Articolo di ricerca

Meccanismi molecolari comuni e bersagli di farmaci candidati nel diabete mellito di tipo 2 e nelle malattie cardiovascolari aterosclerotiche

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DOI:

10.3791/70237

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4 agosto 2026

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1Department of Cardiology, Ningxia Gem Flower Hospital, 2Department of General Surgery, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 3Department of Anesthesiology, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 4Department of Orthopedics, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha identificato geni condivisi, vie biologiche, associazioni immunitarie e potenziali bersagli terapeutici alla base del diabete mellito di tipo 2 e delle malattie cardiovascolari aterosclerotiche attraverso bioinformatica integrata e validazione sperimentale.

Abstract

Questo studio ha esaminato i meccanismi alla base della comorbidità tra diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e malattia cardiovascolare aterosclerotica (ASCVD), identificando al contempo potenziali bersagli terapeutici. I geni comuni espressi differenzialmente (C-DEG) tra T2DM e ASCVD sono stati estratti dai dataset GSE78721 e GSE12288. Sono state condotte analisi di arricchimento delle vie di interazione proteina-proteina (PPI) tra l'Ontologia Genica (GO) e la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), la costruzione di reti di interazione proteina-proteina (PPI), l'identificazione dei geni hub e l'analisi del Drug-Gene Interaction Database (DGIdb). L'associazione tra i C-DEG hub e le cellule immunoinfiltranti è stata analizzata utilizzando il metodo CIBERSORT. I livelli di espressione dei C-DEG hub sono stati quantificati tramite qRT-PCR e analisi Western blot. Sono stati identificati in totale 32 C-DEG, comprendenti 20 geni a aumento e 12 a sottoregolazione. I C-DEG erano prevalentemente arricchiti in vie chiave, tra cui miocardite virale, cardiomiopatia ventricolare destra aritmogena, cardiomiopatia ipertrofica e cardiomiopatia dilatata. L'analisi PPI ha rivelato 29 nodi e 39 archi, portando all'identificazione di otto C-DEG hub (HSP90B1, PLAU, SLPI, TOP3A, NCF4, PRF1, TUBA1C e CS) in entrambi i dataset. Inoltre, i C-DEG hub (TOP3A, SLPI, NCF4, PRF1 e PLAU) hanno dimostrato correlazioni significative con i livelli cellulari immunoinfiltranti. I farmaci specificamente rivolti a questi centri C-DEG rappresentano candidati promettenti per il trattamento del T2DM e dell'ASCVD. Inoltre, l'espressione di C-DEG hub sia a livello di mRNA che di proteina è stata convalidata nei pazienti con T2DM e ASCVD. Un'analisi bioinformatica integrata ha facilitato lo screening di bersagli, meccanismi e farmaci terapeutici candidati per T2DM e ASCVD, offrendo nuove intuizioni sulle terapie molecolari per queste condizioni.

Introduzione

Il diabete mellito (DM) è una malattia cronica con un'eziologia complessa influenzata da vari fattori genetici e ambientali, che attualmente colpisce circa 463 milioni di persone nel mondo, con una previsione prevista a 700 milioni entro il 2045 1,2. Il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una condizione multifattoriale caratterizzata da resistenza all'insulina e una relativa carenza di insulina dovuta a insufficienza delle cellule beta, che porta a iperglicemia e dislipidemia, rappresentando il 90% dei casi di DM 3,4,5. La resistenza all'insulina rappresenta un precursore chiave di numerose anomalie metaboliche cardiovascolari che complessivamente facilitano lo sviluppo della malattia cardiovascolare aterosclerotica (ASCVD) e possono influenzarne laprognosi 6,7. La malattia coronarica (CAD) deriva principalmente dall'accumulo progressivo di materiale aterosclerotico, causando restringimento luminale e ostruzione del flussosanguigno. L'aterosclerosi è guidata da molteplici fattori, tra cui l'ipercolesterolemia e ildiabete 9,10. I significativi oneri umani e finanziari associati a T2DM e CAD, insieme alle sfide nella loro gestione a lungo termine, evidenziano l'urgente necessità di strategie preventive efficaci.

I pazienti con CAD e T2DM concomitanti affrontano un rischio nettamente più alto di eventicardiaci 11. La malattia cardiovascolare (CVD) è una complicanza comune del DM 2 e rappresenta la principale causa di mortalità tra i pazienti con DM 2, con circa il 32,2% colpito dallaDCV 12. Il sotto-studio LoDoCo2 conferma che il T2DM concomitante è correlato a un aumento del rischio di eventi cardiovascolari avversi gravi nelle popolazioni croniche di CAD13. Le persone con diabete diabetico (T2DM) sono a rischio elevatodi ASCVD 14,15, mentre coloro con CAD cronica che hanno anche diabete portano un rischio significativamente maggiore di eventi cardiovascolarisuccessivi 16, evidenziando un bisogno critico e insoddisfatto di opzioni terapeutiche innovative.

