solo impiega il metodo HPF-waffle avanzato per una vitrificazione robusta, ma incorpora anche una serie di passaggi ottimizzati per il sollevamento e l'assottigliamento crio-FIB, come la compensazione sistematica dell'over-tilt, il rivestimento conduttivo standardizzato e le sequenze di fresatura calibrate, che collettivamente migliorano l'uniformità delle lamelle, riducono artefatti (ad esempio, il taglio a cortina) e migliorano la capacità produttiva. A differenza dei protocolli adattati a specifici tipi cellulari o organismi modello, questo flusso di lavoro è progettato con la generalizzabilità al centro, fornendo un quadro versatile adattabile a un'ampia gamma di tessuti spessi e complessi, inclusi quelli relativamente morbidi e soggetti a compressione, oltre all'ippocampo del topo dimostrato.

Dimostrato nel modello complesso dell'ippocampo del topo, noto per la sua suscettibilità ai danni del ghiaccio e alla complessità strutturale, questo flusso di lavoro integrato e generalizzato produce in modo affidabile lamelle di alta qualità (120–200 nm) e supporta l'acquisizione efficiente in serie inclinata (5–8 min/serie). Questa consolidazione delle migliori pratiche in un protocollo coerente, accessibile e ampiamente applicabile fornisce un quadro riproducibile che abbassa la barriera tecnica all'implementazione della crio-ET nella ricerca sui tessuti spessi in contesti biologici e biomedici diversi.

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono tessuto animale sono state conformi al SUSTech IACUC (Protocollo SUSTech-JY202501019). I regenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del supporto del campione

  1. Preparazione dei portatori HPF (vedi Figura 1A)
    1. Ottenere una coppia di portatori HPF in rame da 6 mm (tipo B). Assicurati che uno dei trasportini abbia una superficie piana.
    2. Bagna la superficie piatta del trasportino e procedi a macinare. Per prima cosa, usa carta vetrata da 8000 grana finché i segni originali di lavorazione non saranno completamente rimossi. Poi, passa alla carta vetrata grana 12000 e continua a levigare finché i graffi del passaggio precedente non vengono in gran parte eliminati, ottenendo una finitura uniformemente liscia. La Figura 2 mostra immagini tipiche della superficie del portatore durante il processo di levigatura e lucidatura.
    3. Lucidare la superficie smerigliata usando un panno metallografico morbido e una pasta diamantata W0.5: prima applicare la pasta sul tessuto, poi lucidare la superficie in un movimento circolare per 1–2 minuti fino a ottenere una finitura liscia e altamente lucidata. Risciacqua accuratamente il trasportatore con etanolo, seguito da acqua distillata per rimuovere tutti i residui abrasivi.
    4. Immergi i portatori lucidati in 1-esadecene per almeno 4 ore (o durante la notte) prima del loro utilizzo.
      NOTA: I portatori lucidati e trattati possono essere conservati sommersi in 1-esadeceno.
      ATTENZIONE: 1-Esadecene è infiammabile e dannoso se inalato; lavorano in una cappa con DPI.
  2. Preparazione della griglia di supporto TEM (vedi Figura 1B)
    1. Usa griglie di rame a 100 mesh con un film di supporto continuo Formvar/carbonio.
    2. Spruzzare su entrambi i lati delle griglie con oro usando un sputter coater: imposta la corrente a 50 mA e ricopri ciascun lato per 120 secondi per ottenere uno strato di circa 6 nm per lato.
  3. Preparazione della lamina di rame (vedi Figura 1C)
    1. Ottieni un foglio di rame ad alta purezza con uno spessore di 1 μm.
      NOTA: La conducibilità termica del rame varia con la purezza, e una purezza inferiore comporta una conduttività termica inferiore. Pertanto, è necessario un foglio di rame ad alta purezza (Cu ≥ 99,9%).
    2. Perfora la lamina di rame in dischi di diametro 3 mm usando una perforatrice circolare.

