Lattilazione della lisina specifica per sito tramite espansione del codice genetico in E. coli e nelle cellule di mammiferi

Sommario

Questo studio ha stabilito un metodo che utilizza l'espansione del codice genetico per incorporare con successo la lattil-lisina (Klac) in siti specifici dell'enolasi-1 umana (hENO1) e della GFP superfolder (sfGFP) in Escherichia coli e cellule di mammiferi.

Abstract

La lattilazione è una modifica post-traduzionale (PTM) recentemente scoperta con funzioni biologiche diverse. Dalla sua identificazione iniziale nel 2019 come regolatore della polarizzazione dei macrofagi, la lattilazione degli istoni è emersa come un collegamento fondamentale che collega il metabolismo cellulare alla regolazione funzionale. Biochimicamente, comporta il trasferimento covalente di un gruppo lattilico ai residui di lisina, mediato sia da lattiltransferasi che utilizzano lattil-CoA come donatore di acil, sia da sintetasi di aminoacil-tRNA (AARS) tramite un intermediario lattil-AMP. Attraverso questi meccanismi, i livelli intracellulari di lattato sono direttamente collegati alla modifica e alla funzione delle proteine. La lattilazione media una serie di processi cellulari critici, dalle funzioni fisiologiche come la regolazione genica, la riparazione del DNA, la riprogrammazione metabolica e la modulazione immunitaria, fino a processi patologici come la progressione tumorale e la metastasi. Nonostante l'identificazione di numerosi siti di lattilazione da parte della proteomica, ottenere la lattilazione della lisina specifica per sito tramite mutagenesi rimane una sfida. Per affrontare questo problema, utilizziamo la tecnologia di espansione del codice genetico, utilizzando una sintetasi specifica per aminoacil-lisina-lattilina (KlacRS) e il suo tRNA affine per incorporare con precisione la lattil-lisina (Klac) nei residui designati. Questa strategia consente la generazione di varianti proteiche omogeneamente lattilate per studi funzionali diretti. Qui descriviamo un protocollo semplificato per la lattilazione proteica site-specific, validato sia in Escherichia coli (E. coli) sia in cellule di mammiferi, utilizzando enolasi-1 umana (hENO1) e superfolder GFP (sfGFP) come sistemi modello.

Introduzione

La lattilazione della lisina (Klac), originariamente identificata sugli istoni, è emersa come un nodo chiave che collega il metabolismo tumorale aberrante alla regolazione^{epigenetica 1}. L'accumulo di lattato derivante dall'aumento della glicolisi aerobica nelle cellule tumorali fornisce una base metabolica per la lattilazione, permettendo al lattato di agire non solo come sottoprodotto metabolico, ma anche come molecola di segnalazione che modula direttamente la funzione proteica. Evidenze crescenti indicano che la lattilazione partecipa ampiamente all'inizio e alla progressione tumorale coordinando la proliferazione delle cellule^tumorali 2,3,4,5, la metastasi⁶, la riprogrammazione^{metabolica 7} e la resistenza terapeutica ^8,9.

A livello fenotipico, una lattilazione elevata è strettamente associata a un aumento dell'aggressività tumorale. Ad esempio, nel carcinoma a cellule renali a cellule chiare (ccRCC), la lattilazione di H3K18 favorisce proliferazione e metastasi regolando al rialzo il recettore dei fattori di crescita derivati dalle piastrine β (PDGFRβ), stabilendo un circuito di retroazione positiva tra l'accumulo di lattato e la segnalazione^{oncogenica 10}. Analogamente, nel cancro colorettale (CRC), una lattilazione elevata di H3K18 guida la progressione tumorale tramite una trascrizione potenziata dell'autofagia simile a Rubicon (RUBCNL), favorendo così la maturazione dell'autofagosoma e supportando la sopravvivenza delle cellule^{tumorali 11}.

