Un protocollo per l'arricchimento basato sulla dimensione delle gocce lipidiche da cellule epiteliali mammere bovine e tessuti mamari

Sommario

Questo protocollo mira a ottenere la separazione e l'arricchimento delle gocce lipidiche basate sulla dimensione tramite centrifugazione sequenziale, consentendo un'indagine accurata e riproducibile dei meccanismi del metabolismo lipidico e dei processi biologici associati alle gocce lipidiche.

Abstract

Questo protocollo descrive un approccio sequenziale di centrifugazione differenziale per arricchire gocce lipidiche (LD) di diverse dimensioni da cellule epiteliali mammarie bovine (BMEC) e tessuti mammari, consentendo un'analisi risolta per dimensione oltre i metodi convenzionali di isolamento di LD in massa. In quanto centri regolatori dinamici del metabolismo lipidico intracellulare, i LD svolgono funzioni fondamentali immagazzinando lipidi neutri (come trigliceridi ed esteri colesterilici) e coordinandone la sintesi, l'idrolisi e il trasporto. Svolgono un ruolo centrale nel mantenimento dell'omeostasi energetica, nel supporto della biogenesi della membrana e nel facilitare la trasduzione del segnale cellulare. L'estrazione del LD è essenziale per indagare i meccanismi regolatori del metabolismo lipidico. Lo studio del metabolismo lipidico delle ghiandole mammarie ha implicazioni significative per lo sviluppo infantile, la salute umana, l'economia agricola e la biologia cellulare fondamentale. Pertanto, descriviamo un metodo di centrifugazione differenziale per estrarre le LD dalle BMEC e dal tessuto delle ghiandole mammarie. A differenza degli approcci convenzionali di isolamento LD in massa, questo protocollo consente l'arricchimento basato sulla dimensione delle sottopopolazioni LD aggiustando sequenzialmente le forze centrifughe. L'integrità e l'arricchimento relativo delle frazioni LD sono valutate preliminarmente utilizzando la colorazione BODIPY493/503, fornendo un approccio pratico e riproducibile per analisi a valle del metabolismo lipidico e dei processi associati alla LD.

Introduzione

Le gocce lipidiche (LD) sono organelli dinamici all'interno delle cellule che fungono da principali siti di stoccaggio per i lipidi^{neutri 1}. L'accumulo anomalo di LD è associato a una vasta gamma di malattie, che vanno oltre l'obesità includendo condizioni come fegato^{adiposo 2}, malattie^{cardiovascolari 3},^{diabete 4} e cancro⁵. Al contrario, un numero insufficiente di LD può avere conseguenze gravi, portando alla perdita delle riserve di energia cellulare e a conseguenti danni^{funzionali 6}. Nel contesto dell'economia agricola, l'insufficiente LD nei ruminanti può causare una secrezione insufficiente di grassi del latte, causando depressione dei grassi del latte, che a sua volta compromette il valore nutrizionale e la commerciabilità dei prodotti^{lattiero-caseari 7}. Attualmente, la regolazione del metabolismo della LD è emersa come un'area di ricerca significativa.

Lo sviluppo di tecniche di estrazione per i LD dal XX secolo ha costantemente mirato a estrarre i LD in quantità maggiori, con maggiore purezza e un'attività biologica meglio conservata. Ciò comporta l'istituzione e l'ottimizzazione continua di metodologie. Attualmente, diverse aziende hanno progettato kit commerciali per LD separation⁸. Sebbene questi kit riducano notevolmente il tempo di separazione e richiedano solo l'uso di centrifughe convenzionali, per campioni difficili da dissociare il reagente non può essere regolato ed è difficile ottimizzare le fasi del test. Inoltre, l'estrazione delle LD svolge un ruolo indispensabile nell'elucidare i meccanismi delle malattie, inclusi quelli delle malattie metaboliche come il fegato^{grasso 9}, il cancro¹⁰ e le malattie^{neurodegenerative 11}, fungendo da sonda multidimensionale per decifrare le vie patologiche. Le composizioni proteiche e lipidiche possono anche essere analizzate estraendo le LD per rivelare la diversità delle funzioni biologiche delle LD¹².