Un numero crescente di gruppi di ricerca sta selezionando nuovi geni espressi differenzialmente (DEG) nel T2DM e nell'ASCVD attraverso analisi approfondite dei dati trascritomici provenienti da vari database. Gli sforzi sono focalizzati sull'elucidare il legame tra queste malattie e sull'identificazione di funzioni biologiche efficaci. Studi recenti sulla bioinformatica hanno esplorato il T2DM in relazione ad altre condizioni; ad esempio, Song et al. hanno identificato DEG condivisi tra T2DM eosteoartrite 17, Castillo-Velázquez et al. hanno previsto la relazione tra la malattia di Alzheimer e la DM18, e geni e vie importanti nella DM 2 e nella sindrome dell'ovaio policistico sono stati riconosciuti tramite analisibioinformatica 19. Tuttavia, i meccanismi molecolari che collegano T2DM e ASCVD rimangono poco compresi, evidenziando l'importanza di identificare nuovi potenziali bersagli terapeutici per trattare la progressione di entrambe le condizioni.

Questo studio mira a identificare sistematicamente vie molecolari condivise e potenziali bersagli terapeutici tra T2DM e ASCVD conducendo un'analisi bioinformatica integrata dei dati trascritomici provenienti dai dataset GSE78721 (T2DM) e GSE12288 (ASCVD). Questi dataset sono stati scelti per la fornitura di campioni abbinati di pazienti e di controllo per ciascuna malattia, utilizzando piattaforme microarray comparabili per consentire un'analisi comparativa robusta. L'approccio attuale prevedeva l'identificazione dei DEG comuni (C-DEG), l'esecuzione di analisi di arricchimento funzionale e interazione proteica, la valutazione delle associazioni con l'infiltrazione immunitaria e la previsione di farmaci interagenti. Inoltre, è stata effettuata una validazione sperimentale preliminare. Questo lavoro fornisce nuove intuizioni e obiettivi candidati per comprendere la comorbidità tra T2DM e ASCVD.

Protocollo

Questo protocollo di studio è stato esaminato e approvato dal Comitato di Revisione Istituzionale della Ningxia Medical University per l'etica (Numero di riferimento del Consiglio di Revisione Interno: Etica [2023]-YCSKT-002) e si conformava ai principi delineati nella Dichiarazione di Helsinki. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti coinvolti nello studio prima della loro partecipazione.

Fonti di dati di espressione per T2DM e ASCVD

I dati di espressione genica per T2DM e ASCVD sono stati ottenuti rispettivamente dai dataset GSE78721 e GSE12288, forniti dal database GEO. Entrambi i dataset utilizzavano dati di microarray provenienti dalle piattaforme [PrimeView] Affymetrix Human Gene Expression Array e [HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A. Il dataset GSE78721 includeva dati di espressione di 68 pazienti con T2DM e 62 campioni normali (dettagli nella Tabella Supplementare 1), mentre il dataset GSE12288 comprendeva dati di espressione provenienti da 110 campioni di ASCVD e 112 controlli normali (dettagli nella Tabella Supplementare 2). Le sonde geniche venivano convertite nei loro corrispondenti simboli genici in base alle informazioni di annotazione della piattaforma.

Identificazione di geni espressi differenzialmente in T2DM e ASCVD

Dopo aver scaricato i dati dal database GEO, le matrici di espressione grezze per T2DM e ASCVD sono state corrette e normalizzate utilizzando il pacchetto software "limma" per identificare i DEG. Per lo screening DEG è stata applicata una soglia di P < 0,05. I risultati delle espressioni differenziali sono stati visualizzati utilizzando i pacchetti R 'heatmap' e 'ggplot2' per generare rispettivamente una heatmap e un grafico vulcanico. I C-DEG tra T2DM e ASCVD sono stati identificati tramite un diagramma di Venn.

Analisi funzionali di Ontologia Genica (GO) e analisi di arricchimento delle vie dei C-DEG dalla Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)

Le funzioni e le vie biologiche sono state determinate tramite analisi di arricchimento delle vie GO e KEGG. L'organizzazione del pacchetto R. Hs.eg.db veniva utilizzato per convertire i nomi C-DEG in ID genici, e l'analisi di arricchimento GO veniva eseguita utilizzando i pacchetti R clusterProfiler, enrichplot, ggplot2 e GOplot per esplorare funzioni biologiche comuni dei C-DEG. Successivamente, è stata condotta un'analisi KEGG per identificare vie significative condivise coinvolte nei meccanismi molecolari alla base della comorbidità tra T2DM e ASCVD. I risultati dell'arricchimento GO e KEGG sono stati presentati in grafici a barre che illustrano il conteggio genico, le descrizioni funzionali e i valori P , con la significatività statistica definita come P < 0,05.

Analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI) dei C-DEG

In questo studio sono stati definiti i C-DEG e i geni hub come geni condivisi. Per valutare le associazioni funzionali tra questi geni condivisi, è stata costruita una rete PPI utilizzando il database STRING (https://string-db.org). L'analisi è iniziata selezionando "Multiple proteins" sotto la funzione "SEARCH" e inserendo i nomi C-DEG specificando la specie come "Homo sapiens." I parametri base per i C-DEG sono stati configurati per visualizzare la rete regolatoria PPI. La visualizzazione della rete PPI è stata effettuata utilizzando il software Cytoscape (versione 3.9.1) (https://apps.cytoscape.org/), fornendo una rappresentazione grafica delle interazioni tra i C-DEG. I C-DEG hub sono stati identificati all'interno della rete PPI utilizzando il plugin CytoHubba in Cytoscape, basandosi sull'algoritmo di classificazione Degree.

Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie

Per esaminare le differenze nell'infiltrazione delle cellule immunitarie tra il gruppo T2DM e il gruppo di controllo normale, è stato impiegato il metodo CIBERSORT per valutare l'abbondanza dei vari tipi di cellule immunoinfiltranti. L'algoritmo di test di Wilcoxon è stato successivamente applicato per confrontare le proporzioni di queste cellule immunitarie infiltranti tra campioni di T2DM e di controllo, facilitando la valutazione delle differenze osservate. La visualizzazione dei dati è stata ottenuta tramite grafici di violino. Per validare la correlazione tra C-DEG e cellule immunoinfiltranti, sono stati utilizzati pacchetti R come limma, scales, tidyverse e ggplot2 per calcolare i coefficienti di correlazione di Spearman. Questo passaggio quantificò la relazione tra l'espressione di C-DEG e i livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie, con i risultati mostrati come mappe termiche. Un valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Analisi dell'interazione dei C-DEG hub con potenziali farmaci mirati

Il Drug-Gene Interaction Database (DGIdb) fornisce un catalogo completo delle interazioni farmaco-gene e dei profili genetici di agenti terapeutici approvati e potenziali. In questo studio, l'elenco dei C-DEG hub è stato inserito nel database per recuperare informazioni di interazione tra i C-DEG hub e i loro potenziali farmaci mirati, che sono stati poi visualizzati tramite il software Cytoscape.

Validazione sperimentale dei geni core tramite campioni clinici

Per convalidare sperimentalmente i geni centrali, sono stati raccolti campioni di sangue periferico da soggetti clinici. La coorte di studio includeva un gruppo sperimentale e un gruppo di controllo. Il gruppo sperimentale era composto da 15 pazienti diagnosticati sia con T2DM che con ASCVD, rappresentando una condizione comorbida. Il gruppo di controllo era composto da 10 volontari sani, compatibili con età e sesso, senza una storia di diabete, malattie cardiovascolari o altre gravi malattie sistemiche. Tutti i pazienti del gruppo sperimentale sono stati diagnosticati in modo definitivo seguendo linee guida cliniche consolidate per il T2DM e l'ASCVD.

Reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR)

L'RNA totale è stato isolato usando il reagente TRIzol e il cDNA di primo filamento è stato sintetizzato con un kit del sistema di trascrizione inversa. Il cDNA è stato poi diluito per qRT-PCR utilizzando il Master Mix SYBR-green PCR, con il GAPDH che funge da controllo interno. Le variazioni relative della piega nell'espressione sono state calcolate tramite il metodo 2−ΔΔCt . Gli innesci utilizzati per l'analisi erano i seguenti: TUBA1C-avanti: 5′-GACCTCGTGTTGGACCGAAT-3′ e retro: 5′-CGAGGTGAACCCAACCAG-3′; NCF4-avanti: 5′-CTAAGTTTCAAAGCTGGAGATGTG-3′ e retromarcia: 5′-GAATTCCTGAAAGGGCTCCTG-3′; PRF1-avanti: 5′-CCCAGTGGACACACAAAGGTT-3′ e retro: 5′-TCGTTGCGGATGCTACGAG-3′; SLPI-avanti: 5′-CCCTTCCTGTGCTGCTT-3′ e retro: 5′-CCTCCTTGTTGGGTTTGG-3′; HSP90B1 avanti: 5′-CCGAAGAAGAACCTGAAGAG-3′ e retro: 5′-CATCTGTTCCCACATCCATT-3′; PLAU-avanti: 5′-GGGGAGATGAAGTTTGAGGTG-3′ e retromarcia: 5′-GCAATGTCGTTGTGTGGTGGG-3′; GAPDH-avanti: 5′-CAGGGCTGCTTTTAACTGG-3′ e retro: 5′-GGGTGGAATCATATTGGAACA-3′.