Oltre agli effetti diretti sull'aggressività tumorale, la lattilazione media anche la riprogrammazione metabolica tumorale modulando l'espressione e l'attività dei geni correlati al^{metabolismo 7}. Nel cancro ai polmoni non a piccole cellule (NSCLC), la lattilazione degli istoni riduce la regolazione degli enzimi correlati alla glicolisi mentre aumenta gli enzimi del ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA), aumentando l'assorbimento del glucosio nelle cellule tumorali e aggravando la disregolazione^{metabolica 12}. Costantemente, il profiling globale del lattiloma rivela che la lattilazione prende di mira preferenzialmente gli enzimi coinvolti nelle vie metaboliche centrali, tra cui metabolismo del glucosio, ciclo del TCA, metabolismo degli amminoacidi/acidi grassi, e queste modifiche sono fortemente correlate con fenotipi tumorali^{aggressivi 7}.

È importante sottolineare che le conseguenze biologiche della lattilazione sono fortemente dipendenti dal sito, e questa modifica è emersa come un fattore chiave per la resistenza terapeutica tumorale. Nel CRC, la lattilazione K673 della ricombinazione meiotica 11 (MRE11) migliora la riparazione della ricombinazione omologa (HR), conferendo così resistenza alla chemioterapia e agli inibitori della poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP^{) 13}. Nel glioblastoma (GBM), l'interazione tra la famiglia A3 (ALDH1A3) dell'aldeide deidrogenasi 1 e la piruvato chinasi M2 (PKM2) aumenta la produzione di lattato, inducendo successivamente la lattilazione K247 della proteina complementare incrociata 1 (XRCC1) per migliorare la riparazione del danno al DNA, favorendo così la radioresistenza e la chemioresistenza alla temozolomide (^{TMZ) 14}. Questi studi evidenziano collettivamente che un controllo preciso della lattilazione a residui definiti di lisina è essenziale per la dissezione meccanicistica e il targeting terapeutico.

I progressi nella spettrometria di massa ad alta risoluzione hanno rivelato una diffusa lattilazione tra enzimi metabolici, fattori di trascrizione e trasduttori di segnalazione, sottolineando il suo ruolo ampio nel controllo del metabolismo, della trasduzione del segnale e della fisiologia^cellulare 15,16,17,18. Ad oggi, sono stati segnalati diversi enzimi scrittori che catalizzano la lattilazione - ad esempio, AARS1 media la lattilazione p53 per promuovere la^{tumorigenesi 19}, e AARS1/2 regola la lattilazione cGAS per sopprimere l'immunità innata - eppure questi enzimi sono selettivi dal substrato e attualmente non possono raggiungere una lattilazione completamente site-specific su proteine^{arbitrarie 20}. Pertanto, il campo rimane sfidato su come manipolare Klac in modo diretto per scopi di ricerca o terapeutici.

Gli studi funzionali si basano ancora prevalentemente sulla mutagenesi guidata dal sito - tipicamente sostituendo una lisina (K) con la glutamina (Q) per imitare lo stato non carico delle modifiche acil-lisina come l'acetilazione o la lattilazione 21,22,23,24. Tuttavia, questo approccio presenta limitazioni significative nel ricapitolare fedelmente la lattilazione nativa: la struttura chimica e la geometria della catena laterale della glutamina differiscono da quelle di una lisina lattilata e, cosa importante, una sostituzione K a Q non può distinguere tra stati acetilati e lattilato quando entrambe le modifiche potrebbero verificarsi nello stesso sito.

L'espansione del codice genetico (GCE) offre una potente soluzione a queste limitazioni permettendo l'incorporazione diretta di amminoacidi non canonici nelle proteine in siti definiti. Attraverso uno screening positivo di una biblioteca mutante Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetasi (MmPylRS), abbiamo precedentemente identificato una variante che mostra una crescita dipendente da Klac. Questo mutante, con le mutazioni L301M, Y306L, L309A e C348F, fu designato KlacRS1^25,26. KlacRS1 aminoacila il suo tRNA ortogonale cognato con Klac, sopprime il codone ococcioso ambrato e consente un'incorporazione efficiente e site-specific di Klac nelle proteine bersaglio. Oltre al KlacRS1, sono state segnalate diverse altre varianti di aaRS capaci di incorporazione Klac, tra cui il LacKRS derivato da MbPylRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) e il LacKRS3 (Y271M/C313S^)19,27, oltre a un LacKRS (C348T/Y384F)28 derivato da Mm ^PylRS. Insieme, questi strumenti costituiscono un kit genetico versatile per produrre varianti proteiche lattilate site-specific, al fine di comprendere le conseguenze biologiche degli eventi di lattilazione individuali.