La formazione del grasso del latte non è semplicemente un processo di degradazione del substrato; piuttosto, rappresenta un processo altamente orchestrato di sintesi e confezionamento lipidico eseguito dalle cellule epiteliali mammarie. ¹³. La generazione di grasso latte nelle mucche da latte si basa sul meccanismo di secrezione della membrana apicale di queste cellule: i trigliceridi sintetizzati nel reticolo endoplasmatico formano LD citoplasmatici, che vengono poi trasportati alla membrana apicale e secreti tramite gemiola. Durante questo processo, i LD sono avvolti da una membrana a forma di globulo di grasso del latte derivata dalla membrana apicale, portando alla formazione di globuli di grasso del latte strutturalmente^{stabili 14}. La ghiandola mammaria bovina funge da modello classico per lo studio della lattazione nei mammiferi, e i meccanismi fondamentali che regolano la sintesi e la secrezione della LD sono altamente conservati^{nell'uomo 15}. Stabilire metodi per estrarre i LD sia dai BMEC che dal tessuto mammario può collegare la produzione di bestiame e la salute umana. Analisi proteomiche e lipidomiche delle LD estratte possono successivamente essere utilizzate per migliorare la produzione e la qualità del latte, garantendo sicurezza e protezione.

Il metodo attuale si basa principalmente sulla caratteristica a bassa densità delle LD, che le fa fluttuare fino alla cima del gradiente durante la^{centrifugazione 16}. La procedura di estrazione consiste in tre fasi principali: raccolta del campione, ultracentrifugazione per la flottazione LD e lavaggio LD. Il saccarosio (2,5 M) viene aggiunto al tampone per proteggere i LD, la velocità di centrifugazione viene poi regolata secondo i requisiti sperimentali; tipicamente, grandi LD possono essere arricchiti a forze inferiori a 10.000 x g, mentre velocità più elevate (sopra 10.000 x g) vengono impiegate per estrarre piccoli LD, poiché i LD più grandi possono rompersi in queste condizioni. Infine, le LD estratte subiscono più lavaggi per prevenire contaminazioni e la purezza dell'estrazione viene valutata preliminarmente tramite colorazione BODIPY493/503.

I metodi convenzionali di isolamento LD ottengono principalmente un recupero di massa di popolazioni eterogenee di LD, limitando l'analisi delle differenze strutturali e funzionali dipendenti dalla dimensione. L'attuale protocollo estende gli approcci standard consentendo l'arricchimento basato sulla dimensione delle sottopopolazioni di LD tramite centrifugazione differenziale sequenziale, facilitando l'indagine sulla crescita, il ricambio, il traffico intracellulare e l'utilizzo differenziale da parte di vie lipolitiche o autofagiche. Questo approccio ottiene l'arricchimento piuttosto che la purificazione assoluta, e può verificarsi una parziale sovrapposizione tra frazioni di dimensione a causa di distribuzioni continue di dimensioni e proprietà fisiche condivise.

Protocollo

Determinare la dimensione delle gocce lipidiche target per l'arricchimento (Figura 1).

1. Impostazione del reagente

1. PBS: Peso 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,58 g Na₂HPO₄·12H₂O e 0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL ddH₂O. Regolare il pH a 7,4 con HCl, mescolare bene e portare il volume a 1 L. Conservare a 4 °C fino a 1 anno dopo l'autoclav.
2. Saccarosio (2,5 M): Pesa 856 g di saccarosio e scioglilo in 400 mL di ddH₂O. Mescola accuratamente finché il saccarosio non si scioglie completamente, poi regola il volume a 1 L. Autoclave la soluzione e conserva a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
3. Tampone A: Pesa 1,79 g di Tricine e scioglilo in 400 mL di ddH₂O. Regola il pH a 7,8 con KOH. Dopo la regolazione del pH, aggiungi 50 mL di soluzione di saccarosio 2,5 M già preparata. Mescola accuratamente e regola il volume a 500 mL. Dopo l'autoclaviatura, il tampone può essere conservato a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
4. Buffer B: Pesa 0,95 g HEPES, 1,49 g KCl e 0,038 g MgCl₂·6H₂O separatamente in 180 mL ddH₂O. Regolare il pH a 7,4 con KOH, mescolare accuratamente e portare il volume a 200 mL. Dopo l'autoclav, conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
5. PMSF (1.000x, 0,2 M): Pesa 0,175 g di PMSF e scioglilo in 5 mL di DMSO. Conserva protetto dalla luce a -20 °C per un massimo di un anno.
   NOTA: La PMSF è altamente tossica; Devono essere adottate misure protettive adeguate. Durante la preparazione, assicurarsi una protezione completa dalla luce; Il PMSF è difficile da dissolvere e può essere allicitamente applicato in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.

