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Articolo di ricerca
Questo studio identifica una riduzione della diversità microbiota intestinale e vie metaboliche alterate nel diabete di tipo 2 (T2DM), evidenziando l'aumento dei proteobatteri e la diminuzione dei taxa benefici, suggerendo che la disbiosi microbica è associata al T2DM e potrebbe contribuire alla sua fisiopatologia.
L'aumento globale del diabete mellito di tipo 2 (T2DM) sottolinea la necessità di comprendere meglio i suoi meccanismi biologici sottostanti, in particolare quelli che coinvolgono le interazioni ospite–microbioma. Questo studio mirava a caratterizzare la diversità microbica intestinale, la composizione tassonomica e le vie metaboliche previste nei pazienti con diagnosi T2DM appena diagnosticati rispetto al gruppo non diabetico compatibile (NM). I campioni di feci fresche sono stati analizzati utilizzando il sequenziamento 16S rDNA. La diversità alfa (indici di Chao, ACE, Shannon e Simpson) e la diversità beta sono state calcolate per valutare la struttura delle comunità microbiche. Le differenze tassonomiche sono state valutate utilizzando test di Wilcoxon a somma dei rangi e analisi discriminante lineare dimensione dell'effetto (LEfSe). La previsione delle vie funzionali è stata effettuata utilizzando l'indagine filogenetica delle comunità tramite la ricostruzione di stati non osservati (PICRUSt2) basata sulle annotazioni KEGG e MetaCyc. L'analisi di randomizzazione mendeliana (MR), inclusa la ponderazione inversa della varianza, la MR-Egger e i metodi della mediana ponderata, è stata applicata per valutare le associazioni geneticamente previste tra taxa microbici e T2DM. I risultati hanno mostrato una ricchezza microbica ridotta, come riflesso da indici di Chao e ACE più bassi, e una struttura di diversità alterata, come si riflette in indici di Shannon più bassi e di Simpson più alti, nei pazienti con diabete di tipo 2DM, accompagnati da significativi cambiamenti compositivi. È stato osservato un aumento dell'abbondanza relativa di Proteobacteri e una diminuzione dell'abbondanza di taxa benefici come Lachnospiraceae e Blautia. La previsione funzionale ha indicato una riduzione dell'abbondanza di vie correlate alla via del pentosio fosfato non ossidativo, alla biosintesi dell'isobutanolo e alla biosintesi della L-isoleucina. L'analisi RM ha fornito evidenze complementari a sostegno delle associazioni tra specifici taxa microbici e la suscettibilità al T2DM. In conclusione, il T2DM è associato a una riduzione della ricchezza microbica, a una struttura di diversità alterata e a cambiamenti tassonomici e funzionali distinti. Questi risultati evidenziano la rilevanza del microbiota intestinale nel T2DM e supportano la potenziale utilità dei biomarcatori basati sul microbioma e delle strategie terapeutiche. Sono necessari ulteriori studi per convalidare questi risultati e chiarire i meccanismi sottostanti.
Il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è diventato una delle malattie croniche in più rapida crescita al mondo, guidato da una rapida urbanizzazione, schemi alimentari occidentalizzati e stili di vita sempre piùsedentari 1,2. È un contributo importante alla morbilità e mortalità globale e impone un notevole onere per la salutepubblica 3. Sebbene la suscettibilità genetica abbia un ruolo, il rapido aumento dell'incidenza di T2DM evidenzia l'importanza dei determinanti ambientali emetabolici 4. Identificare meccanismi biologici modificabili è quindi essenziale per migliorare le strategie di diagnosi e prevenzione precoce. Recenti progressi hanno identificato il microbiota intestinale come un regolatore chiave dell'omeostasimetabolica 5. L'ecosistema microbico intestinale influenza il metabolismo del glucosio, la funzione immunitaria, l'integrità della barriera intestinale e l'infiammazione cronica di basso grado, tutti elementi centrali per la patogenesi del T2DM6. La disbiosi è stata associata a obesità, resistenza all'insulina, endotossemia e alterazione dell'equilibrio energetico, suggerendo un legame meccanicistico tra alterazioni microbiche e progressione dellamalattia 7. Inoltre, i metaboliti microbici, tra cui acidi grassi a catena corta, acidi biliari e amminoacidi a catena ramificata, sono stati implicati nella modulazione della sensibilità all'insulina e del metabolismodell'ospite 8.
