Quantificazione dei cambiamenti nelle unità formative di colonie di bifidobatteri e lattobacilli durante il trattamento con rifaximina e nel gel sinbiotico in volontari sani

Summary

Questo studio clinico ha valutato i conteggi di bifidobatteri e lattobacilli dopo una settimana di trattamento con rifaximina e un gel sinbiotico composto da Lactobacillus acidophilus NCFM e Bifidobacterium lactis Bi07, con inulina d'agave, durante il trattamento con rifaximina e 4 settimane dopo, rispetto a un gel placebo, mostrando che il gel sinbiotico può aiutare a mantenere i lattobacilli e i bifidobatteri.

Abstract

Sebbene il microbiota intestinale sia generalmente stabile, può essere influenzato dal trattamento antibiotico. La rifaximina, utilizzata per trattare disturbi gastrointestinali, viene frequentemente somministrata insieme a probiotici per ridurre il rischio di disbiosi. Lactobacillus acidophilus interagisce con le cellule intestinali e utilizza composti prebiotici. Bifidobacteria, in particolare Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, è un probiotico associato a effetti benefici nell'intestino. Gli studi in vitro hanno dimostrato la superiorità dei fruttani dell'agave rispetto all'inulina della cicoria. Nessuno studio ha documentato cambiamenti nei conteggi fecali di lattobacilli e bifidobatteri dopo la somministrazione concomitante di rifaximina e sinbiotici. Il nostro obiettivo era valutare le variazioni nei conteggi della CFU di bifidobatteri intestinali e lattobacilli nei volontari sani dopo il consumo di Synbiotic Gel, che contiene Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 e inulina d'agave come prebiotico, durante una settimana di trattamento con rifaximina e per 4 settimane dopo. In uno studio clinico randomizzato, controllato con placebo e in doppio cieco, i partecipanti sani senza trattamento antimicrobico nel mese precedente sono stati randomizzati 1:1 in due gruppi (10 partecipanti per gruppo). Il gruppo Gel Sinbiotico ha ricevuto 10,32 g di inulina d'agave come prebiotico e 4 ×¹⁰ CFU/g di Lactobacillus acidophilus NCFM e 4 ×^{10 9} CFU/g di Bifidobacterium lactis Bi07 al giorno per 5 settimane, e 200 mg di rifaximina due volte al giorno per la prima settimana. Il gruppo del Gel Placebo ha ricevuto il gel placebo per 5 settimane e 200 mg di rifaximina due volte al giorno per la prima settimana. I cambiamenti batterici sono stati stimati quantificando la CFU tramite valutazione microbiologica delle feci. Cinque settimane dopo, le popolazioni di lattobacilli e bifidobatteri non cambiarono. La rilevazione di Lactobacillus acidophilus NCFM e Bifidobacterium lactis Bi07 in alcuni campioni di feci suggerisce una colonizzazione transitoria e parziale, evidenziando la necessità di studi dose-risposta con questo prodotto sinbiotico.

Introduction

Il microbiota intestinale umano è una comunità densamente popolata che include specie autoctone permanentemente presenti e altri microrganismi transitori. Sebbene la sua composizione possa variare tra individui, è generalmente considerata stabile. Tuttavia, può essere influenzata dall'età, dall'infezione e dal trattamento^{antibiotico 1,2,3}. La rifaximina, un antibiotico ad ampio spettro con bassa assorbimento intestinale, viene utilizzata per trattare disturbi intestinali e può alterare il microbiota. I batteri probiotici dei generi Lactobacillus e Bifidobacterium vengono utilizzati per mitigare questi^{effetti 2}.

Sono stati segnalati ceppi di Bifidobacterium spp. resistenti alla^{rifaximina 2}, il che ha un effetto interessante nel promuovere una biota intestinale contenente popolazioni di Bifidobacterium spp. in numero sufficiente per effetti probiotici benefici.