Nei nostri studi precedenti, abbiamo applicato questo sistema basato su GCE per esprimere proteine ALDOA portanti lattilazione site-specific a Lys147 sia in cellule di E. coli che in cellule di mammiferi. Le analisi funzionali hanno dimostrato che la lattilazione a Lys147 esercita un effetto di retroazione negativa sulla glicolisi, migliora la stabilità termica e chimica di ALDOA e ne promuove la traslocazione dal citoplasma al nucleo. Questi risultati non solo hanno rivelato un meccanismo regolatorio precedentemente non riconosciuto di ALDOA, ma hanno anche convalidato la robustezza, la versatilità e l'utilità pratica di questa piattaforma di lattilazione^{site-specific 25,26}. Partendo da queste fondamenta, qui utilizziamo l'enolasi-1 umana (hENO1) e la superfolder GFP (sfGFP) come esempi rappresentativi per descrivere una strategia semplificata per l'incorporazione precisa dei Klac utilizzando il nostro sistema ortogonale KlacRS/tRNA.

Protocollo

1. Mutagenesi del codone dell'ambra stop per la codifica genetica della lattillisina nel gene bersaglio

1. Introdurre un codone di stop ambra TAG nella posizione 89 del gene hENO1 e nella posizione 149 del genes fGFP tramite mutagenesi guidata dal sito seguendo il protocollo del produttore, purificare il prodotto PCR ed eseguire la ricombinazione omologa. Usa i seguenti primer:
   ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
   ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTTGTGTGACGTTCAGTTTCTTG
   sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
   sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATACTCCAGC
   NOTA: Per l'incorporazione specifica del sito di lisina lattilata, il sito bersaglio dovrebbe essere mutato in un codone oclusivo ambrato (TAG), o in altri codoni insensati, e TAA o TGA dovrebbero essere usati come veri codoni di scatto.
2. Scongelare le cellule competenti DH5α su ghiaccio, mescolare 5 μL del prodotto di ricombinazione con 50 μL di cellule e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Sottoponi la miscela a uno shock termico di 45 secondi a 42 °C, poi mettila sul ghiaccio per 2-3 minuti. Aggiungere 350 μL di LB di mezzo e incubare a 37 °C con agitazione (220 giri al minuto) per 1 ora.
3. Distribuire le cellule su una piastra LB preriscaldata contenente ampicillina e incubare a 37 °C per 12-16 ore. Scegli due colonie singole per il sequenziamento Sanger per confermare la mutazione.

2. Espressione di proteine lattilate nelle cellule di E. coli

1. Co-trasformare 50 μL di cellule chimicamente competenti di E. coli DH10B con circa 100 ng ciascuna di pBad-ENO1-K89TAG, che codifica il gene bersaglio, e pEvol-MmKlacRS1 (plasmide Addgene # 232157), che codifica la coppia KlacRS e tRNA.
2. Incubare la miscela sul ghiaccio per 25 minuti, fare shock termico a 42 °C per 45 secondi e poi tornare sul ghiaccio per 3 minuti. Aggiungi 350 μL di LB medium a temperatura ambiente, agita energicamente a 220 giri/min per 1 ora a 37 °C.
3. Distribuire la coltura cellulare su una LB/piastra integrata con 100 μg/mL di Ampicillina (Amp₁₀₀) e 50 μg/mL di Cloranfenicolo (Cm₅₀). Incubare le placche a 37 °C per 12-16 ore.
4. Scegli una singola colonia per inoculare una coltura iniziale da 4 mL e incuba durante la notte. Il giorno successivo, espandi la coltura notturna a 400 mL di LB/_{ampere 100}cm₅₀ e poi agita vigorosamente a 220 giri/min, 37 °C finché il diametro 600 raggiunge 0,6-0,8.
5. Indurre con 0,2% di L-arabinosio e 1 mM Klac; incubare a 30 °C, 220 giri/min per ulteriori 16 ore.