Sebbene l'accumulo di evidenze supporti il ruolo del microbioma intestinale nel T2DM, la maggior parte degli studi esistenti si basa su disegni osservazionali, che limitano l'inferenza causale. Approcci alternativi, come la metagenomica shotgun e la metabolomica mirata, possono fornire insight funzionali ad alta risoluzione ma sono spesso vincolati da costi, complessità computazionale e fattibilità limitata in studi esplorativi o su scala pilota. Al contrario, il sequenziamento 16S rDNA è un metodo economicamente adottato e ampiamente adottato per profilare la composizione delle comunità microbiche, anche se la sua risoluzione tassonomica è limitata al livello della specie e non può quantificare direttamente i metaboliti funzionali. Pertanto, il sequenziamento 16S rDNA è stato selezionato per questo studio come approccio economico e scalabile, adatto alle coorti cliniche esplorative, consentendo al contempo l'integrazione con la previsione funzionale a valle e i quadri analitici complementari. Pertanto, integrare la profilazione microbica basata su 16S con la previsione funzionale bioinformatica e approcci complementari come la randomizzazione mendeliana (MR) può fornire un quadro equilibrato per esplorare sia le relazioni composizionali che potenzialmente causali.
È importante notare che persiste una relativa carenza di dati che si concentrino specificamente sui pazienti T2DM appena diagnosticati e indifferenti al trattamento. In tali popolazioni, le alterazioni microbiche sono meno propense a essere confuse da interventi farmacologici, in particolare la metformina, nota per rimodellare significativamente la composizione e la funzione del microbiotaintestinale 9. Questo rappresenta una lacuna importante nella letteratura attuale, poiché molti studi esistenti includono popolazioni di pazienti eterogenee con esposizioni al trattamento variabili e integrazione limitata della profilazione del microbioma con approcci analitici geneticamente informati.
In questo contesto, il presente studio ha mirato a caratterizzare la diversità della microbiota intestinale, la composizione tassonomica e le vie funzionali previste nei pazienti con T2DM appena diagnosticati rispetto al gruppo NM, utilizzando il sequenziamento del rDNA 16S e l'analisi bioinformatica. Inoltre, la randomizzazione mendeliana è stata applicata utilizzando dati di associazione genomica a livello genomico disponibili al pubblico per esplorare potenziali associazioni geneticamente previste tra specifici taxa microbici e il rischio di T2DM. Questa strategia analitica combinata consente approfondimenti complementari derivanti dalla profilazione delle comunità microbiche e dai dati genetici a livello di popolazione. In particolare, il sequenziamento 16S rDNA fornisce una caratterizzazione diretta della composizione microbica nella popolazione studiata, mentre la randomizzazione mendeliana sfrutta strumenti genetici di coorti indipendenti per valutare se le associazioni osservate siano coerenti con le relazioni geneticamente previste. Questa integrazione mira ad affrontare una limitazione chiave degli studi sul microbioma osservazionale, fornendo prove complementari che supportino la robustezza delle associazioni microbiota–T2DM. Pertanto, l'integrazione di questi approcci mira a fornire una validazione incrociata piuttosto che una ridondanza, rafforzando così l'interpretabilità delle associazioni microbiota–T2DM.