2. Estrazione delle LD dalle cellule

1. Cultura BMEC
   1. Recupera cinque tubi di celle BMEC congelate dal frigorifero a -80 °C e scongelale rapidamente in un bagno d'acqua a 37 °C. Centrifuga i tubi a 250 x g per 4 min 30 s dopo lo scongelamento completo.
   2. Scartare il mezzo di crioconservazione con un pipettore, aggiungere 1 mL di FBS al 10% per risospendere le cellule, mescolare e aggiungere delicatamente le cellule a una ciotola di coltura cellulare da 100 mm contenente 6 mL di FBS al 10%. Dondolare delicatamente la ciotola per garantire una distribuzione cellulare uniforme e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂.
   3. Monitorare la morfologia cellulare al microscopio ed eseguire la subcultura quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80%–90%.
      NOTA: Garantire una condizione cellulare ottimale e un numero sufficiente di cellule prima dell'estrazione LD per migliorare la resa e la riproducibilità.
   4. Scartare il substrato di coltura originale nella piastra di Petri con una pipetta e aggiungere 1 mL PBS lungo la parete di ogni piattaforma. Dopo aver lavato due volte, aggiungi 1 mL di tripsina a ogni piatto e incuba a 37 °C per 3 minuti e 30 secondi.
   5. Osserva se le cellule sono completamente digerite al microscopio, aggiungi 1 mL di FBS al 10% per interrompere la digestione dopo che la digestione è completata. Sospezione delicata delle celle pipettando, trasferiscile in un tubo microcentrifuga da 2 mL e centrifuga a 250 x g per 4 min 30 s.
   6. Scartare il soprantantante e ripetere le procedure descritte nello Passo 1.2.
   7. Espandere le cellule utilizzando circa 30 vasi di coltura o recipienti di coltura più grandi, oppure utilizzare vasi di coltura più grandi per la coltura cellulare. Aggiungere 150 μmol/L di t10,c12-CLA (diluito in DMEM) per trattare le cellule la notte prima dell'estrazione. Usa 7 mL di mezzo per coltura per ogni piatto da 100 mm di coltura. Il tempo di coltura dipende dalla dimensione dei LD che devono essere separati.
      NOTA: Sulla base dell'ottimizzazione precedente, trattare i BMEC con t10,c12-CLA per 6 ore per arricchire grandi LD o per 12–24 ore per arricchire piccoli LD. Poiché le cellule contengono pochi LD, di solito vengono aggiunti acidi grassi esogeni per indurre l'accumulo di LD. In questo studio, si aggiungono t10,c12-CLA alle cellule coltivate per indurre l'accumulo di LD.
2. Raccolta di campioni
   1. Scarta il substrato originale, aggiungi 1 mL di PBS ghiacciato e lava 3 volte. Non scartare PBS durante il lavaggio finale. Usando come esempio 30 piatti di celle da 100 mm, raccogliendo celle ogni 10 piastre in un tubo centrifuga da 15 mL, ciascun tubo contiene circa 1x108, risultando in un totale di 3 tubi centrifughe.
      NOTA: Mantenere tutti i campioni a ≤4 °C durante tutto il processo di estrazione per prevenire la degradazione delle proteine nei LD.
   2. Dopo l'equilibrio, centrifugare a 1.000 x g, 4 °C per 10 minuti.
   3. Scartate il PBS. Aggiungere 10 mL di Buffer A pre-preparato e 10 μL di PMSF (1.000x, 0,2 M) al tubo della centrifuga. Mescola bene e incuba sul ghiaccio per 20 minuti.
3. Lisi cellulare e frazionamento iniziale