Inoltre, Lactobacillus acidophilus è stato ampiamente riconosciuto per la sua capacità di interagire con l'epitelio^{gastrointestinale 4} e per la sua capacità di utilizzare prebiotici, come polisaccaridi, oligosaccaridi e fruttooligosaccaridi. Tuttavia, sono stati identificati solo pochi ceppi probiotici, come il ceppo Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM). Pertanto, è importante studiare i loro effetti in vivo, così come la presenza di Bifidobacterium lactis Bi07 nel tratto gastrointestinale, che è stato associato a vari benefici per la salute ^2,5. Questi probiotici richiedono un prebiotico per crescere in modo ottimale, motivo per cui un sinbiotico contenente sia un probiotico che un prebiotico funziona in sinergia; cioè, il suo effetto favorevole è superiore a quello del solo probiotico. Insieme ai prebiotici, che fungono da substrati per i probiotici, questa simbiosi dovrebbe migliorare la sopravvivenza dei microrganismi probiotici nel tratto gastrointestinale, portando a un maggiore ripristino del^{microbiota 6}.

Una fonte importante di prebiotici sono i fruttani dell'agave, che sono stati segnalati per avere effetti in vitro superiori sul microbiota rispetto a quelli della radice di cicoria (Cichorium intybus L.)⁷. Studi hanno riportato gli effetti del consumo di probiotici; ad esempio, Engelbrektson et al. hanno valutato se il consumo di probiotici durante e dopo la somministrazione di antibiotici potesse ridurre le alterazioni del microbiota causate dagli^{antibiotici 8}. Hanno scoperto che il gruppo che ha ricevuto la miscela probiotica ha mostrato un recupero più rapido del microbiota normale rispetto a chi non ne^{ha avuto 8}. Inoltre, Koning et al. hanno studiato la disbiosi nel microbiota intestinale di 40 volontari sani trattati con 500 mg di amoxicillina due volte al giorno per 7 giorni e il possibile recupero del microbiota dopo il consumo di una miscela probiotica. I risultati hanno mostrato che il trattamento con amoxicillina influenzava la composizione del microbiota nativo. Quando è stata somministrata una miscela probiotica, il microbiota si è ripreso significativamente dopo due mesi di consumo⁹.

Tuttavia, la letteratura riporta che nessuno studio ha indagato l'effetto del consumo sinbiotico (con fruttani dell'agave come prebiotico) sul microbiota intestinale durante e dopo la somministrazione di antibiotici, come la rifaximina; Abbiamo trovato solo studi con probiotici. Pertanto, questo studio ha valutato i cambiamenti nei conteggi di CFU di bifidobatteri intestinali e lattobacilli in volontari sani dopo il consumo di Synbiotic Gel, che contiene Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 e inulina d'agave come prebiotico, durante una settimana di trattamento con rifaximina e per 4 settimane dopo.

Protocol

Il protocollo fu approvato dal Comitato Istituzionale per la Ricerca Biomedica sull'Uomo (CIIBH) dell'Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubiran (INCMNSZ) (REFERENCE 1734). Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato prima di essere inclusi in questo studio.

Progettazione dello studio e popolazione

Si trattava di uno studio clinico randomizzato, controllato con placebo, in doppio cieco, con un periodo di follow-up di 5 settimane. I lavoratori dell'INCMNSZ sono stati invitati a partecipare allo studio, e tra il 2011 e il 2012 sono stati inclusi volontari sani di età compresa tra 20 e 50 anni senza trattamento antimicrobico nel mese precedente, che avevano accettato e firmato il modulo di consenso informato. I soggetti dello studio sono stati randomizzati 1:1 nel gruppo Gel Sinbiotico con 10,32 g di inulina d'agave come prebiotico e 4 ×^{10 9} CFU/ g di Lactobacillus acidophilus NCFM e 4 × 10⁹ UFC/g di Bifidobacterium lactis Bi07 al giorno, contenuti in 4 bustine per 5 settimane, e 200 mg di rifaximina due volte al giorno per la prima settimana. Il gruppo del Gel Placebo ha ricevuto 4 confezioni da 15 g di gel placebo, con la stessa presentazione e caratteristiche sensoriali del Gel Sinbiotico, per 5 settimane, e 200 mg di rifaximina due volte al giorno per la prima settimana (Figura 1).