3. Codifica genetica della lattilistina nelle cellule HEK 293T

1. Cellule seme in piastre a 12 pozzi a una densità di 1 x 10,⁵ celle per pozzo con 1 mL di mezzo DMEM. Dopo 24 ore di incubazione, quando la confluenza cellulare raggiunge il 70%-80%, esegui la trasfezione.
   NOTA: È raccomandata una confluenza del 70%-80% per la trasfezione, mentre i saggi di formazione delle colonie richiedono densità di semina più basse, che devono essere determinate empiricamente.
2. Per preparare una soluzione di DNA diluita, aggiungere 0,75 μg di pcDNA-sfGFP-N149TAG e pNeu-KlacRS (plasmide Addgene # 232155) in un rapporto 1:1 in 38 μL di DMEM siero con alto livello di glucosio. Pipetta delicatamente su e giù o vortice brevemente per mescolare.
3. Per preparare il reagente di trasfezione diluito, aggiungere 2,25 μL di reagente di trasfezione in 38 μL di DMEM senza siero con alto livello di glucosio. Pipetta delicatamente su e giù 3 volte o 4 volte per mescolare.
   NOTA: La possibilità di utilizzare Opti-MEM dipende dalle istruzioni del produttore, poiché il suo contenuto sirico può interferire con l'efficienza della trasfezione.
4. Aggiungi immediatamente il reagente di trasfezione diluito alla soluzione di DNA diluita tutto in una volta.
   NOTA: Non mescolare le soluzioni in ordine inverso.
5. Immediatamente pipetta su e giù 3x-4x o vortice per un breve periodo per mescolare. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente per permettere la formazione di complessi di trasfezione/DNA.
   NOTA: Il complesso di trasfezione/DNA deve essere utilizzato entro 20 minuti dalla preparazione.
6. Aggiungi la miscela da 50 μL per trasfezione/DNA goccia a goccia sul mezzo in ogni pozzetto e omogeneizza la miscela facendo ruotare delicatamente la piastra in rotola.
7. A 6 ore dopo la trasfezione, sostituire il mezzo con un DMEM fresco contenente 1 mM Klac. Coltura per 24-48 ore.
   NOTA: Sulla base dei nostri dati precedenti, Klac a concentrazioni di 1-5 mM non ha mostrato effetti citotossici sulle^{cellule 26}. La concentrazione operativa di Klac dovrebbe essere ottimizzata in base al livello di espressione proteica. Se la proteina bersaglio è soggetta alla perdita della modifica della lattilazione, si raccomanda la somministrazione di inibitori HDAC (ad esempio, Trichostatina A) o dell'inibitore della sirtuina NAM (nicotinamide).

4. Purificazione con His-tag della proteina lattilata nelle cellule di E. coli

1. Prelevare le celle tramite centrifugazione a 6.900 x g per 10 minuti a 4 °C. Risospendere in 50 mL di tampone per la lisi (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl). Lisare tramite ultrasonicazione su ghiaccio per un impulso di 3 secondi, intervallo di 8 secondi a 200 W per 30 minuti. Centrifugare a 13.800 x g, 4 °C per 30 minuti e poi raccogliere il soprandante.
   NOTA: Se la proteina bersaglio è suscettibile al taglio meccanico, il passaggio ultrasonico può essere sostituito con la lisi cellulare delicata utilizzando un reagente di estrazione proteica formulato adatto a E. coli.
2. Filtrare il soprandanante attraverso una membrana di 0,45 μm per raccogliere le frazioni solubili. Carica i lisati chiarificati su una colonna gravitazionale Ni-NTA da 1 mL. Lavare con circa 5 mL di Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl,
   5 mM imidazolo) fino a quando non viene trovata alcuna proteina rilevabile nell'eluato. Eludi la proteina con 1 mL di Buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 200 mM imidazolo) per 5 volte. Salva tutte le frazioni. Controlla la presenza di proteine eluate con un rapido test di Bradford.
3. Combinare le frazioni proteiche purificate ed eseguire lo scambio di tampone nel tampone di stoccaggio (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Aliquota le proteine concentrate in 50 μL in ogni provetta, congela rapidamente e conserva a -80 °C per la seguente analisi.