2. Congelamento ad alta pressione

  1. Posiziona una goccia da 10 μL di soluzione al 10% di saccarosio su una superficie di vetro pulita.
  2. Dissezionare rapidamente l'ippocampo da un topo appena soppresso. Rimuovere piccoli pezzi di tessuto di circa 0,5–1mm 3 usando una lametta affilata (vedi Figura 1D).
  3. Trasferisci il tessuto sulle griglie TEM di supporto in rame (100 mesh) all'interno del portatore HPF usando uno stuzzicadenti o uno spazzolino fine. Usa il 2-metilbutano (isopentano) per manovrare delicatamente il tessuto in posizione minimizzando lo stress meccanico sulla griglia.
    ATTENZIONE: Il 2-metilbutano (isopentano) è estremamente infiammabile. Maneggialo in una cappa senza fonti di accensione.
  4. Copri il tessuto e la griglia con un disco di lamina di rame di 3 mm di diametro. Completare l'assemblaggio posizionando il secondo supporto HPF (piatto a faccia in giù) sopra per formare il sandwich sigillato a "waffle" (vedi Figura 1E).
    NOTA: La lamina di rame svolge una funzione meccanica fondamentale nell'assemblaggio waffle. Mette il tessuto tra la griglia TEM e la lamina stessa. Durante l'assemblaggio, questa configurazione applica una pressione delicata, aiutando a formare una fetta di tessuto più sottile e uniforme, ideale per la vitrificazione. Inoltre, la lamina previene la perdita di tessuto durante la maneggiazione e aiuta a distribuire la pressione durante il congelamento ad alta pressione, riducendo il rischio di rottura della griglia. Dopo il congelamento, la lamina facilita anche la separazione dei portatori dalla griglia del campione vitrificato. Tuttavia, questo metodo di preparazione può introdurre danni da compressione meccanica e potrebbe non essere adatto a campioni sensibili a artefatti indotti dalla pressione. Per tali campioni, dovrebbero essere considerate tecniche di taglio alternative che raggiungano uno spessore appropriato senza compressione, come la sezionazione con vibratome o il punching del campione.
  5. Avviare immediatamente la procedura di congelamento ad alta pressione in conformità con il protocollo operativo del produttore. Imposta la pressione target a ~2100 bar e assicurati che il tempo totale dalla dissezione del tessuto al congelamento non superi i 90 secondi.
    NOTA: L'intera procedura, dalla dissezione al congelamento, deve essere completata entro 90 secondi per minimizzare le alterazioni strutturali associate a un tempo ex vivo prolungato. Lo spessore del tessuto per il cervello è di circa 20–40 μm.

3. Frenatura FIB e sollevamento

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi utilizzando un microscopio a doppio fascio dotato di uno stadio criogenico. Mantieni la temperatura del campione sotto -170 °C per tutta la durata.