Saggio Western blot

La proteina totale è stata isolata, diluita nel tampone di carico e separata dal 10% di SDS-PAGE, seguita dal trasferimento alle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate e sondate con anticorpi primari specifici, tra cui anti-TUBA1C (1:1000, ab222849), anti-HSP90B1 (1:1000, ab238126), anti-NCF4 (1:1000, 14648-1-AP), anti-PRF1 (1:1000, ab256453), anti-SLPI (1:1000, ab46763), anti-PLAU (1:1000, 17968-1-AP) e anti-GAPDH (1:5000, 10494-1-AP). Sono stati applicati anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (1:2000, ab6721), e le bande sono state visualizzate utilizzando substrato chemiluminescente (ECL) potenziato.

Analisi statistica

L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software GraphPad Prism, con i dati presentati come media ± SD. Le differenze tra i gruppi sono state valutate utilizzando il test t di Student, e un valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Identificazione dei DEG

Due dataset, GSE78721 e GSE12288, sono stati utilizzati per l'analisi bioinformatica in questo studio. Nel GSE78721, sono stati identificati in totale 2.266 DEG tra pazienti con DM 2 e campioni normali, comprendenti 1.209 geni con aumento e 1.057 geni sottoregolati (Figura 1A). Nel GSE12288, sono stati verificati 924 DEG tra pazienti con ASCVD e controlli, inclusi 403 geni sovraespressi e 521 sottoregolati (Figura 1C). I primi 50 DEG identificati in entrambi i dataset sono rappresentati nelle mappe di calore mostrate nella Figura 1B,D. Attraverso l'intersezione di questi due dataset, sono stati identificati 32 C-DEG, composti da 20 geni aumentati e 12 sottoregolati (Figura 2A,B).

Arricchimento GO e KEGG dei C-DEG

Per chiarire le funzioni biologiche e le vie chiave associate ai 32 C-DEG, sono state effettuate analisi GO e KEGG. I dieci termini principali relativi al processo biologico (BP), al componente cellulare (CC) e alla funzione molecolare (MF) tra i C-DEG sono presentati nella Figura 3A. Le funzioni BP includono prevalentemente la regolazione dell'attivazione del plasminogeno, la regolazione della fibrinolisi, la regolazione positiva della differenziazione cardiocita, la regolazione negativa del legame proteico e la differenziazione cardioblastica. Le funzioni CC riguardano il complesso endopeptidasi di tipo serina, i complessi proteici coinvolti nell'adesione cellulare-matriciale, il cromosoma condensato, la membrana granulosa specifica e il corpo PML. La MF comprende i costituenti strutturali del citoscheletro, l'attività attivatrice della NADPH ossidasi generatrice di superossidi, l'attività intramolecolare della transferasi (fosfotransferasi), l'attività di esopeptidasi di tipo serina e il legame all'IgG (Figura 3A). In termini di analisi KEGG, i C-DEG sono stati principalmente coinvolti in vie critiche, tra cui miocardite virale, cardiomiopatia ventricolare destra aritmogenica, cascate di complemento e coagulazione, cancro alla prostata, miocardiopatia ipertrofica, cardiomiopatia dilatata, apoptosi, fagosoma e elaborazione delle proteine nel reticolo endoplasmatico (Figura 3B).

Costruzione di reti PPI e screening genico hub

Tra i 32 C-DEG, tre geni non hanno mostrato interazioni note con altri C-DEG nel database STRING e sono stati quindi esclusi dalla costruzione della rete PPI. La piattaforma STRING è stata utilizzata per l'analisi PPI dei restanti 29 C-DEG, rivelando una rete composta da 29 nodi e 39 archi, visualizzata tramite Cytoscape (Figura 4A). Successivamente, otto C-DEG dell'hub (HSP90B1, PLAU, SLPI, TOP3A, NCF4, PRF1, TUBA1C e CS) sono stati identificati in base al loro grado di connettività (Figura 4B).

