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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Liyuan, Collegio Medico Tongji, Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong [Approvazione n.: 2026IEC(RYJ016)]. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato e la raccolta e l'uso dei campioni clinici sono stati conformi alle linee guida etiche pertinenti della Dichiarazione di Helsinki. I principali materiali sperimentali e strumenti utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Raccolta di campioni di tessuto clinico e rilevamento dell'espressione di CDCP1
Campioni chirurgici di tessuto sono stati raccolti da sette pazienti diagnosticati con carcinoma nasofaringeo nel nostro ospedale tra gennaio 2019 e dicembre 2019. Contemporaneamente, sono stati raccolti come controlli campioni di tessuto nasale di sei pazienti con rinite. Tutti i campioni di tessuto venivano immediatamente congelati in azoto liquido dopo la raccolta per l'estrazione successiva di RNA.
Estrazione di RNA e rilevamento quantitativo PCR in tempo reale
L'RNA totale è stato estratto da campioni di tessuto secondo le istruzioni del produttore. Per ogni campione, 50–100 mg di tessuto venivano processati su ghiaccio in 1 mL di reagente di estrazione utilizzando un omogeneizzatore tissutale. L'omogeneizzazione è stata eseguita per 30 secondi e ripetuta 3 volte per garantire la completa interruzione del tessuto. Dopo la rottura del tessuto, ogni lisato riceveva 200 μL di cloroformio. I tubi venivano agitati vigorosamente con vortici per 15 secondi, mantenuti a temperatura ambiente per 3 minuti, e poi fatti ruotare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per separare le fasi. Lo strato acquoso trasparente è stato rimosso senza disturbare l'interfase e trasferito in un nuovo tubo.
L'RNA veniva recuperato da questa frazione acquosa aggiungendo isopropanolo a un rapporto volumetrico di 1:1. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, i campioni sono stati centrifugati a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C per pelletare l'RNA. Il soprantantante è stato scartato e il pellet è stato risciacquato una volta con 1 mL di etanolo al 75%. Dopo un secondo passaggio di centrifugazione a 7.500 × g . per 5 minuti a 4 °C, il lavaggio all'etanolo è stato rimosso. Il pellet di RNA è stato poi essiccato all'aria per 5–10 minuti a temperatura ambiente e risospeso in 20 μL di acqua priva di RNasi. La quantità e la purezza dell'RNA sono state determinate spettrofotometricamente.
Per la preparazione del cDNA, è stato utilizzato 1 μg di RNA totale per la trascrizione inversa. La reazione è stata eseguita a 37 °C per 15 minuti e poi riscaldata a 85 °C per 5 secondi. Successivamente è stata condotta una PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) con TB Green Premix Ex Taq II su un sistema PCR in tempo reale. Ogni reazione da 20 μL conteneva 2 μL di modello di cDNA, primer avanti e indietro a 0,4 μmol/L ciascuno, 10 μL di SYBR Green premix e acqua priva di nucleasi. Il protocollo di amplificazione iniziava con la denaturazione a 95 °C per 30 secondi. A questo seguivano 40 cicli, ciascun ciclo composto da 95 °C per 5 secondi e 60 °C per 30 secondi per ricottura/estensione. Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 1.
Rilevamento immunoistochimico dell'espressione proteica CDCP1
I campioni di tessuto sono stati prima fissati al 4% di paraformaldeide per 24 ore, seguiti da disidratazione standard, inglobazione di paraffina e preparazione di sezioni spesse 4 μm. Le sezioni di paraffina sono state poi trattate con xilene per rimuovere la paraffina e reidratate in modo sequenziale tramite soluzioni di etanolo gradate. Per la smascheratura degli antigeni, le vetrine venivano inserite in un tampone di citrato (pH 6,0) e riscaldate in una pentola a pressione per 3 minuti dopo che la soluzione raggiungeva l'ebollizione. L'attività endogena della perossidasi è stata stemperata esponendo le sezioni al 3% di perossido di idrogeno per 10 minuti.
Dopo il blocco dell'attività enzimatica endogena, le sezioni sono state incubate durante la notte a 4 °C con l'anticorpo primario anti-CDCP1 diluito a 1:200. Il giorno seguente, le vetrine sono state trattate con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano per 30 minuti a temperatura ambiente. La visualizzazione del segnale è stata effettuata utilizzando un kit di substrato DAB, e le sezioni sono state successivamente controcolorate con ematossilina. Infine, le vetrine furono disidratate, montate ed esaminate al microscopio ottico.
Coltura cellulare e raggruppamento
Le cellule del carcinoma nasofaringeo umano CNE2 e HK1 sono state mantenute in DMEM ad alto livello di glucosio integrato con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-estreptomicina. Le cellule sono state coltivate a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO₂. Quando le cellule hanno raggiunto una confluenza del 70%–80%, sono state trasfettate secondo i seguenti gruppi: Gruppo di controllo (Controllo): trasfettate con vettore vuoto o siRNA di controllo negativo; Gruppo di sovraespressione CDCP1 (CDCP1-OE): trasfestato con plasmide di sovraespressione CDCP1 ; Gruppo silenziante CDCP1 (si-CDCP1): trasfestato con siRNA CDCP1 ; Gruppo sperimentale di soccorso (CDCP1-OE + U0126): trattato con l'inibitore specifico ERK1/2 U0126 (10 μmol/L) per 48 ore sulla base della sovraespressione del CDCP1 .
