Articolo metodologico

Modello di ratto canulato con dotto linfatico cervicale per la valutazione del trasporto linfatico dalla testa e dal cervello

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DOI:

10.3791/70217

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10 marzo 2026

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1State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, 2MOE Joint International Research Laboratory of Target Discovery and New Drug Innovation, China Pharmaceutical University, 3Department of Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo sperimentale dimostra un modello di ratto canulato con canulazione del dotto linfático cervicale profondo che consente una valutazione diretta e quantitativa del drenaggio linfatico dalla regione della testa. Il modello facilita un'analisi dettagliata dei soluti derivati dal sistema nervoso centrale (SNC), delle popolazioni di cellule immunitarie e della distribuzione e eliminazione di terapie mirate al SNC.

Abstract

La linfa fluisce dal sistema nervoso centrale (SNC) attraverso una serie di vasi linfatici (LV) e linfonodi che convergono nei dotti linfici cervicali. Oltre a mantenere l'equilibrio dei fluidi, questi dotti linfatici svolgono un ruolo chiave nel trasporto di una vasta gamma di sostanze, inclusi metaboliti endogeni, molecole di segnalazione, cellule immunitarie e farmaci piccoli e macromolecolari. Questo è fondamentale per l'omeostasi fisiologica e la funzione immunitaria sia nelle regioni intracraniche (ad esempio, cervello) che extracraniche (ad esempio, nelle cavità nasale e orale). Il drenaggio linfatico compromesso dal cervello è stato sempre più collegato a una serie di disturbi neurologici e neurodegenerativi. La canulazione dei dotti linfici cervicali consente la raccolta di linfa che drena la testa e il cervello, consentendo la misurazione della concentrazione e del tasso di trasporto di varie sostanze attraverso il sistema linfatico. Si possono anche individuare cambiamenti in questi fattori in risposta a diverse sfide (ad esempio, farmaci, stress, traumi) e malattie (ad esempio, ictus, infezioni, morbo di Alzheimer). Qui descriviamo un modello anestetizzato di ratto canulato con canulatura profonda del dotto linfatico cervicale che consente la raccolta della linfa per diverse ore dopo l'intervento. Il metodo può essere combinato con tecnologie di imaging e multi-omiche per la misurazione di un'ampia gamma di parametri di interesse nella linfa. Ciò facilita la ricerca fisiologica e patofisiologica fondamentale sulla regione della testa e del collo, così come studi farmacocinetici/farmacodinamici di farmaci, in particolare per il trattamento delle malattie del SNC.

Introduzione

Il sistema linfatico, distribuito in tutto il corpo, è essenziale per mantenere l'omeostasi dei fluidi, regolare le risposte immunitarie e facilitare il trasporto di nutrienti e molecole disegnalazione 1. I linfomatici periferici iniziano nei capillari linfatici, che raccolgono liquidi interstiziali e soluti e drenano in vasi linfattici collettori (LV) più grandi che possiedono uno strato muscolare liscio circostante; questi vasi quindi convogliano la linfa ai linfonodi locali per l'elaborazioneimmunitaria 2,3. La rete linfatica che drena la regione della testa è importante per l'omeostasi sia degli organi intracranici (ad esempio, cervello) che extracranici (ad esempio, le cavità nasale e orale). Si ritiene che la struttura e l'organizzazione della rete linfatica extracranica assomiglino a quelle dei linfatti periferici in tutto il corpo, mentre il sistema linfatico intracranico presenta caratteristiche anatomiche e funzionali uniche (vedi Figura 1 per una rappresentazione schematica dettagliata nei modelli di ratto)4,5. Sebbene le tipiche LV siano assenti all'interno del parenchima cerebrale, le funzioni simili a quelle linfatiche sono mediate dal sistema specializzato di trasporto linfatico gliale dipendente (glymphatico) che facilita lo scambio tra liquido cerebrospinale (LCR) e liquido interstiziale (ISF)6. Mentre il sistema glymphatico consente la miscelazione di ISF all'interno del parenchima cerebrale con il LCR, le LV meningee, perivascolari e nasofaringe trasportano i soluti dal LCR lontano dalla cavità cranica. In particolare, la via linfatica meningea indirizza il liquido cerebrospinale dallo spazio subaracnoideo verso le LV meningeee, collegando la dinamica del liquido intracranico con la clearance linfaticaperiferica 7. Parallelamente, le vie perineurali permettono l'efflusso di LCR e soluti associati lungo le guaine dei nervi cranici e spinali, in particolare attraverso i nervi olfattivi nel plesso linfaticonasofaringeo 5,8. Il lavoro parallelo di questi sistemi mantiene l'omeostasi fluida all'interno del cervello 6,7,8. I recenti progressi nella comprensione del sistema linfatico che drena il SNC hanno fornito nuove intuizioni sulla fisiologia cerebrale e sulla fisiopatologia. Questi risultati potrebbero offrire nuove strade per l'intervento terapeutico nelle malattie delSNC 9.