   1. Le cellule di disturbo utilizzando un omogeneizzatore ultrasonico di tipo sonda operano in cicli pulsati di 5 s ON e 10 s OFF, risultando in un tempo totale di sonicazione efficace di 10 minuti su un periodo di 30 minuti. Imposta lo strumento al 40% di potenza (corrispondente a un'ampiezza della sonda di circa 76 μm) utilizzando una sonda di diametro 3 mm.
      NOTA: Conserva i campioni in ghiaccio durante tutta la procedura per evitare il surriscaldamento.
   2. Centrifugare l'omogeneato a 3.000 x g e 4 °C per 10 minuti per rimuovere nuclei e detriti cellulari. Raccogli il soprantantante come il supernaante post-nucleare (PNS).
4. Ultracentrifugazione delle LD galleggianti
   1. Filtrare il soprantantante attraverso un filtro cellulare da 100 μm.
   2. Pipetta 10 mL di PNS in un tubo centrifuga da 15 mL. Aggiungere 2 mL di saccarosio (2,5 M) e 2 mL di Buffer B in sequenza sulla sommità del PNS (il volume di saccarosio può essere ridotto di conseguenza aumentando il volume del Buffer B per aumentare la purezza LD), e poi centrifugare per la prima volta (5.000 x g, 4 °C, 20 min).
   3. Dopo la centrifugazione, raccogli lo strato lattiginoso, simile a una crema, di LD nella parte superiore del tubo. Per raccogliere le LD, si aggiungono prima 100 μL di Buffer B a un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, poi si utilizza una pipetta da 20 μL per aspirare delicatamente lo strato LD galleggiante più volte, raccogliendo quante più LD possibile.
      NOTA: I LD formano uno strato crema fluttuante nella sommità; Evita di aspirare la soluzione sottostante il più possibile per evitare contaminazioni.
   4. Esegui una seconda centrifugazione (10.000 x g, 4 °C, 30 min) e raccogli i LD.
   5. Trasferire la soluzione in un tubo ultracentrifugo compatibile con un rotore a secchio oscillante, tapparlo e bilanciare i tubi. Esegui la terza centrifugazione in un'ultracentrifuga (50.000 x g, 4 °C, 40 min) e raccogli i LD.
      NOTA: Bilanciare con precisione i tubi (fino a 0,0001 g) per garantire un funzionamento sicuro dell'ultracentrifuga.
   6. Dopo l'equilibrio, eseguire la quarta centrifugazione (150.000 x g, 4 °C, 50 min) per continuare a raccogliere i LD. Ottimizzare velocità e durata in base alla dimensione target del LD.
      NOTA: Centrifugazioni prolungate o ripetute ad alta velocità possono disturbare i LD. Al contrario, la centrifugazione a breve durata a 10.000 x g durante il lavaggio rimuove principalmente impurità e ha un impatto minimo sull'integrità della LD. Questo metodo è adattabile; L'ottimizzazione può essere necessaria per diversi tipi cellulari o tessuti.
5. Lavare i LD
   1. Sospendere i LD raccolti nel tampone B freddo e centrifugare a 10.000 g e 4 °C per 5 minuti.
   2. Rimuovere con attenzione il surnante e ripetere il passaggio di lavaggio almeno quattro volte utilizzando lo stesso volume di tamponamento, forza centrifuga e tempo di centrifugazione. Per i piccoli LD, aumentare la forza centrifuga secondo necessità per garantire una separazione efficiente.
   3. Dopo il lavaggio finale, raccogli le frazioni LD, mescola delicatamente e conserva a −80 °C.
      NOTA: Non omettere i passaggi di lavaggio, anche se una certa perdita di lucido lucido è inevitabile. Continua a lavare finché non rimangono detriti visibili della membrana.