  1. Preparazione della griglia del ricevitore
    1. Ottenere una nuova griglia d'oro da 300 mesh per servire come griglia ricevente finale per la procedura di sollevamento.
    2. Sotto uno stereomicroscopio a temperatura ambiente, inserire delicatamente la griglia in un anello AutoGrid crio-FIB compatibile.
    3. Conserva l'AutoGrid assemblato direttamente in un forno asciutto mantenuto a circa 40 °C per minimizzare l'accumulo di gelo prima dell'uso.
      NOTA: Durante il clipping assicurati che la griglia sia piatta e centrata per evitare piegamenti o disallineamenti.
  2. Recupero e montaggio della griglia di tessuto vetrificato
    1. Immergendo continuamente l'assemblaggio in azoto liquido (LN₂), separare con cura la griglia TEM vetrificata (contenente il tessuto e la lamina di rame) dai componenti circostanti dell'assemblaggio "waffle".
      NOTA: Il distanziatore in lamina di rame di solito rende facile separare la griglia dai portanti.
    2. Su una postazione di lavoro a caricamento criogenico pre-raffreddata, montare la griglia di tessuto isolato in un secondo anello AutoGrid crio-FIB sotto protezione LN₂.
  3. Griglie di co-caricamento sulla navetta crio-transfer
    1. Carica entrambi gli AutoGrid negli slot designati dello shuttle crio-trasferito.
    2. Orienta ogni AutoGrid in modo che la tacca di fresatura sia rivolta verso l'esterno e verticale.
    3. Mantenere la navetta caricata in immersione LN₂ o pre-raffreddata fino al trasferimento nel microscopio FIB/SEM.
  4. Localizzazione e rivestimento conduttivo nella FIB/SEM
    1. Dopo il crio-trasferimento al microscopio, navigare verso la griglia tissutale a basso ingrandimento SEM.
    2. Applica un rivestimento conduttivo e protettivo su tutta la superficie della griglia.
      1. Rivestire la superficie della griglia con platino (Pt) a 30 mA per 15 secondi.
      2. Depositare un tappo organometallico Pt di spessore 0,5–1,0 μm utilizzando il Sistema di Iniezione di Gas (GIS).
      3. Applicare uno strato finale di Pt rivestito a sputter sulla superficie della griglia a 30 mA per 15 secondi.
        NOTA: Il cappuccio GIS è fondamentale per ridurre gli artefatti di tenda.
  5. Isolamento e sollevamento del blocco tissutale (vedi Figura 3)
    1. Selezione del sito e orientamento
      1. Naviga fino alla regione di interesse selezionata (ROI) sulla griglia tissutale utilizzando l'immagine del fascio di elettroni SEM.
      2. Orienta il campione per la fresatura frontale. La posizione tipica dello stadio è impostata su rotazione di 110° e inclinazione di 7°, e questa posizione presenta la superficie del campione con un angolo adatto all'accesso del fascio di ioni.
        NOTA: In assenza di marcatori fluorescenti si può adottare una strategia di pre-screening. Questa strategia mira a localizzare la regione tessutale bersaglio ed escludere aree contenenti crioprotettori o altri componenti non tissutori. Dopo aver selezionato una regione apparentemente priva di ghiaccio superficiale, si fresa una piccola trincea di prova usando una corrente di fascio più alta (ad esempio, 15 nA a 30 kV) con l'orientamento standard frontale e lucidare usando una corrente di trave inferiore (ad esempio, 1 nA a 30 kV). Si passa al fascio di elettroni per esaminare la sezione trasversale: il tessuto mostra un eccellente contrasto sotto il fascio di elettroni, una caratteristica particolarmente marcata nelle strutture membranose e nelle regioni ricche di elementi pesanti; al contrario, il crioprotettore tipicamente mostra un contrasto uniforme sotto il fascio di elettroni. Questo consente una verifica rapida prima di procedere con la procedura completa di sollevamento.
    2. Frenatura a trincea per isolare il blocco (Figura 3A)
      1. Definire una trincea rettangolare che circonda il blocco tessutale bersaglio utilizzando il fascio ionico operato a 30 kV.
      2. Iniziare la fresatura a una certa distanza dal blocco utilizzando una corrente relativamente elevata di 15 nA per ottenere una rapida rimozione del materiale.
      3. Quando le pareti della trincea si avvicinano al blocco fino a pochi micrometri, si riduce la corrente del fascio ionico a 7 nA. Ridurre la corrente consente un controllo più preciso e minimizza il danno del fascio ionico e il riscaldamento del materiale biologico nella regione di interesse.
      4. Lascia un lato del blocco attaccato al materiale sfuso come una "linguetta" per tenerlo in posizione temporaneamente.
    3. Frenatura opzionale per blocchi spessi (Figura 3B)
      1. Per blocchi di tessuto con spessore stimato superiore a 20 μm, eseguire un passaggio di fresatura sottotagliata dal lato opposto per facilitare il sollevamento finale.
      2. Ruota lo stage (ad esempio a -70°) e regola l'inclinazione dello stage (ad esempio a 23°) per accedere al fondo del blocco.
      3. Fresare la connessione inferiore usando la FIB a 30 kV e una corrente di 3 nA.
    4. Attacco all'ago del micromanipolatore (Figura 3C)
      1. Per fissare il campione all'ago esegui schemi di fresatura a sezione trasversale sequenziali.
        NOTA: Il blocco d'oro può essere estratto dalla barra di una griglia d'oro a 300 reti.
    5. Sollevamento del blocco tissutale (Figura 3D)
      1. Tagliare la restante "tabula" che collega il blocco al campione di massa usando la FIB (30 kV, 1 nA).
      2. Manovrare con attenzione l'ago del micromanipolatore per sollevare il blocco tissutale ora isolato, in modo che sia completamente libero dalla trincea e dalla griglia originale circostante. Poi, ritrai l'ago e trasporta il blocco sulla griglia del ricevitore.
    6. Trasferimento di blocchi, saldatura e rivestimento
      1. Naviga l'ago fino a una griglia di ricevitore in oro pre-raffreddata da 300 megli.
      2. Abbassa il blocco su una casella a griglia scelta. Porta il blocco di tessuto a contatto con la pellicola sulla griglia, poi solleva il blocco verticalmente per rompere il contatto. Fresare una fetta spessa ~3–4 μm dal blocco sulla pellicola a griglia usando il fascio di ioni (30 kV, 1 nA) (Figura 3E).
        NOTA: Se sono presenti detriti di ghiaccio, pre-pulire il sito di attacco con un motivo rettangolare (30 kV, 50 pA). Assicurati che il blocco entri in contatto con la pellicola della griglia per ridurre la carica elettrostatica, che potrebbe spostare casualmente la fetta.
      3. Saldare la fetta in modo sicuro fresando utilizzando schemi di sezione trasversale di pulizia su entrambi i lati della giunzione (30 kV, 30 pA) (Figura 3F).
      4. Reapplicare il rivestimento conduttivo/protettivo come descritto nel Passaggio 3.4.2 (Figura 3G).
        NOTA: Per questa fase di placcatura GIS la durata può essere ridotta a seconda della dimensione del blocco.
    7. Assottigliamento delle lamelle
      1. Ruota lo stadio (ad esempio, a -70°) e imposta un'inclinazione iniziale dello stadio (ad esempio, 15°) (Figura 3H).
        NOTA: Il portacampioni presenta una pre-inclinazione di 45°.
      2. Definisci la posizione finale della lamella all'interno di un'area liscia del blocco tissutale.
        NOTA: Confermare che l'area selezionata sia priva di contaminazione da ghiaccio.
      3. Eseguire fresatura sistematica utilizzando le correnti del fascio ionico specificate nella Tabella 1. Si fa progresso da correnti più alte a quelle più basse man mano che si avvicina al piano bersaglio (Figura 3I,J). Opzionalmente, quando si trova entro 1–2 μm dalla lamella, una trincea di sollievo può essere fresata a circa 1,5 μm di distanza per evitare la piegatura o l'arricciamento dellalamella 30,31.
        NOTA: Quando il materiale rimanente si trova entro ~1 μm dal piano bersaglio, limita lo spessore rimosso per ogni passaggio.