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Figura 1: Rappresentazione schematica delle vie di clearing linfatico del SNC. Questi percorsi consistono in (A) la via glifatica attraverso spazi perivascolari; (B) la via linfatica nasofaringea, e (C) le LV meningee. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le reti linfatiche che drenano dalla testa e dal SNC convergono nei dotti linfatici cervicali situati nel collo, dove la linfa viene filtrata attraverso i linfonodi cervicali prima di entrare nella circolazione sistemica. I linfonodi cervicali sono classificati in linfonodi superficiali (sCLN) e profondi cervicali (dCLN) in base alla loro posizione anatomica all'interno del collo. Si ritiene che le alterazioni nella composizione del liquido linfatico all'interno dei dotti linfici cervicali riflettano variazioni fisiopatologiche sottostanti nel cervello, con la malattia di Alzheimer (DA), il morbo di Parkinson (PD), la lesione cerebrale traumatica (TBI) e il deficit cognitivo post-ictus (PSCI) come esempirappresentativi 9,10,11,12,13 . In particolare, nell'AD, il drenaggio compromesso delle proteine amiloide-β (Aβ) e tau fosforilate (P-tau) attraverso queste vie linfatiche è stato implicato come fattore contributivo alla progressionedella malattia 9,10,14. Collegando direttamente i dotti linfatici alle vene adiacenti per deviare il drenaggio linfatico, l'anastomosi venosa linfatica (LVA) è oggetto di studi sia negli animali che nell'uomo come strategia terapeutica per aumentare il flusso linfatico dal SNC, facilitando così la liberazione dell'Aβ dal cervello e potenzialmente ritardando la progressione dell'AD 6,15,16. L'importanza di questo percorso è ulteriormente illustrata dalle osservazioni su topi sottoposti a rimozione chirurgica dei linfonodi cervicali (linfadenectomia), con conseguente riduzione della clearance linfatica cervicale. Una ridotta eliminazione porta all'accumulo tossico di Aβ e P-tau, con successiva attivazione delle vie patologiche di segnalazione delle chinasi. Questi cambiamenti sono associati a un progressivo peggioramento della tauopatia simile all'AD e a un aumento del rischio di comportamenti simili ad ansia edepressione 14,16. Inoltre, studi basati sul LCR suggeriscono che i tumori del SNC, come i linfomi cerebrali, possono fisicamente ostacolare la clearance linfatica attraverso i dotti linfici profondi cervicali, aumentando contemporaneamente le concentrazioni di oncoproteine nelLCR 9,17,18. Le evidenze provenienti da studi basati sull'infiammazione del SNC indicano ulteriormente che le cellule originate nelle meningi possono migrare attraverso le LV meningee verso i linfonodicervicali 8,19. Queste cellule sono costituite principalmente da linfociti, con popolazioni più piccole di cellule dendritiche, macrofagi e celluleendoteliali 19,20. Durante l'infiammazione o dopo lesioni o interventi chirurgici al SNC, il traffico cellulare immunitario linfatico diventa evidentemente aumentato, accompagnato da livelli elevati di biomarcatori immunitari come citochine, chemichine e altri mediatoriinfiammatori 21.

Oltre ai suoi ruoli patofisiologici, la rete linfatica cervicale è sempre più riconosciuta come un importante tramite per la disposizione dei farmaci. Studi su animali precedenti hanno dimostrato che diverse formulazioni di farmaci progettate per l'amministrazione del SNC possono subire eliminazione dal cervello tramite i dotti linfatici e i linfonodi cervicali (in misura variabile), esemplificati da agenti a base di nanoparticelle somministrati intracerebralmente (ad esempio, lamotrigina, talazoparib) e biologici (ad esempio, anticorpi monoclonali, proteine traccianti radiomarcate)22,23,24,25. Negli esseri umani, studi di risonanza magnetica hanno dimostrato che alcune molecole, come il gadobutrolo, subiscono un trasporto attivo dal sistema linfattico ai dotti linficicervicali.