3. Estrazione di LD dai tessuti

1. Raccolta di campioni
   1. Prelevare campioni di tessuto mammario bovino dall'azoto liquido. Pesa 5 g di fazzoletto e scongelalo sul ghiaccio finché non restano più cristalli di ghiaccio.
   2. Risciacquo il tessuto con PBS o soluzione fisiologica.
   3. Trita il tessuto in pezzi di 1-2 mm usando forbici chirurgiche.
   4. Trasferire il tessuto tritato in un mortaio pre-raffreddato contenente 12 mL di Buffer A e 10 μL di PMSF (1.000x, 0,2 M). Macinare la miscela sul ghiaccio per circa 10 minuti.
   5. Incuba l'omogeneato sul ghiaccio per 20 minuti.
   6. Dopo una buona macinazione, raccogliere l'omogeneato in un tubo centrifuga da 15 mL.
   7. Centrifuga a 2.500 x g, 4 °C per 10 minuti. Il surnadante risultante è la PNS.
2. Ultracentrifugazione delle LD galleggianti
   1. Filtrare il soprantantante attraverso un filtro cellulare da 100 μm.
   2. Pipetta 10 mL di PNS in un tubo centrifuga da 15 mL. Aggiungi 2 mL di saccarosio e 2 mL di Buffer B in sequenza. Esegui la prima centrifugazione (4.000 x g, 4 °C, 20 minuti). Raccogli il materiale lattiginoso, simile a una crema.
   3. Esegui una seconda centrifugazione (7.000 x g, 4 °C, 30 min) e raccogli i LD.
   4. Esegui una terza centrifugazione (10.000 x g, 4 °C, 40 min) e raccogli i LD.
   5. Trasferire il soprantantante su un tubo SW40 ed eseguire l'ultracentrifugazione (50.000 x g, 4 °C, 50 min). Raccogli i LD.
   6. Eseguire una quinta centrifugazione (100.000 x g, 4 °C, 60 min). Raccogli i LD.
3. Lavare i LD
   Consulta il metodo di lavaggio per i LD estratti dalle cellule.

4. Validazione preliminare della purezza del LD tramite colorazione

1. Preparare in anticipo una soluzione di colorante fluorescente a lipidi neutri da 10 μg/mL in condizioni di protezione dalla luce (BODIPY: Buffer B = 1:100, V/V).
2. Aggiungi una quantità adeguata di LD misti e il Buffer B in un tubo per microcentrifuga. In condizioni di protezione dalla luce, aggiungere una quantità adeguata di soluzione di colorante fluorescente a lipidi neutri. Mescola bene e incuba per 10 minuti.
3. Prepara un vetrino pulito per il microscopio. Distribuire 2,5 μL della miscela sul coperchio. Posiziona delicatamente il vetrino sopra la miscela, evitando bolle d'aria. Osserva con un microscopio a fluorescenza rovesciata.

5. Validazione della purezza del LD tramite Western blot

1. La concentrazione proteica delle frazioni LD è stata misurata utilizzando un kit di analisi proteica BCA.
2. Per l'analisi Western blot, miscela 20 μg di proteina da ogni campione con 5x SDS loading cushioner e riscalda a 99 °C per 10 minuti per garantire una completa denaturazione.
3. Successivamente, si separano le proteine tramite SDS–PAGE su gel di poliacrilammide a gradiente al 10% in base ai loro pesi molecolari.
4. Dopo l'elettroforesi, trasferire le proteine su membrane PVDF preattivate, poi bloccare con il 5% di BSA a temperatura ambiente per 1,5 ore. Successivamente, incubo le membrane durante la notte a 4 °C con anticorpi primari, tra cui anti-Perilipina 2 per conigli (1:500) e anti-β-actina per coniglio (1:5000).
5. Lavare le membrane tre volte con 1 TBST per 10 minuti ciascuno, poi incubare con l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato con HRP (1:5000) per 1,5 ore a temperatura ambiente.
6. Dopo tre lavaggi aggiuntivi con TBST, rilevare le bande proteiche utilizzando un kit di chemiluminescenza avanzata (ECL) e visualizzare con un sistema di imaging in gel.

6. Punti di pausa e linee guida per lo stoccaggio

1. Tieni il PNS sul ghiaccio per un massimo di 1–2 ore prima dell'ultracentrifugazione.
2. Tieni i LD raccolti sul ghiaccio per 1–2 ore prima di lavarli. Per la conservazione a breve termine, conservare le LD a 4 °C per un massimo di 24 ore. Per la conservazione a lungo termine, conservare i cicli di congelamento e scongelamento a non più di uno per preservare l'integrità del LD.
3. Durante tutte le pause sperimentali, mantenere i campioni sul ghiaccio con i tappi dei tubi chiusi per minimizzare la contaminazione.