5. Caratterizzazione biochimica della proteina lattilata

1. SDS-PAGE e Western Blotting
   1. Separare la proteina tramite SDS-PAGE (90 V per 20 minuti, poi 150 V per 50 minuti). Tingi il gel con Coomassie Blue, riscalda per 15 secondi in un microonde e detelo con una soluzione anticolorante (40% etanolo assoluto, 10% acido acetico glaciale e acqua deionizzata al 50%) su uno shaker (50 rpm, 15 min). Ripeti il passaggio di destaining finché le bande proteiche non sono chiaramente visibili.
   2. Attiva una membrana PVDF nel metanolo per 1 minuto. Assembla la pila di trasferimento nell'ordine: spugna, carta filtrante, gel, membrana, carta filtrante, spugna. Effettuare il trasferimento a 250 mA per 1 ora in un tampone pre-raffreddato. Blocca la membrana con latte scremato al 5% per 1,5 ore, poi lava 3 volte con TBST (10 min ciascuno).
   3. Incubare con anticorpi primari (Anti-His 1:10.000; Anti-L-Lattilica Lisina 1:1.000) a 4 °C durante la notte. Lava 3 volte con TBST.
      NOTA: I rapporti ottimali di diluizione devono essere determinati empiricamente per gli anticorpi ottenuti da diverse fonti commerciali.
   4. Incubare con anticorpo secondario del coniglio (1:10.000) per 1,5 ore a temperatura ambiente. Lava 3 volte con TBST. Immagine usando la chemiluminescenza e salvata i dati in Image Lab.
2. Analisi della spettrometria di massa
   1. Per un'analisi di massa intatta, si diluiscono le proteine a una concentrazione finale di 0,1 μg/μL con acqua contenente acido formico (FA) allo 0,1% e poi si sottopongono a un sistema di cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). La fase mobile era composta dal solvente A (0,1% FA in acqua) e dal solvente B (acetonitrile, ACN) a una portata di 0,3 mL/min.
   2. Misurare i pesi molecolari di hENO1-89Klac utilizzando uno spettrometro di massa quadrupole-time-of-flight (Q-TOF) ad alta risoluzione con l'intervallo m/z impostato tra 300-2000. Raccogli ed elabora tutti i dati utilizzando il software MassLynx.
   3. Per l'analisi proteomica, si analizzano i lisati cellulari digeriti come descritto in precedenza, utilizzando un sistema di cromatografia liquida a nano-flusso accoppiato a uno spettrometro di massa tribride ad alta risoluzione dotato di un analizzatore. La fase mobile era composta dal solvente A (0,1% FA in acqua) e dal solvente B (ACN/acqua, 8:2, v/v) a una portata di 300 nL/min.
   4. Separati peptidi su una colonna capillare C18 in fase inversa (75 μm x 250 mm) con un gradiente di 90 minuti: 3%-8% B (0-5 min), 8%-28% B (5-60 min), 28%-38% B (60-75 min), 38%-100% B (75-80 min) e 100% B (80-90 min). Acquisire spettri MS1 su m/z 350-1800 con una risoluzione di 120.000 e un obiettivo AGC di 4e5. Generare spettri MS2 tramite frammentazione da dissociazione collisionale (HCD) ad energia più alta (energia di collisione = 32%), con una prima massa di m/z 110, una risoluzione di 30.000 e un obiettivo AGC di 5e4.
3. Analisi della citometria a flusso
   1. Lava le celle 2 volte con un buffer PBS pre-raffreddato, seguito da centrifugazione a 1.380 x g per 3 minuti dopo ogni lavaggio. Risospendere la granula cellulare ottenuta dopo centrifugazione in 500 μL di tampone PBS e pipettare delicatamente per mescolare. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una garza sterile da 300 maglie, raccogliere il filtrato in un tubo di citometria a flusso per minimizzare le interferenze degli aggregati cellulari durante la rilevazione. Analizzare il campione preparato utilizzando un citometro a flusso con laser doppi, con eccitazione a 405 nm e rilevamento a 488 nm per i corrispondenti segnali di fluorescenza.

Risultati

Abbiamo innanzitutto valutato la specificità di incorporazione di Klac nelle proteine di E. coli. Il gene per l'enolasi umana 1 (hENO1) è stato progettato per contenere un codone oclusivo ambrato nel residuo K89 (hENO1-89TAG), e questo costrutto è stato co-espresso con il KlacRS ortogonale e la sua coppia di tRNA affini in E. coli. In assenza di integrazione di 1 mM di Klac, non è stata rilevata una hENO1 a tutta lunghezza; al contrario, quando 1 mM di Klac veniva aggiunto al mezzo di crescita,...

Discussione

Qui descriviamo una strategia per l'incorporazione site-specific di Klac nelle proteine sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche. Introducendo un codone di oclusione ambra nella posizione desiderata del gene bersaglio e co-esprimendolo con la coppia ortogonale KlacRS/tRNA nelle cellule ospiti, la litil-lattilica autentica può essere incorporata con precisione nelle proteine delle cellule viventi, fornendo uno strumento potente per sondare la biologia specifica della lat...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
6*his ,Il suo tag Anticorpo monoclonale ricombinante	Proteintech	84814-1-RR	Una classe di immunoglobuline specifiche che mirano al 6 e volte Il suo tag (un peptide corto composto da sei residui di istidina consecutivi, HHHHHH) nelle proteine ricombinanti.
Sistema ACQUITY UPLC	Acque		Cromatografia liquida UltraPerformance
Mab del coniglio anti-L-L-Lattilsilina	PTM Biolabs	PTM-1401RM	Una classe specifica di immunoglobuline che mirano alla L-Lattila Lisina (Klac), una modifica post-traduzionale (PTM) delle proteine.
Kit di clonazione a un solo passo ClonExpress II	Vazyme	C112	Basandosi su una tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità del DNA semplice, rapida ed efficiente, i frammenti inseriti possono essere clonati direzionalmente in qualsiasi sito di qualsiasi vettore.
Citometro a flusso CytoFlex	Beckmann Coulter		Citometro di flusso con rilevamento ad alta sensibilità e capacità di analisi multicolore
DH10B	Biorabbit	EC005H-S	Un tipo di cellule competenti per la trasformazione dei plasmidi, la clonazione genica e lo screening bianco-blu.
DH5 e Alpha;	Vazyme	C502	Un tipo di cellule competenti per la trasformazione dei plasmidi, la clonazione genica e lo screening bianco-blu.
Sistema EASY-nano LC 1200	Thermo Fisher Scientific		Cromatografia nano-liquida per separare campioni complessi ad alta sensibilità e alta risoluzione
Spettrometro di massa Orbitrap Eclipse Tribrid	Thermo Fisher Scientific		un sistema di ammirante di fascia alta per cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS) di fascia alta in tribrid
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polimerasi	Vazyme	P505	Un singolo enzima ad alta fedeltà che combina amplificazione rapida e fedeltà
PolyJet	SignaGen	SL100688	Il reagente di tranfezione in vitro per DNA in vitro PolyJet è formulato come un potente reagente per la trasfezione che garantisce una trasfezione efficace e riproducibile con minore citotossicità.