Come già detto, i linfonodi cervicali, sia gli sCLN che i dCLN, drenano la linfa da regioni distinte della testa; tuttavia, le specifiche regioni craniche drenate da ciascun nodo rimangono non chiare27,28. Le aree di drenaggio sovrapposte, la variabilità anatomica interindividuale e le potenziali differenze strutturali interspecie complicano ulteriormente la descrizione dei modelli di drenaggio linfatico cervicale sia negli animali che negliesseri umani 29. All'interno della complessa rete linfatica cervicale, i dotti linfatici profondi cervicali sono stati identificati come principali vie di uscita per il LCR, situati a valle delle LV nasofaringeo emeningeo 8. Rispetto ai dotti linfici cervicali superficiali, che formano reti sottili e variabili nel tessuto sottocutaneo e differiscono notevolmente per dimensione e ramificazione tra i singoli ratti, il dotto linfatico cervicale profondo offre una via più accessibile e pratica per raccogliere linfa derivata dal SNC in modelli animalidi piccole dimensioni 20,30. L'attuale protocollo si concentra quindi sull'istituzione di un metodo affidabile per la raccolta della linfa dal dotto linfático cervicale profondo.

Solo un numero limitato di studi condotti nell'ultimo decennio ha descritto la raccolta di fluidi linfatici cervicali per studiare le malattie del SNC o analizzare la distribuzione dei farmaci. Uno studio precedente descriveva la misurazione delle concentrazioni di farmaci nella linfa cervicale tramite il lavaggio o la spremura di liquido da sezioni di tessuto isolate (come quelle adiacenti a un singolo dCLN)31. Tuttavia, i protocolli sperimentali per la raccolta continua di linfa dai dotti linfici cervicali nei piccoli animali da laboratorio, in particolare nei ratti, restano poco sviluppati. Questo protocollo stabilisce un metodo facilmente accessibile e riproducibile per cannulare il dotto linfatico cervicale (ratto) al fine di consentire la raccolta continua della linfa e per indagare il trasporto linfatico del sistema nervoso centrale, le risposte immunitarie e la farmacocinetica. Il suo principale vantaggio risiede nella capacità di quantificare il flusso e la composizione linfatica su intervalli di tempo definiti, permettendo così la misurazione quantitativa di farmaci, lipidi, acidi grassi e componenti cellulari. In particolare, questo modello cattura processi di trasporto linfatico che non sono adeguatamente rappresentati da tecniche di campionamento o imaging plasma/LCR, offrendo nuove intuizioni sulla disposizione dei farmaci nel SNC, il trasporto di lipidi e nutrienti e la segnalazioneimmunitaria 20.

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Protocollo

La procedura o le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dal comitato di etica animale dell'università e sono state eseguite in conformità con le linee guida etiche sperimentali dell'Università Farmaceutica Cinese. Prima di iniziare qualsiasi procedura relativa agli animali, ottieni le approvazioni necessarie dal comitato etico istituzionale o organizzativo competente. I maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) che pesano tra 220 e 250 g sono utilizzati come animali sperimentali. Gli animali sono provenienti da fornitori autorizzati di animali sperimentali (vedi Tabella dei Materiali) e ospitati in gabbie dedicate con libero accesso a cibo e acqua fino all'inizio dell'esperimento. In questo protocollo, la cannulizzazione del dotto linfatico profondo cervicale sinistro è descritta come esempio rappresentativo. Attualmente, ci sono poche evidenze che descrivono differenze anatomiche tra i dotti linfici profondi del cervico sinistro e destro. Sulla base delle osservazioni di esperimenti precedentemente completati, non sono state osservate differenze significative tra i due lati, inclusi i tassi di flusso linfatico.