Il presente studio si concentra su tre aspetti. Innanzitutto, valuta le alterazioni del microbiota intestinale nei pazienti T2DM appena diagnosticati e indifferenti al trattamento per ridurre la confusione derivante da interventi farmacologici. In secondo luogo, integra il profiling tassonomico con le vie funzionali previste per fornire una visione a livello di sistema dei cambiamenti metabolici associati al microbiota. In terzo luogo, incorpora l'analisi di randomizzazione mendeliana per valutare se le associazioni osservate siano coerenti con le relazioni geneticamente previste, fornendo così una triangolazione metodologica. Collettivamente, questi aspetti forniscono un quadro complementare e riproducibile per l'analisi del microbioma piuttosto che uno studio puramente descrittivo, distinguendo questo lavoro da studi precedenti che tipicamente si basano su disegni osservativi a metodo singolo e non integrano profilazione microbica, previsione funzionale e inferenza geneticamente informata all'interno di un quadro analitico unificato.
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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Chongqing Chenjiaqiao (approvazione n. 20240131). È stato ottenuto un consenso informato scritto da tutti i partecipanti prima della raccolta del campione. Tutti i campioni di feci e le informazioni sui partecipanti sono stati gestiti utilizzando codici di studio de-identificativi, come elencato nella Tabella dei Materiali.
Selezione e iscrizione dei partecipanti
I pazienti recentemente diagnosticati con T2DM che hanno visitato l'Ospedale Chongqing Chenjiaqiao tra giugno 2023 e dicembre 2023 sono stati sottoposti a screening per la idoneità. I partecipanti sono stati iscritti al gruppo DM se avevano tra i 20 e i 65 anni, avevano una nuova diagnosi di T2DM, avevano accettato di fornire un campione di feci fresco e completavano la valutazione della storia clinica e gli esami clinici richiesti. I volontari sani reclutati nello stesso periodo sono stati inclusi come gruppo non diabetico (NM) e sono stati abbinati al gruppo DM il più possibile in termini di età, sesso e caratteristiche demografiche generali. I partecipanti sono stati esclusi se presentavano disturbi ematologici, malattie del sistema nervoso centrale, malattie reumatiche attive, malattie autoimmuni, infezioni gastrointestinali acute o croniche, diarrea cronica, stitichezza, ulcera gastrointestinale attiva o in fase di guarigione, malattie infiammatorie intestinali, sindrome dell'intestino irritabile, tubercolosi intestinale, tumori gastrointestinali, altre malignità, insufficienza cardiaca grave, insufficienza epatica grave, insufficienza renale grave, altri metaboli gravi malattie, malnutrizione, immunodeficienza, disturbi metabolici congeniti, malattie psichiatriche, uso di sedativi-ipnotici o abuso di droghe. I partecipanti sono stati inoltre esclusi se avevano ricevuto antibiotici, agenti soppressori di acido, farmaci per la motilità gastrointestinale, probiotici, glucocorticoidi o immunosoppressori entro un mese prima della prelieva delle feci. Inoltre, sono state escluse le persone che avevano avuto diarrea, sottoposto a interventi chirurgici gastrointestinali o endoscopie gastrointestinali, o riportato cambiamenti improvvisi nell'ambiente di vita o nelle abitudini alimentari entro un mese prima della prelieva delle feci. Un codice unico dello studio è stato assegnato a ciascun partecipante idoneo prima della raccolta del campione. Dalla coorte idonea, 12 partecipanti recentemente diagnosticati con T2DM e 12 NM sono stati selezionati per il sequenziamento a valle del rDNA 16S e le analisi del microbioma basate sulla disponibilità di campioni e sui requisiti di qualità del sequenziamento.