La trasfezione è stata effettuata secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state placcate 24 ore prima della trasfezione in piastre a 6 pozzi a 2 × 105 cellule per pozzo, con ciascun pozzo contenente 2 mL di mezzo privo di antibiotici. La trasfezione è iniziata quando le colture hanno raggiunto circa il 70% di confluenza. Il mezzo di coltura veniva quindi rimosso e sostituito con un mezzo fresco senza siero. Per ogni pozzo, sono stati preparati separatamente 2 μg di DNA plasmidico o 100 pmol di siRNA da 5 μL di reagente di trasfezione, con ogni componente diluito in 250 μL di mezzo contenente siero ridotti. Entrambe le miscele sono state mantenute a temperatura ambiente per 5 minuti. L'acido nucleico diluito e il reagente di trasfezione sono stati poi combinati e lasciati riposare per 20 minuti a temperatura ambiente per generare i complessi di trasfezione. Questi complessi venivano aggiunti alle cellule a gocce, distribuiti delicatamente nel pozzo e incubati insieme alle cellule per 6 ore. Una volta completato il periodo di incubazione, la miscela di trasfezione veniva rimossa e le cellule venivano fornite con un mezzo completo contenente il 10% di FBS.
Saggio di proliferazione cellulare
A 48 ore dopo la trasfezione, le cellule CNE2 e HK1 di ciascun gruppo sono state raccolte e seminate in piastre da 96 pozzi a una densità di 3 × 10 celleda 3 per pozzo con 100 μL di mezzo per pozzo, con cinque pozzi replicati per gruppo. Dopo che le cellule erano state coltivate per 24, 48 o 72 ore, sono stati aggiunti 10 μL di soluzione MTT a 5 mg/mL in ciascun pozzo. Le placche sono state poi nuovamente incubate a 37 °C con il 5% di CO₂ per altre 4 ore. Dopo questa incubazione, il soprandanante della coltura veniva accuratamente scartato e venivano aggiunti 100 μL di dimetilsolfosido (DMSO) a ciascun pozzo per sciogliere i cristalli di formazan. I piatti sono stati agitati per 10 minuti per garantire la completa dissoluzione. L'assorbanza veniva quindi registrata con un lettore di micropiastre a 570 nm, utilizzando 630 nm come lunghezza d'onda di riferimento.
Test sull'attività dell'apoptosi
A 48 ore dalla trasfezione, sono state prelevate cellule CNE2 da ciascun gruppo e l'attività della Caspasi-3 è stata rilevata utilizzando un kit di analisi di attività Caspasi-3 secondo le istruzioni del produttore. Un totale di 100 μL di tampone di lisi è stato aggiunto a 1 × 106 celle, lisato sul ghiaccio per 15 minuti, e poi centrifugato a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante risultante fu trasferito per analisi successive. Per il saggio Caspasi-3, ogni pozzo ha ricevuto 50 μL di tampone di reazione e 5 μL di substrato Caspasi-3 (DEVD-pNA). La piastra veniva poi mantenuta a 37 °C per 2 ore e l'assorbanza misurata a 405 nm con un lettore di microplacche.
Analisi del western blot
A 48 ore dalla trasfezione, sono state prelevate cellule CNE2 e HK1 di ciascun gruppo sperimentale per l'estrazione proteica. Le cellule sono state interrotte nel tampone RIPA contenente inibitori della proteasi e mantenute sul ghiaccio per 30 minuti. I lisati risultanti furono centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C, dopo di che furono raccolte le frazioni soprantantanti. La concentrazione proteica è stata misurata con un kit di analisi delle proteine BCA.
Per l'analisi western blot, 30 μg di proteina totale da ciascun campione sono stati miscelati con 5x load cushioner e riscaldati a 100 °C per 10 minuti per denaturare le proteine. I campioni sono stati separati su gel SDS-PAGE al 10% a 120 V per 90 minuti, seguiti da un trasferimento su membrane PVDF a corrente costante di 300 mA per 90 minuti. Dopo il trasferimento, le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente.
Le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro CDCP1 (1:1.000), E-cadherin (1:1.000), Vimentina (1:1.000), p-ERK1/2 (1:2.000), ERK1/2 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000).
Il giorno seguente, le membrane sono state risciacquate in TBST 3 volte, con ogni lavaggio della durata di 10 minuti. Sono stati quindi esposti ad anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo tre ulteriori lavaggi TBST, i segnali proteici sono stati visualizzati utilizzando un substrato di chemiluminescenza ECL. L'intensità della banda veniva misurata con il software ImageJ e il GAPDH veniva utilizzato come controllo di normalizzazione.
Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati condotti indipendentemente 3 volte. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard (DS). Le differenze tra più gruppi sono state valutate tramite analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), e il metodo di Tukey è stato utilizzato per confronti post hoc a coppie. Un valore P di < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.