1. Precauzioni e procedure di sicurezza

  1. Eseguire tutte le procedure in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza e tutto il personale dovrebbe ricevere una formazione adeguata sulle tecniche microchirurgiche, sulla manipolazione degli animali sperimentali e sulla sicurezza chimica prima di eseguire questo protocollo.
  2. Indossare l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata, inclusi camice da laboratorio, guanti chirurgici e occhiali protettivi, durante tutta la procedura. Poiché viene utilizzato un anestetico volatile (isoflurano) che può causare depressione del sistema nervoso centrale e tossicità cardiovascolare negli esseri umani dopo esposizione prolungata, esegui la procedura in un ambiente ben ventilato. Cibo e bevande non devono essere portati in laboratorio, e assicurarsi che l'acqua corrente sia sempre facilmente accessibile.
  3. Maneggiare con cura tutti gli oggetti appuntiti, inclusi aghi per siringa, lamette da rasoio e microforbici, e smaltirli immediatamente dopo l'uso in contenitori appositamente per oggetti taglienti; In nessun caso si dovrebbero riutilizzare oggetti taglienti usa e getta.
  4. Trattare tutti i campioni biologici (ad esempio, linfa raccolta) e i fluidi corporei animali (ad esempio, sangue) come potenzialmente pericolosi, e maneggiare con attenzione tutte le attrezzature di raccolta tenendo i campioni lontani dall'area chirurgica. In caso di ferita accidentale da ago o contatto cutaneo con sostanze pericolose, lavare immediatamente l'area interessata con acqua e sapone e segnalare l'incidente secondo i protocolli di sicurezza istituzionali.

2. Preparazione il giorno prima dell'intervento

  1. Digiunare o nutrire i ratti secondo le esigenze dell'esperimento specifico. Questo protocollo non impone uno stato specifico di digiuno o di alimentazione alimentata.
  2. Prepara una soluzione anticoagulante diluendo l'eparina o l'acido etilendidiaminatetraacetico (EDTA) a una concentrazione finale di 10 IU/mL. Precarica questa miscela (circa 0,7 mL) in una siringa sterile di insulina da 1 mL dotata di ago da 30 G, per pre-rivestire la superficie interna della cannula in polietilene (PE) (utilizzata per la cannula dei dotti linfatici). Conserva questa miscela preparata in condizioni sterili fino all'uso.
  3. Prepara le cannule per la raccolta del campione linfatico assemblando una cannula PE in configurazione testa-coda, utilizzando tubi di diametro esterno (OD) di 0,5 mm, diametro interno (ID) di 0,3 mm per entrambe le sezioni terminali e tubi di 0,6 mm di diametro diametrale e 0,5 mm di diametro diametrale per la sezione centrale.
    1. Tagliare i segmenti della cannula a lunghezze di 2 cm per la porzione prossimale che si collega all'ago della siringa, 40 cm per la parte centrale e 8 cm per la parte distale destinata alla canulazione.
    2. Tagliare e smussare l'estremità distale dell'assemblaggio della cannula con un angolo di circa 45° per facilitare un'inserimento fluido nel dotto linfatico cervicale. Consulta la Figura 2 per un'illustrazione dettagliata dell'assemblaggio della cannula.
      NOTA: Questo smusso facilita un'inserzione fluida nel dotto linfatico e riduce il rischio di ostruzione aumentando l'area efficace della sezione trasversale. Dopo una canulazione riuscita in canulazione, la sezione prossimale (2 cm) viene disconnessa e la linfa viene raccolta direttamente dall'estremità prossimale esposta della sezione centrale (come descritto in dettaglio negli Step 4.9 e 4.10).

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Figura 2: Diagramma schematico dell'assemblaggio della cannula (non in scala). Il diagramma illustra le dimensioni di ciascun componente del tubo in PE assemblato utilizzato per costruire la canula. Da sinistra a destra, la cannula assemblata sarà d'ora in poi chiamata rispettivamente estremità prossimale, sezione centrale e estremità distale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  

  1. Prepara il sistema di inalazione dell'anestesia pre-caricando l'isoflurano liquido nel contenitore pressurizzato dotato di vaporizzatore. Prima dell'uso, esegui una prova (priming) del vaporizzatore per confermare l'ermeticità all'aria e garantire un flusso di gas stabile e costante.
  2. Se necessario, prepara il candidato farmaco in un veicolo adatto. Condurre studi di stabilità per confermare l'integrità della formulazione durante la conservazione e durante il periodo di somministrazione. Includere agenti aggiuntivi (ad esempio, coloranti biologici come Evans Blue) dove applicabile.
  3. Prepara i contenitori per la raccolta della linfa pesando pre-pesando i tubi sterili della microcentrifuga e registrando i loro pesi iniziali. Etichetta ogni tubo in modo sequenziale secondo i punti di raccolta pianificati (ad esempio, intervalli orari). Aggiungere eparina concentrata (o EDTA) a ogni tubo e rimuovere il solvente tramite evaporazione di azoto, lasciando da 2 a 5 UI di eparina secca (o EDTA) per ogni tubo per evitare una diluizione disuniforme della linfa raccolta.