Differenze nell'infiltrazione delle cellule immunitarie e la loro correlazione con i C-DEG hub

Questa analisi si è concentrata esclusivamente sul dataset T2DM (GSE78721) per indagare preliminarmente i cambiamenti nel microambiente immunitario nel contesto del T2DM e la loro relazione con i geni hub. Sono stati utilizzati grafici di violino per visualizzare la relazione tra il dataset T2DM e i livelli di infiltrazione di 22 tipi di cellule immunitarie (Figura 5A; dettagli nella Tabella Supplementare 3). L'analisi di infiltrazione delle cellule immunitarie ha indicato una proporzione più alta di cellule dendritiche attivate nel gruppo T2DM rispetto al gruppo di controllo (P = 0,049), mentre la proporzione di cellule dendritiche a riposo era significativamente più bassa nel gruppo T2DM (P = 0,023). Inoltre, la relazione tra i livelli di espressione degli otto C-DEG hub e i livelli di infiltrazione dei 22 diversi tipi di cellule immunitarie è stata visualizzata utilizzando una mappa termica (Figura 5B). In particolare, l'espressione di TOP3A ha mostrato una forte correlazione positiva con il livello di infiltrazione delle cellule T regolatorie (Treg) (P < 0,001), mentre l'espressione della SLPI era fortemente correlata positivamente all'infiltrazione delle cellule T gamma delta (P < 0,001). Al contrario, l'espressione di NCF4 ha mostrato una forte correlazione negativa con il livello di infiltrazione delle cellule NK attivate (P < 0,001), l'espressione di PRF1 è stata fortemente correlata negativamente con il livello di infiltrazione dei macrofagi M2 (P < 0,001), e l'espressione di PLAU è stata fortemente correlata negativamente al livello di infiltrazione delle cellule B naïve (P < 0,001).

Rete candidata di farmaco target per hub C-DEG

Tra gli otto C-DEG hub identificati, CS e TOP3A non erano elencati come target di farmaci noti nel database DGIdb e quindi esclusi dall'analisi successiva di rete farmaco-target candidato. Per identificare farmaci con potenziali ruoli terapeutici nel T2DM e nell'ASCVD, i restanti sei C-DEG hub sono stati inviati al database DGIdb (dettagli nella Tabella Supplementare 4). Successivamente, Cytoscape è stato utilizzato per costruire una rete candidato farmaco-target che illustra le associazioni tra i C-DEG hub e i farmaci target candidati (Figura 6). Questa rete comprendeva sei C-DEG hub, 136 farmaci molecolari e 137 bordi. In particolare, sono stati identificati rispettivamente 82, 5, 3, 4, 1 e 42 farmaci target candidati per TUBA1C, NCF4, PRF1, SLPI, HSP90B1 e PLAU, con la maggioranza classificata come agenti antineoplastici, antinfiammatori e agenti antitrombotici.

Validazione dell'espressione dei C-DEG hub

A causa dell'assenza di CS e TOP3A come target candidati di farmaci nel database DGIdb e delle loro funzioni biologiche meno direttamente correlate alle strategie terapeutiche nel contesto della ricerca su T2DM e ASCVD, lo studio si è concentrato sui restanti sei centri C-DEG hub (HSP90B1, PLAU, SLPI, NCF4, PRF1 e TUBA1C) per la validazione sperimentale. Per approfondire i ruoli di questi C-DEG hub, sono stati condotti saghi qRT-PCR e western blot per valutare i livelli di espressione dei geni core tra diversi gruppi (Figura 7 e Figura 8). I livelli di espressione di TUBA1C, NCF4, SLPI, HSP90B1 e PLAU sono stati significativamente aumentati nei pazienti con T2DM e ASCVD rispetto ai gruppi di controllo sani corrispondenti, mentre l'espressione di PRF1 era sottoregolata. Questi risultati suggeriscono che questi geni fondamentali possano svolgere un ruolo significativo nella progressione dei pazienti con T2DM e ASCVD.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:I dataset di espressione genica GSE78721 e GSE12288 utilizzati per l'analisi bioinformatica in questo studio sono disponibili nel database pubblico NCBI GEO. I dati grezzi della parte di validazione sperimentale generati in questo studio sono forniti nel File Supplementare 1.