Raccolta e conservazione dei campioni di feci
A ogni partecipante è stato fornito un contenitore sterile per la raccolta delle feci, etichettato solo con il codice assegnato per garantire la de-identificazione. Ai partecipanti è stato istruito a svuotare la vescica prima della defecazione per minimizzare la contaminazione delle urine e a raccogliere feci fresche direttamente nel contenitore sterile senza entrare in contatto con acqua del bagno, urina, disinfettanti o altri potenziali contaminanti. Immediatamente dopo la prelieva, circa 1–2 g di feci venivano trasferiti in un tubo criogenico sterile utilizzando un cucchiaio di campionamento sterile usa e getta. Il tubo era ben sigillato e immediatamente posizionato su ghiaccio secco o in un contenitore di trasferimento pre-raffreddato. Tutti i campioni sono stati trasportati in laboratorio entro 2 ore dalla ripresa. All'arrivo al laboratorio, il codice dello studio è stato verificato e ogni tubo è stato ispezionato per eventuali perdite o contaminazioni visibili. I tempi di raccolta e conservazione sono stati registrati per tutti i campioni. I campioni di feci venivano successivamente conservati a −80 °C fino all'estrazione del DNA genomico. I campioni erano considerati accettabili per l'analisi a valle solo se rimanevano completamente congelati durante lo stoccaggio e il trasporto e non mostravano segni di perdite di tubi o contaminazione esterna.
Estrazione del DNA genomico
I campioni di feci venivano prelevati dalla stoccazione a −80 °C e posti sul ghiaccio prima della lavorazione. Ogni campione veniva scongelato solo fino a quando l'omogeneizzazione non era possibile per minimizzare la degradazione associata a cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Circa 200 mg di feci sono stati trasferiti in un tubo sterile per microcentrifuga, e il tampone di lisi fornito nel kit di estrazione del DNA delle feci è stato aggiunto secondo le istruzioni del produttore elencate nella Tabella dei Materiali. I campioni sono stati vortizzati vigorosamente per 30 secondi per ottenere una completa omogeneizzazione e poi incubati a temperatura ambiente per 5–10 minuti per facilitare la lisi cellulare. Dopo la lisi, i campioni sono stati centrifugati a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante fu trasferito con cura in un nuovo tubo sterile per microcentrifuga senza disturbare il pellet. Il DNA genomico è stato successivamente eluzionato utilizzando il tampone di eluzione fornito con il kit o acqua senza nucleasi secondo il protocollo del produttore. Il DNA estratto veniva conservato a −20 °C per un uso a breve termine o a −80 °C per la conservazione a lungo termine. I campioni di DNA considerati adatti all'analisi a valle sono apparsi chiari e privi di particolato visibili.
Valutazione della qualità del DNA
La qualità del DNA è stata valutata utilizzando elettroforesi su gel di agarosio e quantificazione basata sulla fluorescenza. Un gel di agarosio all'1% è stato preparato in un tampone di elettroforesi e i campioni di DNA estratti, miscelati con il tampone di carico, sono stati caricati nei pozzi del gel. L'elettroforesi veniva eseguita fino a quando le bande del DNA non erano adeguatamente separate, dopodiché il gel veniva esaminato sotto illuminazione ultravioletta o blu. L'integrità del DNA era considerata accettabile quando si osservava una banda genomica intatta senza una degradazione marcata o sbavagamento eccessivo. La concentrazione di DNA è stata successivamente quantificata utilizzando un sistema di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza. I campioni venivano poi diluiti alla concentrazione richiesta per l'amplificazione PCR a valle. I campioni di DNA di alta qualità mostravano tipicamente una banda distinta sull'elettroforesi del gel di agarosio ed erano sufficientemente concentrati per le successive procedure di amplificazione.
Amplificazione PCR della regione 16S rDNA V3–V4
La regione ipervariabile V3–V4 del rDNA batterico 16S è stata amplificata utilizzando primer con codice a barre. Le sequenze di innesco erano le seguenti: primer frontale 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′ e primer inverso 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. Le reazioni PCR sono state preparate su ghiaccio in un volume finale di 20 μL contenente 4 μL di tampone PCR, 2 μL di miscela di nucleotidi (2,5 mmol/L), 0,8 μL ciascuno di primer avanti e inversi (5 μmol/L), 0,4 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà, 10 ng di DNA modello e acqua senza nucleasi fino al volume. Le miscele di reazione venivano delicatamente miscelate tramite pipetaggio e brevemente centrifugate per raccogliere il liquido sul fondo del tubo. L'amplificazione PCR è stata eseguita utilizzando le seguenti condizioni di ciclaggio: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 minuti, seguita da 25 cicli di denaturazione a 95 °C per 30 secondi, ricottura a 55 °C per 30 secondi ed estensione a 72 °C per 30 secondi, con un passo finale di estensione a 72 °C per 10 minuti. Per minimizzare il bias di amplificazione, ogni campione veniva amplificato in reazioni triplice, e i prodotti PCR risultanti dallo stesso campione venivano successivamente aggregati in un unico tubo. L'amplificazione efficace è stata confermata dalla presenza di una banda amplicon chiara della dimensione prevista sull'elettroforesi del gel di agarosio.