3.  Preparativi immediatamente prima dell'intervento

  1. Verifica la permeabilità di ogni cannula risciacquando con la soluzione anticoagulante preparata. Collega una siringa all'estremità prossimale della cannula assemblata e rilascia delicatamente un piccolo volume di soluzione. Assicurati che la soluzione esca in modo fluido dall'estremità distale senza segni di perdite. Se viene rilevata una perdita, come tipicamente indicato dal fluido che fuoriesce al/i punto/i di connessione, scartare l'intero insieme della cannula e ricostruirne uno nuovo secondo il Passo 2.3.
    NOTA: Questo passaggio pre-rivestisce contemporaneamente la superficie interna della cannula con anticoagulante (questo passaggio può essere eseguito anche il giorno prima dell'intervento, così la cannula viene pre-rivestita durante la notte).
  2. Inizia la somministrazione di isoflurano inalata tramite una maschera a cono nasale circa 5 minuti prima dell'inizio dell'intervento. Mantenere l'anestesia durante tutta la procedura a una velocità di parto compresa tra 0,4 e 0,6 L/min sotto una pressione di 101,3 kPa a 20 °C. Assicurati la profondità dell'anestesia valutando la risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
    1. Monitorare continuamente la profondità dell'anestesia. Eutanasia immediatamente il ratto se si osservano segni di disagio o instabilità fisiologica.
  3. Posiziona il ratto supino su un assorbente chirurgico riscaldato mantenuto a 37 °C. Inclina la testa ed estendi il collo, usando un piccolo supporto (cuscino) se necessario, per massimizzare l'esposizione della regione cervicale. Fissare la testa all'interno della maschera anestetica per garantire una somministrazione continua di isoflurano e immobilizzare delicatamente gli arti anteriori usando elastici o nastri chirurgici per minimizzare i movimenti durante la procedura.
  4. Risciacquare il pelo della regione cervicale con soluzione salina normale sterile per facilitare la rasatura. Radere accuratamente l'intero sito chirurgico (usando una lametta di rasoio a doppio taglio), tipicamente la zona del collo e della clavicola, per garantire la completa rimozione del pelo prima dell'incisione (vedi Figura 3A per un esempio dell'area del collo rasato).
  5. Pulisci tutta l'area rasata con disinfettanti, come un agente contenente iodio.
  6. Segna il sito chirurgico tracciando una linea tratteggiata di 2,5 cm per confermare la lunghezza dell'incisione iniziale. Posiziona la linea leggermente a destra della linea centrale del corpo del ratto. Posizionare l'estremità superiore dell'incisione circa 1-1,5 cm sotto il labbro inferiore (vedi la Figura 3B per un esempio del sito dell'incisione, con le misure supportate da un righello).

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Figura 3: Preparazione del sito chirurgico. (A) La zona del collo viene rasata in preparazione all'incisione; (B) lunghezza approssimativa e posizione dell'incisione, indicate dalla linea tratteggiata di 2,5 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Cannulazione del dotto linfatico cervicale