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Figura 1: Identificazione dei DEG nei dataset GSE78721 e GSE12288. (A,C) I grafici vulcanici dei DEG in GSE78721 e GSE12288, rispettivamente. |logFC|≥ 0,5 e P < 0,05 sono stati stabiliti come soglia di screening; i geni con regolazione al rialzo erano contrassegnati come rossi, mentre quelli con regolazione al ribasso erano contrassegnati come verdi. (B,D) Heatmap dei primi 50 DEG di GSE78721 e GSE12288, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Diagramma di Venn dei C-DEG da due dataset. (A) Diagramma di Venn dei C-DEG alzati da T2DM e ASCVD in dataset GSE78721 e GSE12288. (B) Diagramma di Venn dei C-DEG ridimensionati da T2DM e ASCVD in dataset GSE78721 e GSE12288. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi funzionale e di arricchimento delle vie dei C-DEG. Grafici a barre delle analisi di arricchimento GO (A) e KEGG (B). Le coordinate verticali indicano la descrizione di diversi elementi GO o percorsi KEGG, mentre le coordinate orizzontali indicano il numero di C-DEG arricchiti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Screening genico della rete PPI e hub dei C-DEG. (A) La rete PPI dei C-DEG. Il rosso e il blu rappresentano rispettivamente i C-DEG al rialzo e al rialzo. (B) Otto geni hub sono stati identificati tra i C-DEG. I nodi rappresentano un C-DEG, e gli archi rappresentano l'interazione tra i C-DEG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitari. (A) Differenze nell'infiltrazione di 22 tipi di cellule immunitarie tra il gruppo T2DM e il gruppo di controllo. Asse orizzontale: sottotipi di cellule immunitarie; Asse verticale: livello relativo di infiltrazione delle cellule immunitari. (B) Mappa termica di correlazione tra l'espressione di 8 C-DEG hub e i livelli di infiltrazione di 22 tipi di cellule immunitarie. Quadrati rossi: correlazione positiva; Quadrati blu: correlazione negativa. I colori più scuri indicano correlazioni più forti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Rete farmaco-target candidata per sei C-DEG hub. I nodi rossi rappresentano i C-DEG dell'hub, i nodi verdi rappresentano farmaci candidati mirati, e i bordi tra di essi rappresentano coppie di interazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Validazione dell'espressione genica principale nei pazienti con T2DM e ASCVD tramite qRT-PCR. I livelli di espressione dell'mRNA di HSP90B1 (A), PLAU (B), SLPI (C), NCF4 (D), PRF1 (E) e TUBA1C (F) sono stati rilevati tramite qRT-PCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Validazione dell'espressione genica centrale in pazienti con T2DM e ASCVD tramite Western blot. I livelli di espressione proteica di HSP90B1 (A), PLAU (B), SLPI (C), NCF4 (D), PRF1 (E) e TUBA1C (F) sono stati rilevati tramite saghi Western blot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1. Matrice di espressione genica per il dataset GSE78721, utilizzata per l'analisi trascritomica T2DM in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2. Matrice di espressione genica per il dataset GSE12288, utilizzata per l'analisi trascritomica ASCVD in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nel dataset GSE78721. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Interazioni candidato farmaco-bersaglio per geni comuni espressi differenzialmente a centro. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: I dati grezzi della parte di validazione sperimentale generati in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il T2DM e l'ASCVD sono malattie complesse, con evidenze emergenti che suggeriscono un'associazione significativa tra le due. La resistenza all'insulina funge da precursore fondamentale di varie anomalie metaboliche cardiovascolari, inclusa la T2DM, che contribuiscono collettivamente allo sviluppo dell'ASCVD e possono influenzarne la prognosi 6,7. Inoltre, la DM è un fattore trainante nella progressione dell'aterosclerosi20. Gli individui con T2DM affrontano un rischio aumentato di CAD21, tuttavia restano domande riguardo ai meccanismi sottostanti della comorbidità. Questo studio mira a esplorare la relazione e i meccanismi che collegano queste due malattie, oltre a identificare potenziali biomarcatori tramite analisi bioinformatica e validazione sperimentale.

In questo studio sono stati identificati in totale 32 C-DEG tra T2DM e ASCVD, comprendenti 20 geni alzati e 12 sottoregolati. Le analisi di arricchimento GO e KEGG hanno rivelato che questi C-DEG erano prevalentemente arricchiti in vie metaboliche critiche strettamente correlate sia al CAD che al T2DM22,23. Otto C-DEG a mozzi (HSP90B1, PLAU, SLPI, TOP3A, NCF4, PRF1, TUBA1C e CS) sono stati schermati nelle due condizioni. In particolare, i C-DEG hub (TOP3A, SLPI, NCF4, PRF1 e PLAU) sono stati significativamente associati ai livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie. HSP90B1 è stata implicata nella progressione del cancro24 e potrebbe anche avere associazioni con il T2DM25. È stato dimostrato che la PLAU svolge un ruolo nella prevenzione dell'invecchiamento vascolare precoce associato al T2DM26 ed è fondamentale nella progressione della placca aterosclerotica, fornendo informazioni per i biomarcatori di allarme precoce e elucidando i meccanismi alla base della progressione della CAD27. L'espressione della SLPI aumenta con una disfunzione metabolicaprogressiva 28 ed è stata identificata come una C-DEG associata a tolleranza al glucosio compromessa e a T2DM29. NCF4 ha stabilito legami con CAD30 e contribuisce alla regolazione dell'attività della NADPH ossidasi e dell'attivazionedell'inflamosoma 31. Grazie al ruolo chiave della PRF1 nel monitoraggio immunitario e nella regolazione32, essa possiede un potenziale diagnostico, distinguendo tra infarto miocardico e CADstabile 33. Inoltre, PRF1 agisce come un attore regolatore immunitario fondamentale nella resistenza all'insulina correlataall'obesità 34. TUBA1C è stato anche associato a tumori ed è collegato all'infiltrazione immunitaria nel microambientetumorale 35. È stato identificato come un gene di suscettibilità per la cardiopatiacoronarica 36. Tuttavia, la relazione tra ASCVD e T2DM rimane poco esplorata.