7. Risoluzione dei problemi

1. Strato sottile galleggiante: regola il volume del tampone o la forza di centrifugazione.
2. Scarsa galleggiamento: aumenta la velocità di centrifugazione o estendi il tempo.
3. Contaminazione: assicurarsi una manipolazione sterile e buffer filtrati.
4. Rottura del LD: tieni i campioni sul ghiaccio, riduci la forza di centrifugazione o risospendi delicatamente.

Risultati

Flusso di lavoro e quadro metodologico
È stato stabilito uno schema a albero decisionale (Figura 1) per guidare la selezione delle condizioni di centrifugazione secondo gli obiettivi sperimentali. In particolare, forze centrifughe ≤10.000 x g venivano utilizzate per arricchire grandi LD (≥2 μm), mentre forze >10.000 x g venivano applicate per arricchire piccoli LD (<1 μm). Questo quadro fornisce una base pratica per otte...

Discussione

I LD sono organelli unici caratterizzati da un nucleo lipidico neutro racchiuso da uno strato monostrato fosfolipidico. Germogliano dal reticolo endoplasmatico e cambiano dinamicamente dimensione e numero, facilitando il trasporto intracellulare e una comunicazione estesa con altre strutture subcellulari per coordinare l'omeostasi lipidica^cellulare 17,18,19. Questo comportamento dinamico è ulter...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina-EDTA	Gibco	25200072	reagente
Kit di preparazione rapida gel 10% PAGE	Beijing BIOMAN	PG112	reagente
100 & mu; Filtro per cellule M	Beyotime	FSTR100	reagente
Antro di coltura cellulare da 100 mm	Corning	490167	reagente
Amersham Imager 600	GE Scienze della Vita per la Salute	600	Equipaggiamento
Autoclave	Panasonic	MLS-3751L	Equipaggiamento
Kit per il test proteico BCA	Pechino Dingguo.	BCA01	reagente
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	reagente
Centrifuga	Eppendorf		Equipaggiamento
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagente
DMSO	Solarbio	D8370	reagente
Siero bovino fetale	Gibco	2492319	reagente
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	reagente
Anticorpo secondario anti-coniglio AffiniPure coniugato con HRP	Proteintech	SA00001-2	reagente
KCl	HUSHI	20030666	reagente
KH2PO4	HUSHI	10017608	reagente
MgCl2	HUSHI	20059028	reagente
Na2HPO4· 12H2O	HUSHI	S112623	reagente
NaCl	HUSHI	10019328	reagente
Buffer Omni-Easy per Caricamento Istantaneo di Proteine	Tecnologia Biomedica dell'Epizima di Shanghai	LT101S	reagente
Kit di rilevamento della chemiluminescenza ultra-sensibile Omni-ECL	Tecnologia Biomedica dell'Epizima di Shanghai	SQ201	reagente
PBS	HyClone	SH30256.01	reagente
Penicillina & Streptomicina 100 e più volte;	NCM Biotech	CLOOC5	reagente
Misuratore di pH	METTLER TOLEDO	S220K	Equipaggiamento
Pipetta	Eppendorf		Equipaggiamento
PMSF	Coolaber	CP8651	reagente
Kit di trasferimento a membrana PVDF	GenScript	eBlot L1	reagente
Rabbit anti-Perilipina 2	Abcam	15294-1-AP	reagente
Coniglio anti-β-actin	Proteintech	20536-1-AP	reagente
Microscopio a fluorescenza invertita di grado di ricerca	Olympus	IX73	Equipaggiamento
Sucrosio	Solarbio	S8271	reagente
Rotore SW 40 Ti	BECKMAN COULTER	331301	Equipaggiamento
Trans-10, cis-12 acido linoleico coniugato	CAYMAN	90145	reagente
Tricine	Coolaber	CT11331	reagente
Ultracentrifuga	BECKMAN COULTER	Optima XE-100	Equipaggiamento
Frantumatore a celle a ultrasuoni	SCIENTZ	JY92-11N	Equipaggiamento