  1. Posiziona il ratto con la testa rivolta verso l'operatore. Usa un microscopio per questo passaggio a causa del diametro relativamente piccolo del dotto linfatico cervicale.
  2. Utilizzando un bisturi sterile, incisi con cura lo strato superficiale della muscolatura cervicale lungo il già citato segno lungo 2,5 cm, orientato quasi parallelo alla linea mediana (vedi Figura 4A per lo strato superficiale aperto della pelle).
  3. Separare delicatamente gli strati muscolari rimanenti, principalmente la fascia cervicale superficiale, per esporre l'arteria cervicale, che di solito si distingue per la sua colorazione rossa.
  4. Ritrai il muscolo sternomastoideo e la ghiandola submandibolare e inclinali con attenzione lontano dal campo chirurgico per facilitare l'identificazione del dotto linfatico cervicale. Utilizzare un espansore tissutale per mantenere la finestra chirurgica e utilizzare un cotton cotton werb per tenere temporaneamente da parte il tessuto muscolare mentre si localizza il linfonodo e il dotto linfático associato. Assicurarsi che l'espansore tissutale sia presente per tutto il processo di canulazione (vedi la Figura 4B per la finestra chirurgica aperta con l'espansore tissutale in posizione).
  5. Individuare il dotto linfatico cervicale (preferibilmente al microscopio): il dotto appare come un vaso opaco e incolore con un diametro di circa 0,2-0,5 mm e corre immediatamente parallelo all'arteria carotide. Una o più dCLN adiacenti, color carne, possono essere spesso osservate lungo il percorso del dotto linfatico cervicale (vedi la Figura 4C per una vista microscopica del dotto linfatico cervicale profondo esposto e di una dCLN adiacente).
    NOTA: I dotti linfici cervicali hanno tipicamente un colore molto simile a quello dei tessuti circostanti e la loro identificazione richiede spesso un'attenta ispezione, in particolare nei ratti con più tessuto adiposo. Per scopi chirurgici (ma non per studi sul trasporto linfatico di farmaci o sostanze endogene), Evans Blue può essere iniettato sottocutaneamente sotto il collo all'inizio dell'intervento, così che il dotto linfático cervicale possa essere meglio visualizzato quando il colorante drena tramite i linfaci.
  6. Utilizzando una pinza smussata, passa delicatamente attraverso i tessuti connettivi separati e mantiene le pinze in posizione per garantire che il dotto linfatico cervicale rimanga chiaramente visibile all'interno del campo chirurgico.
  7. Isolare con cura il dotto linfatico cervicale dai tessuti connettivi e adiposi circostanti tramite una dissezione contundente, prestando particolare attenzione a evitare danni, poiché il vaso è estremamente fragile.
  8. Usa un paio di microforbici per creare una piccola incisione nella metà superiore del dotto esposto. Non staccare completamente il condotto; le due metà devono rimanere intatte.
  9. Controlla e assicurati che la cannula preparata, pre-rivestita con soluzione anticoagulante (come descritto nel Passo 2.3), sia libera da bolle d'aria eseguendo un delicato lavaggio. Immediatamente prima dell'inserimento, afferrare con attenzione l'estremità distale della cannula con la pinza, orientandola in modo che la faccia smussata sia rivolta verso l'alto. Poi, avanza delicatamente la cannula di circa 2 mm nel dotto attraverso l'incisione, dirigendola verso la testa (vedi la Figura 4D per un'illustrazione della canulazione riuscita). La profondità effettiva di inserimento può variare a seconda del singolo ratto.
    NOTA: Poiché l'inserimento della cannula è relativamente superficiale in questa procedura, un ulteriore punto di fissazione nell'area circostante può essere utile. Questo si ottiene creando una piccola puntura secondaria (foro) cutanea a circa 1,5 cm dalla finestra chirurgica usando forbici. Questa apertura sarà ulteriormente stabilizzata nei passaggi successivi (ad esempio, con sutura o adesivo). La Figura 4E dimostra questo passaggio nel contesto dell'uso dell'adesivo tissudinare. La cannula deve essere fatta passare attraverso il foro per aiutare a fissarne la posizione.
  10. Distacca la siringa di insulina insieme al segmento prossimale breve (2 cm) della cannula dal resto dell'assemblaggio della cannula. La linfa può quindi essere raccolta direttamente dall'estremità prossimale esposta del segmento centrale di diametro maggiore. Monitorare la punta distale di questo segmento di raccolta per 1–2 minuti. Confermare la canulazione riuscita tramite un flusso visibile, lento e costante di liquido linfatico dal dotto canulato.
  11. Una volta che la canulazione è stata verificata come efficace, si fissa la cannula applicando una piccola goccia di adesivo di tessuto cianoacrilato con una pipetta sia nel sito dell'incisione del dotto linfatico sia nel foro di fissazione secondario (vedi la Figura 4E per una dimostrazione della fissazione della cannula). Fai particolare attenzione a evitare di occludere il vaso o compromettere il flusso linfatico.
  12. Osserva il flusso linfatico per diversi minuti per confermare un flusso costante (una goccia visibile si forma tipicamente all'estremità della cannula entro un minuto). Una volta verificato, rimuovere con attenzione l'espansore tissutale dalla finestra chirurgica e riposizionare la ghiandola submandibolare nella sua posizione originale.
  13. Attaccare un tubo microcentrifuga pre-marcato rivestito di anticoagulante (vedi Passo 2.6) all'estremità distale della cannula per raccogliere la linfa a flusso libero.