L'analisi KEGG ha rivelato il coinvolgimento di questi geni candidati in vie come "Supplement and Coagulation Cascades" e "Protein Processing in Endoplasmic Reticulum." La validazione sperimentale di geni chiave all'interno di queste vie, in particolare PLAU (una serina proteasi coinvolta nella fibrinolisi e nella coagulazione) e HSP90B1 (un chaperone endoplasmatico nel reticolo), ne ha confermato la disregolazione nel nostro modello T2DM. Questi risultati collocano la nostra ricerca all'interno di un quadro molecolare specifico, suggerendo che squilibri nella risposta allo stress del reticolo endoplasmatico e nelle vie trombolitiche possano essere parte integrante della patologia diabetica, estendendosi oltre i processi infiammatori ampiamente riconosciuti.

Ricerche approfondite hanno documentato risposte immunitarie disfunzionali nei pazientidiabetici 37. L'attivazione anomala delle cellule immunitarie gioca un ruolo fondamentale nella progressione del T2DM38,39. L'analisi dell'infiltrazione immunitaria ha rivelato una significativa alterazione nel compartimento cellulare dendritico nel T2DM, caratterizzata da una maggiore proporzione di cellule dendritiche attivate e una diminuzione della percentuale di cellule dendritiche a riposo (Figura 5A). Ciò indica uno stato di presentazione antigenica aumentata e attivazione immunitaria nel T2DM, potenzialmente contribuendo a danni infiammatori cronici nei tessuti bersaglio. Inoltre, forti correlazioni osservate tra specifici geni hub (ad esempio, NCF4 con cellule NK attivate, PRF1 con macrofagi M2) (Figura 5B) suggeriscono collegamenti meccanicistici tra l'espressione genica nei tessuti metabolici e la composizione del microambiente immunitario locale, identificando così nuovi obiettivi per interventi immunomodulatori.

Inoltre, è stata effettuata un'analisi della rete farmaco-bersaglio per prevedere potenziali bersagli terapeutici, meccanismi sottostanti e farmaci per il diabete tipo 2 e l'ASCVD. Questa rete farmaco-target candidato comprendeva sei C-DEG centrali, 136 farmaci molecolari e 137 bordi. L'analisi ha prodotto rispettivamente 82, 5, 3, 4, 1 e 42 farmaci candidati bersaglio per TUBA1C, NCF4, PRF1, SLPI, HSP90B1 e PLAU. La maggior parte di questi farmaci è classificata come agenti antineoplastici, antinfiammatori e agenti antitrombotici. In particolare, alcuni farmaci, tra cui Rituximab, Prednisone, antiantisanti, verapamilo, antibiotici, colchicina ed eparina, hanno dimostrato funzioni terapeutiche sia nel T2DM 15,40,41,42,43,44,45,46 che nel CAD 15,47,48,49,50. 51,52,53,54,55, che indicano i loro potenziali effetti terapeutici nei pazienti con diabete tipo 2 e CAD. Inoltre, diversi farmaci come Alendronato sodio, calcitriolo, celecoxib, masoprocol, mifepristone e curcumina hanno dimostrato funzioni terapeutiche specifiche nel T2DM 56,57,58,59,60,61,62,63, che può essere utile anche per l'ASCVD. È stata inoltre condotta la validazione dell'espressione di questi C-DEG hub in T2DM e ASCVD.