4. Raccolta dati crio-ET

  1. Dopo una preparazione riuscita della lamella, caricare con cura la griglia in un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) dotato di un portacrio, un filtro energetico e software per tomografia (ad esempio, SerialEM).
  2. Acquisire una mappa dell'atlante dell'intera griglia (ad esempio, Figura 4A; l'ingrandimento tipico è 155×).
  3. Naviga fino alla posizione della lamella e acquisisci una mappa di montaggio (ad esempio, Figura 4B; ingrandimento tipico è 3600× con una defocalizzarsi di -100 μm).
  4. Impostare l'ingrandimento nominale della registrazione e verificare che la dimensione del pixel sia adeguata alla risoluzione desiderata; nel presente studio, è stata utilizzata una dimensione di pixel di 2,109 Å. Regolare i parametri di illuminazione corrispondenti, inclusi la dimensione del punto, il diametro dell'apertura C2 e l'area di illuminazione, per ottenere una velocità di dose ottimizzata per il rivelatore diretto di elettroni.
  5. Configura le condizioni di messa a fuoco e di prova per corrispondere a quelle impostate per il parametro Record.
  6. Effettuare la raccolta dati utilizzando gli scriptPaceTomo 32, seguendo i passaggi seguenti:
    1. Preseleziona i bersagli sulla mappa del montaggio usando la funzione "aggiungi punti" nel navigatore, assicurandoti che la prima caratteristica mostri un contrasto sufficiente.
    2. Seleziona i bersagli usando il PACEtomo_selectTargets.py script32, regolando l'area in evidenza all'ingrandimento di anteprima se necessario. Le regioni tipiche di interesse sono mostrate nella Figura 4C.
    3. Acquisire serie di inclinazione usando uno schema dose-simmetrico (ad esempio, 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... fino a ±60°–66°) con un incremento di 2° o 3°. Imposta i parametri di acquisizione nello script PACEtomo.py: l'angolo di inclinazione iniziale è determinato dall'angolo di fresatura specificato nello Passo 3.7.1 (cioè 8°), con il segno che dipende dall'orientamento del carico del campione nella crio-EM; gli angoli di inclinazione minimo e massimo si riferiscono a valori assoluti; e la dimensione del passo corrisponde all'incremento di inclinazione (ad esempio, 3°).
      NOTA: Questo angolo di inclinazione iniziale è progettato per posizionare la lamella orizzontalmente e perpendicolarmente al fascio di elettroni. Se l'angolo di fresatura è sconosciuto, inclinare l'immagine per mostrare la lamella alla sua massima altezza apparente; questo fornisce un allineamento sufficientemente accurato.
    4. Mantenere una dose cumulativa di elettroni di 100–150 e⁻/Å2 distribuita su tutte le inclinazioni. Se disponibile, usa un filtro energetico con una larghezza di fessura di 10 eV.
    5. Avvia l'acquisizione dei dati. La messa a fuoco e il tracciamento automatizzati sono implementati a ogni angolo di inclinazione. Il tempo tipico di acquisizione per una singola serie di inclinazione è di 5–8 minuti.
      NOTA: Una guida alla risoluzione dei problemi è fornita nella Tabella 2.