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Figura 4: Annullazione del dotto linfatico cervicale. (A) Sito dell'incisione nella regione del collo; (B) finestra chirurgica aperta con un espansore tissutale in posizione e la ghiandola submandibolare ritratta a destra; (C) dotto linfatico cervicale e un dCLN visualizzati al microscopio. (D) Canulazione riuscita e riusitata, indicata dalla linea tratteggiata verde (vista microscopica). (E) È stato applicato adesivo tissutale sul sito dell'incisione e una puntura secondaria della pelle è stata effettuata con una pipetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Periodo post-operatorio e somministrazione dei farmaci

  1. Al termine della cannulizzazione del dotto linfatico cervicale, riposizionare tutti gli strati muscolari nelle loro posizioni originali. Successivamente, chiudere l'incisione cutanea con punti di sutura e/o adesivo tissutale; tipicamente, un'incisione lunga 2,5 cm può essere chiusa correttamente con 8 punti di sutura (vedi Figura 5A per una finestra chirurgica chiusa con sutura). Rimuovere l'elastico o i nastri chirurgici che li costranti sugli arti anteriori al completamento di questo passaggio.
  2. Somministrare farmaci nel LCR tramite una via appropriata, come intra-cisterna magna (ICM), intra-cerebroventricolare (ICV) o iniezione intratecale lombare (LIT). Usando la somministrazione di ICM come esempio, si identifica il sito di iniezione nella cisterna magna, situata alla base del cranio e visibile come unica depressione morbida sulla superficie dorsale. Radere il pelo circostante se necessario per facilitare la visualizzazione (vedi la Figura 5B per un'area indicata e adatta per l'iniezione di ICM).
    NOTA: Per mantenere la pressione intracranica (ICP) durante l'iniezione di ICM, spesso viene prelevato un volume equivalente di liquido cerebrospinale prima della somministrazione del farmaco. Si consiglia di utilizzare una siringa nuova e già riempita per l'iniezione. Piegare l'ago della siringa può facilitare l'amministrazione (vedi la Figura 5C per una dimostrazione dell'iniezione ICM usando un ago piegato per siringa).
  3. Tieni il ratto supino sul pad chirurgico riscaldato (mantenuto a 37 °C) per mantenere la temperatura corporea dopo l'iniezione e per tutto il periodo di raccolta del campione.

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Figura 5: Gestione post-operatoria. (A) Sito dell'incisione chiuso usando sutura di seta. (B) Posizione approssimativa della cisterna magna con il pelo circostante rasato. (C) Somministrazione ICM di un candidato farmaco utilizzando una siringa per insulina con un ago piegato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Raccolta di campioni linfatici e analisi

  1. Raccogliere la linfa continuamente in tubi microcentrifughe rivestiti di anticoagulanti, sostituendo i tubi a intervalli prestabiliti (tipicamente ogni ora). Conserva i campioni raccolti con impacchi di ghiaccio usando una scatola. Consulta la Figura 6 per un campione di linfa cervicale raccolto in un tubo microcentrifuga.
  2. Al termine del processo di raccolta della linfa, sopportare il ratto in modo umano secondo i protocolli appropriati.
  3. Determinare la portata linfa misurando il volume di linfa raccolto durante ogni intervallo pianificato (orari).
  4. Misurare le concentrazioni di farmaci (o sostanze di interesse) nella linfa utilizzando metodi analitici appropriati, inclusi HPLC, HPLC-MS o kit di analisi commerciali, per caratterizzare la loro cinetica di eliminazione dal sistema nervoso centrale tramite il sistema linfatico.
  5. Calcola il trasporto di massa dei farmaci linfatici moltiplicando le concentrazioni misurate per i relativi volumi linfatici.

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Figura 6: Raccolta del campione di linfa. Fotografia di un campione raccolto (circa 100 μL) in un tubo a microcentrifuga. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Gestione post-procedura e smaltimento dei rifiuti

  1. Conservare temporaneamente i ratti eutanasiati in contenitori designati per i rifiuti medici all'interno di un'area dedicata a freddo (ad esempio, un frigorifero) fino a quando non vengono raccolti e smaltiti da un team professionale di trattamento dei rifiuti medici.
  2. Raccogli tutti gli oggetti appuntiti smaltiti in un contenitore designato per gli oggetti taglienti, separato da tutti gli altri rifiuti.
  3. Smaltire tutti gli altri oggetti non appuntiti utilizzati nell'esperimento (ad esempio, cotton swabb, elastici, cannule PE) in sacchi di rifiuti medici e non smaltirli insieme a rifiuti domestici o generali. Assicurati che non vengano messi oggetti appuntiti in questa borsa.
  4. Pulire e disinfettare tutti gli strumenti riutilizzabili rimanenti in conformità con i protocolli di laboratorio.