Questo studio presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, le dimensioni dei campioni clinici all'interno dell'esperimento di validazione erano insufficienti e dovrebbero essere ampliate. In secondo luogo, sono necessarie ulteriori ricerche sperimentali per fornire preziose informazioni sul legame tra T2DM e ASCVD. I lavori futuri prevederanno la convalida dei risultati con coorti cliniche più ampie e la conduzione di studi sperimentali più completi per chiarire i meccanismi molecolari e le vie patologiche che collegano queste due malattie. Nella sezione di validazione sperimentale, i campioni di pazienti con diabete tipo 2DM e ASCVD sono stati aggregati in un unico "gruppo sperimentale" per il confronto con i controlli sani. Sebbene questo disegno abbia facilitato la validazione dei cambiamenti complessivi di espressione nei C-DEG fondamentali identificati nella condizione comorbida, non distingue se queste alterazioni di espressione siano specifiche per T2DM, ASCVD o condivise da entrambi. Studi successivi dovrebbero confrontare gruppi distinti di pazienti con T2DM, pazienti con ASCVD e individui con comorbidità T2DM con ASCVD per delineare più accuratamente i ruoli specifici di questi geni nelle singole malattie rispetto allo stato comorbido. Inoltre, l'analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie è stata condotta esclusivamente sul dataset T2DM (GSE78721) e non è stata eseguita in parallelo per il dataset ASCVD (GSE12288). Pertanto, le correlazioni riportate tra i C-DEG hub e i livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie (ad esempio, TOP3A con Treg, SLPI con cellule T gamma delta) riflettono solo i loro potenziali ruoli immunomodulatori nel contesto patologico del T2DM. Un'altra limitazione è l'assenza di convalidazione funzionale per le interazioni farmaco-bersaglio previste. Le future indagini dovrebbero includere simulazioni di aggancio molecolare per valutare l'affinità di legame, insieme a esperimenti in vivo utilizzando modelli animali per valutare l'efficacia terapeutica di questi farmaci candidati.

In conclusione, questa analisi bioinformatica integrata, integrata da una validazione sperimentale preliminare, ha identificato diversi geni hub e vie condivise tra T2DM e ASCVD e propone potenziali candidati farmaci che mirano a questi geni. Questi risultati offrono nuove ipotesi e candidati bersagli per ulteriori esplorazioni meccanicistiche e terapeutiche dell'interazione complessa tra T2DM e ASCVD.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Gli autori ringrazionano con gratitudine il sostegno finanziario fornito dal Programma della Fondazione per le Scienze Naturali di Ningxia (Grant n. 2023AAC03498) e dal Progetto di Innovazione Scientifica e Tecnologica Yinchuan (Grant No. 2024SF005). Gli autori ringraziano inoltre tutti i partecipanti e i ricercatori i cui contributi hanno reso possibile questo studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-GAPDHProteintech60004-1-Ig
Anti-HSP90B1Abcam ab238126
Anti-NCF4 Proteintech14648-1-AP
Anti-PLAUProteintech17968-1-AP
Anti-PRF1Abcamab256453
Anti-SLPI Abcamab46763
Anti-TUBA1CAbcam ab222849
CIBERSORT Stanford Universityhttps://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler (R package)Bioconductorhttp://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
CytoHubba (Cytoscape plugin)Cytoscape Consortiumhttps://apps.cytoscape.org
Cytoscape (version 3.9.1)Cytoscape Consortiumhttp://cytoscape.org/
DGIdb
 (Drug-Gene Interaction Database)		Washington Universityhttp://www.dgidb.org/
Enhanced chemiluminescent (ECL) substrate Thermo Fisher Scientific34080
enrichplot (R package)Bioconductorhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/enrichplot.html
Gel imaging system Bio-RadChemiDox XRS
GEO Database
(Datasets: GSE78721, GSE12288)		NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
ggplot2 (R package)CRANhttps://ggplot2.tidyverse.org
GOplot (R package)CRANhttps://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/index.html
GraphPad Prism(version 9.1.2)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
limma (R package)Bioconductorhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
loading bufferBio-Rad1610737
org.Hs.eg.db (R package)Bioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.htm
PVDF membraneBio-Rad1620177
R software (version 4.0.2) R Foundationhttps://www.r-project.org/
Real-time PCR systemBio-RadCFX-96
Reverse Transcription System KitTakaraD6110A
scales (R package)CRANhttps://CRAN.R-project.org/package = scales
SDS-PAGE GelsBio-Rad4561085
Secondary antibodyAbcam ab6721
STRING databasSTRING Consortiumhttps://string-db.org/
SYBR-green PCR Master MixVazyme BiotechCat #Q311-02
tidyverse (R package)CRANhttps://cran.r-project.org/web/packages/tidyverse/index.html
Trans-Blot transfer systemBio-Rad1704150
TRIzol reagentThermo Fisher Scientific #1559602

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