Verifica e purificazione del prodotto PCR
I prodotti PCR sono stati verificati utilizzando elettroforesi su gel di agarosio al 2%. I prodotti PCR combinati di ciascun campione sono stati caricati sul gel ed elettroforizzati fino a quando le bande dell'amplicon bersaglio sono state chiaramente separate. Le bande corrispondenti alla dimensione prevista dell'amplicon venivano rimosse usando una lama pulita e sterile e purificate con un kit di estrazione al gel secondo le istruzioni del produttore elencate nella Tabella dei Materiali. I prodotti PCR purificati sono stati successivamente eluzionati in acqua tampone di eluzione o senza nucleasi. La concentrazione di ciascun prodotto PCR purificato veniva quantificata utilizzando un sistema di quantificazione del DNA basato su fluorescenza e i valori di concentrazione venivano registrati per la preparazione della libreria a valle. L'amplificazione e la purificazione riuscite sono state confermate da una singola banda trasparente alla dimensione prevista dell'amplicon sull'elettroforesi del gel di agarosio.
Preparazione e raccolta delle biblioteche
Le librerie di sequenziamento sono state preparate utilizzando un kit di preparazione della libreria di DNA secondo le istruzioni del produttore elencate nella Tabella dei Materiali. Le sequenze degli adattatori di sequenziamento venivano legate agli amplicon purificati seguendo il flusso di lavoro standard di preparazione della libreria. I prodotti legati con adattatore venivano successivamente purificati utilizzando l'estrazione su gel o un metodo di purificazione a perla, a seconda del protocollo di preparazione della libreria selezionato. I prodotti purificati della biblioteca sono stati valutati utilizzando elettroforesi gel di agarosio al 2% per confermare la distribuzione corretta dei frammenti. Le concentrazioni in biblioteca sono state quantificate utilizzando un sistema di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza. In base alla concentrazione di DNA e alla dimensione dei frammenti, ogni libreria è stata normalizzata alla stessa concentrazione molare per garantire una profondità di sequenziamento equilibrata tra i campioni. Quantità molari uguali di singole librerie sono state poi aggregate in un rapporto 1:1 per generare il pool finale di librerie di sequenziamento. Prima del sequenziamento, la libreria aggregata veniva denaturata secondo il protocollo della piattaforma di sequenziamento prima del caricamento del campione. Le librerie considerate adatte al sequenziamento hanno mostrato una chiara distribuzione dei frammenti all'interno dell'intervallo di dimensioni attese e una concentrazione sufficiente per l'analisi di sequenziamento a valle.
Sequenziamento a estremità accoppiata
La libreria aggregata finale veniva caricata su una piattaforma di sequenziamento a estremità abbinata secondo le procedure operative standard del produttore. Il sequenziamento a estremità accoppiata è stato eseguito utilizzando una configurazione di 2 × 250 bp o 2 × 300 bp per garantire una profondità di sequenziamento adeguata e una caratterizzazione completa della diversità microbica in ogni campione. La qualità del sequenziamento è stata monitorata durante tutta la corsa utilizzando metriche di qualità generate dalla piattaforma. Dopo il completamento del sequenziamento, per ogni campione venivano esportati file FASTQ grezzi a seconda del campionato per l'analisi bioinformatica a valle. I dataset di sequenziamento sono stati considerati accettabili quando hanno dimostrato una profondità di lettura sufficiente per campione, punteggi di qualità Q30 appropriati e un'assegnazione di codici a barre riuscita.