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Risultati

Un dataset rappresentativo dei flussi linfatici orari (mL/h) è stato ottenuto utilizzando il modello di canulazione linfatica cervicale (vedi Figura 7 per la tabella corrispondente). In questo esperimento che ha coinvolto tre (n = 3) ratti di studio, la linfa è stata raccolta continuamente in tubi microcentrifughe, che sono stati sostituiti ogni ora nell'arco di 6 ore.

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Discussione

Questo protocollo stabilisce un metodo riproducibile per la canulazione del dotto linfatico cervicale nei ratti, consentendo una raccolta continua di linfa per periodi prolungati. Con un'adeguata formazione microchirurgica, la procedura può essere eseguita in modo efficiente e produce campioni linfatici consistenti in condizioni fisiologiche stabili, mantenute da anestesia continua, rendendola adatta all'uso sperimentale di routine. Una volta padroneggiata, la procedura chirurgica richie...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano sembrare influenzare il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano sinceramente il signor Zhenglin Hao e la signora Jie Zhao del Centro Sperimentale Animale dell'Università Farmaceutica Cinese per il loro supporto nella conduzione di esperimenti sugli animali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago calibro 30Yushou HealthUtilizzata per collegare l'estremità prossimale della cannula (0503) con la siringa per eparina
Dispensatore di anestesia con vaporizzatoreYYUN Instrument Company
Pinze smussateScienze della Vita RWDF22002-10 
Cotton bobBiotecnologia Qingdao ShultzMQ-02Usata per tenere temporaneamente il tessuto muscolare in posizione
Assorbente chirurgico riscaldatoShanghai Yiheng InstrumentsDimensione 15 e tempi; 20 cm
Eparina sodicaTecnologia Biochimica di Shanghai AladdinH123383Diluizione necessaria prima dell'uso
Siringa per insulina (1 mL)Yushou HealthU100-1MLUsato solo per il pre-rivestimento dell'eparina
Soluzione di isoflurano per l'inalazioneScienze della Vita RWDR510-22-10Usato per l'anestesia tramite vaporizzatore
Penne marcatriciQualsiasi marcaN/A
Tubo microcentrifuga (1,5 mL)Attrezzature sperimentali Nantong HairuiHR10003Utilizzato per la raccolta della linfa
Micro-forbiciScienze della Vita RWDGD234BA0007925
Sutura chirurgica in nylon Shanghai Yiheng Instruments4-0 35CM
Pipetta (regolabile a volume, intervallo da 5 a 50 e mu; L)Dragon Laboratory Instruments Limited7030301006Utilizzato solo per misurare adesivi a tessuto
Punte per pipette Biosharp Scienze della VitaBS-10-TUsato solo per il trasferimento di adesivo tissutale, senza volume specifico richiesto
Cannula in polieiilene (PE) 0,5 mm di diametro diametrale, 0,3 mm diametro diametrale (0503)AniLab Strumenti Scientifici (Ningbo)PE-0503
Cannula in polieiilene (PE) 0,6 mm di diametro diametrale, 0,5 mm diametro diametrale (0605)AniLab Strumenti Scientifici (Ningbo)PE-0605
Lamette di rasoioGillette ShanghaiQ31/0115000301C004Usato solo per la rasatura del pelo
ElasticoQualsiasi marcaN/AUsato per trattenere gli arti anteriori dei ratti
SovranoQualsiasi marcaN/A
Lame scapel (#23)Scienze della Vita RWDS31010-01
Soluzione di cloruro di sodio (0,9%) per infusioneShijiazhuang No. 4 PharmaceuticaH20066533 (numero di approvazione)Usato solo per risciacquare pelli
Sprague-Dawley RatsTecnologia Animale di Laboratorio del Fiume Vitale di Pechino101Peso da 220 a 250 grammi, senza requisito di età
Luce chirurgicaPechino Heo Bio-TechXHA011-1
Microscopio chirurgicoTecnologia Optoelettronica Cewei di ShanghaiSMZ755TMicroscopio dissezionale senza palco meccanico, può essere equipaggiato con un supporto retrattile
Adesivo tissulare3M Vetbond1469SBIngrediente principale cianoacrilato  
Espansore tissutale (Colibri)Scienze della Vita RWDR22029-04Intervallo di espansione 20mm/4cm

Riferimenti

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