5. Elaborazione dei dati

  1. Processare le immagini di correzione del movimento in serie di inclinazione, stima CTF, allineamento e ricostruzione 3D del tomogramma utilizzando AreTomo 333 per eseguire tre passaggi principali: (1) correzione del movimento dei fotogrammi grezzi, (2) stima della funzione di trasferimento di contrasto (CTF) per ogni immagine inclinata e (3) allineamento dell'intera serie di inclinazione.
    1. Dopo l'allineamento ricostruisci i tomogrammi tridimensionali (3D ) tramite l'algoritmo di retroproiezione ponderata. Gli input necessari per questo passaggio includevano: fotogrammi grezzi, file di metadati mdoc (che documentano i parametri di acquisizione delle serie di inclinazione) e l'asse di rotazione predeterminato del campione.
  2. Correzione mancante del cuneo
    1. Dopo la ricostruzione, sottoponete i tomogrammi generati a correzione mancante del cuneo usando IsoNet34.
  3. Selezione e cura delle particelle
    1. Esegui la selezione delle particelle in EMAN 2.935 utilizzando il metodo di abbinamento dei template. Dopo la selezione automatica, i falsi positivi (cioè regioni non target o regioni selezionate erroneamente) venivano esclusi manualmente per garantire la qualità del dataset di particelle selezionato.
  4. Media subtomogrammatica
    1. Importare la serie di inclinazione e le corrispondenti coordinate particellarie in RELION 4.0. Eseguire la media dei subtomogrammi seguendo il flusso di lavoro standard descritto nella documentazione RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), che garantisce l'aderenza alle migliori pratiche consolidate per la riproducibilità.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'applicazione efficace di questo protocollo consente la produzione di lamelle tissulari vitrificate di alta qualità e la successiva ricostruzione di tomogrammi che rivelano l'ultrastruttura cellulare nativa. I seguenti esiti, dimostrati utilizzando tessuto ippocampo di topo, sono rappresentativi di un esperimento riuscito.

I blocchi tissulari processati tramite congelamento ad alta pressione con il metodo "waffle" mostravano un aspetto uniforme e trasparente ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il flusso di lavoro qui presentato stabilisce una pipeline generalizzata, ottimizzata e riproducibile per la criotomografia elettronica in situ di tessuti nativi e spessi. Il suo contributo principale non risiede nell'invenzione di tecniche singolari, ma nell'integrazione sistematica, nel perfezionamento e nella standardizzazione dettagliata dell'intero processo, dalla vetrificazione robusta con un metodo modificato waffle-HPF a un protocollo di sollevamento e assuste crio-FIB c...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano lo staff del Cryo-EM Center della Southern University of Science and Technology per il loro supporto tecnico. Questo progetto è stato sostenuto dal National Science and Technology Innovation (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – National Science and Technology Major Project, Grant No. 2022ZD0211905) e dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32200998 e No. 32161133022).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-EsadecenoSigma-AldrichH2131Sostanze chimiche e Reagenti
2-metilpentanoSigma-AldrichM65807Sostanze chimiche e Reagenti
Anello a clipThermo Fisher Scientific1131750; 1188953Consumabili
Lamina di rameMateriali metallici Fengcheng1 & micro; Spessore mConsumabili
Griglia TEM di supporto in rame (100 mesh)Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., LtdBZ10021bConsumabili
Cryo-EMThermo Fisher ScientificKrios G4Attrezzature  
Crio-FIBThermo Fisher ScientificAquilos 2Attrezzature  
Autogrid crio-FIBThermo Fisher Scientific1205101Consumabili
Griglie (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)QuantifoilAltrAufoilConsumabili
Congelatore ad alta pressioneLeica MicrosystemsEM ICEAttrezzature  
Portatore HPF, rameLeica MicrosystemsTipo B (6 mm)Consumabili
Rivestimento a Sput IonicoQuorumQ150RS plusAttrezzature  
Pasta di lucidatura metallograficaLab-testecW0.5Consumabili
Lucidatura del tessutoGORALB00809Consumabili
Carta vetrataCarta vetrata Eagle Brand8000 grana, 12000 granaConsumabili
StereomicroscopioLeica MicrosystemsS9iEquipaggiamento 
SucrosioSigma-Aldrich200-334-9Sostanze chimiche e Reagenti
Software per l'acquisizione della serie Tilthttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Software
Allineamento e allineamento della serie Tilt Software di ricostruzionehttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Software
Software per l'acquisizione della serie Tilthttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoSoftware
Allineamento e allineamento della serie Tilt Software di ricostruzionehttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetSoftware
Allineamento e allineamento della serie Tilt Software di ricostruzionehttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Software
Allineamento e allineamento della serie Tilt Software di ricostruzionehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlRelion 4Software

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
  2. Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: The resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52 (1), 339-360 (2023).
  4. Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature. 628 (8006), 47-56 (2024).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 58, 1-9 (2019).
  6. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  7. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  8. McCafferty, C. L., et al. Integrating cellular electron microscopy with multimodal data to explore biology across space and time. Cell. 187 (3), 563-584 (2024).
  9. Pöge, M., et al. Making plant tissue accessible for cryo-electron tomography. Elife. 106455, 1-41 (2025).
  10. Bäuerlein, F. J. B., et al. Cryo-electron tomography of large biological specimens vitrified by plunge freezing. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  11. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. -W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma fib milling. Nat Commun. 15 (1), 2660(2024).
  12. Chen, Z., Guo, Q. Innovations in cryo-electron tomography for tissues: Challenges and future prospects. Curr Opin Struct Biol. 93, 103112(2025).
  13. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (2009).
  14. Matsui, A., et al. Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses. Elife. 13, RP98458(2024).
  15. Ning, J., et al. Uncovering synaptic and cellular nanoarchitecture of brain tissue via seamless in situ trimming and milling for cryo-electron tomography. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  16. Zhang, J., et al. Vhut-cryo-fib, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography. J Struct Biol. 213 (3), 107763(2021).
  17. Glynn, C., et al. A generalizable and targeted molecular biopsy approach for in situ cryogenic electron tomography of vitreous brain tissue. Cell Rep Methods. 5 (7), 101080(2025).
  18. Kelley, K., et al. Waffle method: A general and flexible approach for improving throughput in fib-milling. Nat Commun. 13 (1), 1857(2022).
  19. Pierson, J., Ziese, U., Sani, M., Peters, P. J. Exploring vitreous cryo-section-induced compression at the macromolecular level using electron cryo-tomography; 80s yeast ribosomes appear unaffected. J Struct Biol. 173 (2), 345-349 (2011).
  20. Alamoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 150 (1), 109-121 (2005).
  21. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  22. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. J Struct Biol. 192 (2), 262-269 (2015).
  23. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nat Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  24. Engel, B. D., et al. Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography. Elife. 4, e04889(2015).
  25. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).
  26. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy. J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).
  27. Schiøtz, O. H., et al. Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms. Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).
  28. Nguyen, H. T. D., et al. Serialized on-grid lift-in sectioning for tomography (solist) enables a biopsy at the nanoscale. Nat Methods. 21 (9), 1693-1701 (2024).
  29. Tang, X., et al. Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis. Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).
  30. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae. J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).
  31. Berger, C., Watson, H., Naismith, J. H., Dumoux, M., Grange, M. Xenon plasma focused ion beam lamella fabrication on high-pressure frozen specimens for structural cell biology. Nat Commun. 16 (1), 2286(2025).
  32. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Methods. 20 (1), 131-138 (2022).
  33. Peck, A., et al. Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  34. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  35. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  36. Yang, Q., et al. The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis. Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).
  37. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).
  38. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Elife. 11, e82891(2022).
  39. Yang, J., et al. Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  40. Li, S., et al. Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  41. Medeiros, J. M., et al. Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography. Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).
  42. Goetz, S. K., et al. A modular platform for automated cryo-fib workflows. Elife. 10, e70506(2021).
  43. Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. Smart parallel automated cryo-electron tomography. Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).
  44. Swulius, M. T., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).

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