Elaborazione di sequenze grezze
I file FASTQ grezzi a coppie venivano importati in una pipeline di analisi bioinformatica del microbioma per l'elaborazione a valle. Le sequenze venivano demultiplexate in base ai codici a barre assegnati a ciascun campione. Successivamente è stato eseguito un filtraggio di qualità per rimuovere letture contenenti punteggi di bassa qualità, basi ambigue o artefatti di sequenziamento. Le basi di bassa qualità situate alle estremità delle letture sono state ritagliate in base alla distribuzione dei punteggi di qualità per migliorare l'affidabilità complessiva della sequenza. Dopo il controllo qualità, le letture a pari sono state unite tra regioni sovrapposte per ricostruire sequenze a lunghezza intera. Solo sequenze fuse di alta qualità sono state mantenute per le analisi successive del microbioma.
Generazione della variante di sequenza dell'amplicon (ASV) e annotazione tassonomica
La denoising delle sequenze veniva eseguita utilizzando un algoritmo di denoising validato, inclusi DADA2 o Deblur, per correggere gli errori di sequenziamento e migliorare l'accuratezza della sequenza. Le sequenze chimeriche sono state identificate e rimosse durante il processo di denoizzing. Successivamente sono state generate sequenze rappresentative di ASV e corrispondenti tabelle di abbondanza ASV per ogni campione. L'assegnazione tassonomica delle sequenze ASV è stata effettuata utilizzando un classificatore Naive Bayes, e l'annotazione tassonomica è stata effettuata con il database di riferimento SILVA 138. Le tabelle di abbondanza tassonomica sono state esportate a livello di phylum, famiglia e genere per l'analisi a valle. Il dataset finale dell'ASV includeva sequenze rappresentative, informazioni sull'abbondanza e corrispondenti annotazioni tassonomiche per ciascun campione.
Analisi della diversità alfa e beta
Sono stati calcolati indici di diversità alfa, inclusi indici di Chao, ACE, Shannon, Simpson e Coverage, per valutare la diversità e la ricchezza microbica all'interno del campione. Gli indici di diversità alfa sono stati espressi come media ± deviazione standard. La normalità dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro–Wilk. Le variabili normalmente distribuite sono state confrontate tra i gruppi DM e NM utilizzando i test t di Student, mentre le variabili normalmente distribuite sono state analizzate tramite i test di somma dei rangi di Wilcoxon. Le distanze di diversità beta sono state successivamente calcolate utilizzando una matrice di distanza adatta per valutare le differenze nella composizione delle comunità microbiche tra i campioni. È stata effettuata un'analisi delle coordinate principali (PCoA) per visualizzare le differenze nella struttura della comunità microbica tra i gruppi. Inoltre, è stata condotta un'analisi delle somiglianze (ANOSIM) per determinare se le differenze tra gruppi superassero la variazione intragruppo, e sono stati riportati i corrispondenti valori R e p di ANOSIM. L'analisi della diversità alfa rifletteva la diversità microbica all'interno del campione, mentre l'analisi della diversità beta ha valutato le differenze nella composizione delle comunità microbiche tra i gruppi.
Analisi tassonomica differenziale
La composizione delle comunità microbiche è stata riassunta a livello di phylum, famiglia e genere. Sono stati generati grafici a barre impilate per visualizzare l'abbondanza relativa dei taxa dominanti tra singoli campioni e gruppi di studio. Sono stati ulteriormente costruiti curve Pan/Core e diagrammi di Venn per confrontare ASV condivisi e specifici per gruppo tra i gruppi DM e NM. Le differenze nell'abbondanza dei taxoni tra i gruppi sono state valutate utilizzando i test Wilcoxon di somma dei rangi. Successivamente è stata effettuata un'analisi LEfSe per identificare i taxa microbici che hanno contribuito maggiormente alla discriminazione tra gruppi. L'analisi tassonomica differenziale ha permesso l'identificazione di taxa microbici arricchiti sia nel gruppo DM che nel gruppo NM.