Valutazione clinica

In entrambi i gruppi di studio, i sintomi e l'aspetto delle feci sono stati valutati utilizzando la Scala di Bristol. Sono stati misurati anche peso, altezza e indice di massa corporea (BMI). Un diario è stato utilizzato per valutare il consumo di gel sinbiotico, gel placebo e rifaximina, e per registrare la presenza o l'assenza di effetti collaterali legati all'ingestione del gel.

Consumo di fibra

L'apporto di fibre è stato valutato utilizzando un diario alimentare e un richiamo di 24 ore ogni settimana in entrambi i gruppi.

Aderenza al trattamento

L'aderenza al consumo di rifaximina e gel è stata valutata contando il numero di dosi di rifaximina e il numero di bustine di gel sinbiotici e placebo consumati per partecipante. La presenza di Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis è stata rilevata tramite reazione a catena della polimerasi (PCR).

Valutazione microbiologica delle feci

Alla visita 0 e settimanalmente per 5 visite (6 visite) in ciascun gruppo, i numeri di Lactobacilli, Bifidobatteri ed Enterobatteri sono stati valutati in 120 campioni fecali tramite il metodo del conteggio delle placche. Questo metodo misura le unità formanti colonia (CFU) posizionando campioni diluiti su mezzi solidi^{specializzati 10}. Al primo di ogni visita venivano raccolti campioni di feci.

Per identificare i microrganismi, venivano raccolti e conservati campioni fecali in tubi BBL. La fiala di PBG veniva utilizzata per i batteri anaerobi, e i campioni fecali venivano trasportati in un raffreddatore di polistirolo contenente confezioni di gel congelate per mantenere una bassa temperatura prima della lavorazione in laboratorio. Il tappo della fiala di PBG per la coprocoltura è stato rimosso e il campione di feci è stato raccolto tramite un tampone, assicurando che il tampone fosse impregnato con il campione. L'applicatore veniva quindi inserito in un tubo contenente un mezzo solido di coltura.

Per i batteri anaerobi, le fiale venivano pesate e 5–10 g di feci venivano raccolte con un cucchiaio. Le feci venivano poi mescolate con il contenuto della fiala e sigillate ermeticamente. Per la lavorazione dei campioni, sono state pesate le fiale contenenti i campioni e le buste Stomacher sterili. Il campione veniva svuotato in un sacchetto, centrifugato per 60 secondi, e poi venivano aggiunti 4,5 mL di acqua con peptone allo 0,1%. Successivamente, 500 μL del campione venivano trasferiti in una fiala e vortizzati per omogeneizzare la miscela. Dopo 100 μL del campione sono stati inoculati in duplicata su ciascuna piastra del mezzo selettivo specifico, mezzo Man Rogosa Sharpe (MRS) per i lattobacilli e mezzo DP Beerens con cisteina + cicloeximide (per eliminare la flora indesiderata) per i bifidobatteri, fino alla diluizione 8 (fattore di diluizione 0,1 mL). Per gli enterobatteri, il mezzo MacConkey è stato utilizzato nelle diluizioni 5–8 (fattore di diluizione 0,1 mL), dove le colonie batteriche sono state separate e quantificate¹¹. Ogni polvere di mezzo veniva sciolta in acqua distillata purificata, la soluzione veniva riscaldata fino a ebollizione per garantire la completa dissoluzione e veniva sterilizzata in autoclave a 121 °C per 15 minuti. La miscela veniva raffreddata a 46,5 °C per eseguire la tecnica della piastra di colamento, versando 1 mL per piastra in duplicata in piastre di Petri sterili contenenti 15–20 mL di mezzo di coltura, lasciando che le lastre si solidificassero. I campioni inoculati sono stati incubati a 37 °C in un'atmosfera arricchita di CO₂ in sistemi GasPak anaerobici per mantenere condizioni anaerobiche per 24–48 ore. Le unità formative di colonie (CFU) furono contrassegnate con una penna e^{contate 12}. È stata applicata la seguente formula:

CFU/mL = (numero di colonie × fattore di diluizione totale)/volume di coltura placcata (mL)

Identificazione delle caratteristiche morfologiche di lattobacilli e bifidobatteri

La macchia di Gram veniva utilizzata per identificare le caratteristiche morfologiche dell'esemplare. Un campione di colonie batteriche di ciascun ceppo veniva posto su un vetrino al microscopio, colorato con viola cristallina per 1 minuto, e poi risciacquato con acqua distillata. È stata applicata una soluzione di iodio per 1 minuto e poi risciacquata con acqua distillata. Per 10 secondi veniva usata una soluzione di alcol-acetone come decolorante e risciacquata con acqua distillata. Infine, la safranina è stata applicata come contro-tinta per 1 minuto e risciacquata con acqua distillata. Le vetri del microscopio sono state osservate sotto un microscopio ottico utilizzando olio a immersione con un obiettivo 100x.

La quantificazione totale è stata effettuata utilizzando la reazione a catena della polimerasi convenzionale (PCR) su campioni fecali selezionati casualmente da cinque soggetti per gruppo, ottenendo un totale di 60 campioni in 5 settimane. Gli isolati provenienti da mezzi di coltura venivano processati per l'estrazione di materiale genetico. La PCR è stata eseguita utilizzando primer batterici universali per amplificare un frammento del gene 16S rRNA¹³. I prodotti PCR venivano purificati e sequenziati. Le sequenze sono state verificate e inviate al database GenBank per confermare la presenza di lattobacilli e ceppi bifidobatterici isolati dai campioni fecali.

Analisi statistica

I dati sono presentati come frequenze assolute e relative o mediana (p25-P75). La gravità cumulativa dei sintomi è stata determinata utilizzando il punteggio di Likert (lieve, 1; moderato, 2; grave, 3) a ogni follow-up. I confronti tra gruppi sono stati effettuati utilizzando il test della somma dei rangi di Wilcoxon e il chi-quadrato o test esatto di Fisher. Confronti intra-gruppo tra le settimane 0 e 5 sono stati effettuati utilizzando il test di Friedman e confronti multipli con Durbin-Conover. La significanza statistica è stata fissata a P < 0,05.

Results

Venti volontari sani sono stati divisi casualmente nel gruppo Gel Sinbiotico (n = 10) e nel gruppo Gel Placebo (n = 10) (Figura 2 e Tabella 1). Nel gruppo Gel Sinbiotico, sette erano uomini e tre donne, con un'età mediana di 31 anni (intervallo, 27–35 anni); nel gruppo Placebo Gel, tre erano uomini e sette donne, con un'età mediana di 33 anni (intervallo 28–38 anni). I gruppi erano simili per età, sesso, peso e BMI. L'aderen...

Discussion

Nel presente studio, abbiamo riscontrato una significativa riduzione dei conteggi enterobatterici nei campioni fecali dei soggetti del gruppo placebo dalla prima settimana di intervento e nei soggetti del gruppo Gel Sinbiotico nella prima e seconda settimana. Questo cambiamento può essere spiegato usando la rifaximina, descritta come mitigatrice della sovracrescita batterica^{patogena 14}. Nel nostro studio, il gruppo Synbiotic Gel seguito dalla rifaximina ha mostrat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo BBL	NA	NA	Qualsiasi marca può essere usata
Medium DP	NA	NA	Qualsiasi marca può essere usata
Confezioni gelificate
Mezzo MacConkey	NA	NA
MRS medium	NA	NA	Qualsiasi marca può essere usata
Fiala PBG			Fosfato tampon, gelatina, sali 0,05% cisteina come agente riducente per 02
Piastre di Petri
Miscela placebo	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Stesse proprietà fisiche e sensoriali del gel symiotico, ma senza gli ingredienti attivi
Contenitore in polistirolo
Fusione simbiotica	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Prodotto non lattiero-caseario composto da Lactobacillus acidophilus NCMF e Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  CFU/g), e 17,2 g di inulina d'agave come prebiotico in un pacchetto da 15 g