Previsione funzionale
PICRUSt2 o una pipeline di previsione funzionale validata equivalente è stata utilizzata per dedurre percorsi funzionali microbici dai profili di sequenziamento 16S rDNA. I dati di abbondanza di ASV sono stati normalizzati secondo i requisiti della pipeline analitica selezionata e le funzioni previste sono state mappate alle annotazioni dei percorsi KEGG o MetaCyc. Le abbondanze previste delle vie sono state successivamente confrontate tra i gruppi DM e NM. Percorsi significativamente diversi sono stati visualizzati utilizzando mappe di calore o altri approcci grafici appropriati. Le funzioni previste sono state interpretate come potenziale metabolico microbico inferto piuttosto che come abbondanza metabolita misurata direttamente. L'analisi di previsione funzionale ha permesso di identificare vie microbiche candidate che differivano tra i gruppi, inclusi i percorsi associati al metabolismo dei carboidrati e degli amminoacidi.
Analisi di randomizzazione mendeliana
Le statistiche riassuntive dello studio di associazione a livello genomico (GWAS) per il microbiota intestinale sono state ottenute da datasetpubblici 10. I dati di associazione significativa a livello genomico per i taxa microbici sono stati recuperati dal Catalogo GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) del NHGRI-EBI utilizzando numeri di accessione che vanno da GCST90032172 a GCST90032644. Ulteriori dati metagenomici sono stati consultati dalla coorte FINRISK 2002 tramite l'European Genome-Phenome Archive (Research ID: EGAS00001005020). Le statistiche riassuntive GWAS per il diabete mellito di tipo 2 sono state inoltre ottenute dal Catalogo NHGRI-EBI GWAS (numero di accesso: ebi-a-GCST006867). Le varianti genetiche associate ai taxa microbici sono state selezionate come variabili strumentali secondo soglie statistiche predefinite, e sono state escluse varianti nello squilibrio di collegamento. I dataset di esposizione ed esito sono stati armonizzati per garantire un'orientazione allerica coerente. Successivamente è stata eseguita l'analisi randomizzata mendeliana utilizzando il metodo ponderato per varianza inversa (IVW) come approccio analitico principale. Le analisi di sensibilità sono state condotte utilizzando i metodi MR-Egger e mediana ponderata. La forza dello strumento è stata valutata utilizzando la statistica F, mentre l'eterogeneità tra le variabili strumentali è stata accreditata tramite il test Q di Cochran. La pleiotropia orizzontale è stata esaminata utilizzando il test di intercettazione MR-Egger. La correzione di Bonferroni è stata applicata per tenere conto dei confronti multipli. I risultati della randomizzazione mendeliana sono stati interpretati come associazioni geneticamente previste piuttosto che come prove definitive di causalità.
Output dati e endpoint
I risultati analitici finali includevano tabelle di abbondanza ASV, grafici di composizione tassonomica, metriche di diversità alfa, analisi della diversità beta, risultati tassonomici differenziali, profili di vie funzionali previsti e stime di randomizzazione mendeliana. Tutti gli identificatori campionari nei dataset di sequenziamento sono stati verificati per garantire la coerenza con i corrispondenti codici di studio de-identificati. I file di sequenziamento grezzo, le tabelle ASV processate, i risultati statistici e i file sorgente delle figure venivano archiviati per l'analisi a valle e la gestione dei dati. Il protocollo è stato considerato completo una volta generati e verificati con successo dati di sequenziamento di alta qualità, profili tassonomici, metriche di diversità, analisi delle vie funzionali predetti e risultati di randomizzazione mendeliana (Mendelian).
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Le caratteristiche demografiche e cliniche di base della coorte clinica inizialmente selezionata sono presentate nella Tabella 1. Successivamente è stato selezionato un sottogruppo rappresentativo composto da 12 partecipanti di nuova diagnosi T2DM e 12 NM per il sequenziamento del rDNA 16S e le analisi del microbioma a valle.
Valutazione della profondità del sequenziamento
Fu calcolato l'indice di S...
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Negli ultimi anni, il microbioma umano, in particolare quello intestinale, è emerso come un fattore complesso e influente nel metabolismo dell'ospite, nella regolazione immunitaria e nello sviluppo delle malattie. In un ospite sano, il microbiota intestinale contribuisce all'omeostasi immunitaria e all'integrità della barrieraintestinale 11. La disbiosi è stata associata a una serie di condizioni patologiche, tra cui disturbi metabolici, malattie autoimmuni e neop...
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Gli autori affermano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che potesse essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.
CONTRIBUTI DEGLI AUTORI:
Linrui Xie e Kemiao Chen hanno effettuato l'analisi dei dati e redatto il manoscritto. Xican Pan partecipò alla raccolta dei campioni e alle procedure sperimentali. Xuemei Zhong e Xiaoyu Li concepirono e progettarono lo studio, supervisionarono il progetto e rivisitarono criticamente il manoscritto. Tutti gli autori hanno esaminato e approvato il manoscritto finale.
Gli autori ringraziano tutti i partecipanti e il personale coinvolti nella raccolta dei campioni e nell'elaborazione dei dati per i loro contributi a questo studio.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Primer universali per la regione 16S batterica |
| Freezer 80 °C | Haier Biomedical | DW-86L626 | Conservazione a lungo termine dei campioni |
| Sistema Gel Agarose (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | Validazione del prodotto PCR |
| AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Purificazione del DNA e selezione per dimensione |
| Tubes per Bead-beating (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Lisis meccanica delle cellule microbiche |
| Workstation bioinformatica | Dell | Precision 7920 | Analisi dei dati utilizzando QIIME2 e R |
| Pipeline DADA2 | Bioconductor | Versione 1.28 | Denoising delle sequenze e generazione ASV; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Versione 2023.5 | Denoising delle sequenze e correzione degli errori; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Repository di dataset metagenomici pubblici; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accessioni GCST90032172–GCST90032644 | Database pubblico di statistiche di associazione su tutto il genoma; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Sistema di sequenziamento Illumina MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento |
| Database KEGG | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Versione 107 | Database di annotazione di percorsi funzionali; https://www.genome.jp/kegg |
| Database MetaCyc | SRI International | Versione 27.1 | Database di percorsi metabolici; https://metacyc.org |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5424R | Centrifughe di raffreddamento per la preparazione dei campioni |
| Kit di preparazione della libreria Nextera XT | Illumina | 20018705 | Preparazione della libreria per il sequenziamento |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Per PCR ad alta fedeltà |
| Termociclatore PCR | Bio-Rad | T100 | Strumento di amplificazione PCR |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Versione 2.5.2 | Predizione di percorsi funzionali dai dati di sequenziamento 16S rDNA; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Estrazione del DNA da campioni di feci |
| Kit di estrazione del gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | Purificazione del DNA dal gel di agarosio |
| Fluorometro Qubit | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantificazione del DNA |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Versione 4.3.1 | Analisi statistica e analisi di randomizzazione mendeliana; https://www.r-project.org |
| Database SILVA 138 | SILVA ribosomal RNA database project | Versione 138 | Database di riferimento per l'annotazione tassonomica; https://www.arb-silva.de |
| Tubo per la raccolta di feci | Sarstedt | 76.9923.001 | Tubo sterile per la raccolta di campioni di feci |
| Kit per l'estrazione del DNA fecale | Omega | D4015-02 | Kit per l'estrazione del DNA |
| Pacchetto TwoSampleMR | MR-Base | Versione 0.5.7 | Analisi di randomizzazione mendeliana in R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |