L'analisi trascritomica rivela sottogruppi guidati dal mitocondrio nelle lesioni della dermatite atopica

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

L'analisi trascritomica rivela sottogruppi guidati dal mitocondrio nelle lesioni della dermatite atopica

DOI:

10.3791/70240

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May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dermatite atopica (DA) è una malattia infiammatoria cronica della pelle con una significativa eterogeneità molecolare. Questo studio identifica due sottogruppi trastrastomicamente distinti dell'AD, guidati dall'espressione genica mitocondriale differenziale e dall'infiltrazione immunitaria, e rivela quattro geni hub come potenziali biomarcatori per la stratificazione del paziente.

Abstract

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La dermatite atopica (DA) è una malattia infiammatoria cutanea comune e cronica con prevalenza globale. La sua eterogeneità clinica e i complessi meccanismi molecolari rappresentano sfide significative per lo sviluppo di terapie efficaci. Esplorare l'eterogeneità molecolare dell'AD utilizzando dati trascritomici cutanei lesionali, caratterizzare i loro profili biologici e immunitari e identificare geni chiave alla base della differenziazione. I geni espressi differenzialmente sono stati identificati utilizzando DESeq2, seguiti da analisi di via e co-espressione tramite GSEA e WGCNA, rispettivamente. I geni correlati ai mitocondriali sono stati estratti intersecando DEG e moduli WGCNA con il database MitoCarta3.0, e la loro rilevanza funzionale è stata valutata tramite arricchimento GO e KEGG. I geni hub sono stati identificati tramite analisi di rete di interazione proteina-proteina, che sono stati successivamente utilizzati per costruire un modello di classificazione. I regolatori trascrizionali sono stati previsti utilizzando hTFtarget, mentre l'infiltrazione delle cellule immunitarie è stata quantificata tramite CIBERSORT. Sono stati identificati due sottogruppi molecolari. Il Cluster 1 era arricchito di vie di segnalazione cellulare e adesione, mentre il Cluster 2 mostrava una regolazione all'alza della fosforilazione ossidativa e dei processi correlati ai proteassomi. Un totale di 85 geni associati al mitocondrio, principalmente coinvolti nel metabolismo energetico, sono stati espressi differenzialmente tra i cluster. L'analisi della rete PPI ha identificato quattro geni hub (BAD, BOLA1, CHCHD5 e ISOC2), che sono stati significativamente aumentati nel Cluster 1. Un classificatore basato sul gene hub ha dimostrato un forte potere discriminatorio (area sotto la curva > 0,7). I principali regolatori trascrizionali previsti includevano ATF3, BRD2, BRD4 e CEBPA. Il profiling immunitario ha rivelato un'infiltrazione più elevata delle cellule T regolatorie nel Cluster 1 e un aumento delle cellule T helper follicolari nel Cluster 2. Questo studio rivela due sottotipi di AD molecolare e immunologicamente distinti, caratterizzati da funzionalità mitocondriale differenziale e firme del microambiente immunitario.

Introduction

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La dermatite atopica (DA) è una malattia infiammatoria cutanea comune e cronica che colpisce fino al 20% dei bambini e al 10% degli^adulti. È caratterizzata da prurito intenso e lesioni eczematose^{ricorrenti 2}. Clinicamente, l'AD nasce da un'interazione dinamica tra suscettibilità poligenica (ad esempio, mutazioni di perdita di funzione in GF), disregolazione immunitaria ed esposizioni ambientali come bassa umidità e disbiosi^{microbica 3}. Sebbene l'DA condivida alcune caratteristiche fisiopatologiche con la psoriasi, le loro manifestazioni cliniche sono mutuamente esclusive, con effetti genetici diversi nei percorsi condivisi e alterazioni immunitarie^{distinte 4}.

L'AD è una malattia eterogenea, caratterizzata da profili trascrimicosi diversi tra diversi gruppi di pazienti e sintomi della^{malattia 5}. Analisi integrate dei tessuti cutanei e delle cellule mononucleari del sangue periferico hanno mostrato che caratteristiche cliniche come eritema e papulazione sono associate a firme immunologiche distinte, riflettendo l'interazione tra la pelle locale e le risposte immunitarie^{sistemiche 6}. Studi trascrivomici su larga scala evidenziano ulteriormente il ruolo delle vie di IL-13 nella patogenesi dell'AD, mentre l'AD mostra una maggiore eterogeneità molecolare rispetto alla psoriasi, con variazioni nei modelli di espressione genica legate alla gravità della malattia, all'età di insorgenza e al background^genetico ^5,7. Queste differenze sottolineano la complessità della patogenesi dell'AD e la necessità di approcci personalizzati nella ricerca e nella terapia.

Le proteine mitocondriali svolgono un ruolo importante nella patogenesi dell'AD attraverso lo stress ossidativo e le vie metaboliche disregolate. Gli studi rivelano un aumento dell'attività dei complessi mitocondriali I e II nei cheratinoviti AD non lesionali, che porta a un'ossidazione eccessiva degli acidi grassi a catena lunga e a una produzione elevata di ROS, che aumenta la disfunzione della barriera^epidermica ^8,9. Contemporaneamente, analisi proteomiche identificano proteine ridotte della via antiossidante NRF2 e componenti mitocondriali nell'epidermide dell'AD, riducendo la risoluzione dello stress^{ossidativo 10}. Il danno al DNA mitocondriale contribuisce ulteriormente alle risposte infiammatorie, mentre interventi come l'uso di antiossidanti mirati al mitocondriale dimostrano efficacia nel ripristinare l'omeostasi epidermica mitigando^ROS ^11,12. Questi risultati sottolineano le proteine mitocondriali sia come motori della patologia dell'AD sia come potenziali bersagli terapeutici.

Le recenti analisi del trascritoma dell'AD hanno significativamente avanzato nella comprensione della sua architettura genetica e dell'eterogeneità molecolare. Il primo profiling di sequenziamento RNA dell'AD aveva rivelato l'aumento dell'espressione nella via TREM-1 e nella citochina^{IL-36 13}. L'analisi della rete di coespressione genica pesata basata sul profilo di espressione genica ha ulteriormente rivelato moduli molecolari distinti e geni hub, come HSPA4, LCE3E e LCE3D, che orchestrano risposte infiammatorie e cheratinizzazione, evidenziando potenziali bersagli^{terapeutici 14}. Questi studi sottolineano il valore della trascrittomica multi-tessuto e della modellazione poligenica del rischio nel perfezionare la previsione delle malattie e nello scoprire le complesse basi dell'AD. Tuttavia, gli studi esistenti si sono concentrati prevalentemente sulla trascrittomica complessiva dell'AD senza risolvere specificamente il ruolo dei geni mitocondriali nella definizione dei sottogruppi molecolari. Il presente studio va oltre le precedenti analisi trascristromiche integrando molteplici dataset GEO per identificare sottogruppi AD basati su clustering consensuale e intersecando sistematicamente geni espressi differenzialmente, moduli WGCNA e un catalogo genico mitocondriale curato per individuare geni mitocondriali hub che definiscono l'identità dei sottogruppi e possono fungere da nuovi biomarcatori.

Con l'ipotesi che la pelle lesionale dell'AD ospiti sottogruppi trascrittomici molecolarmente distinti caratterizzati da espressione genica mitocondriale differenziale, che potrebbero essere alla base dell'eterogeneità clinica dell'AD. Per testare ciò, questo studio ha integrato dati di sequenziamento RNA da studi pubblicati e ha raccolto dati di espressione genica di campioni cutanei di lesioni da 266 pazienti con DA. I sottogruppi molecolari sono stati identificati sulla base del raggruppamento consensuale dell'espressione genica, e l'espressione genica è stata confrontata tra i due sottogruppi molecolari. I geni che guidano questa differenza mostrano un arricchimento funzionale nella segnalazione cellulare e nella fosforilazione ossidativa. Inoltre, sono stati esaminati geni mitocondriali che differenziano i due gruppi molecolari e sono stati identificati i geni chiave dell'hub all'interno di una rete di interazione proteina-proteina. Questi risultati evidenziano l'eterogeneità genetica della malattia da AD e ampliano la conoscenza dei ruoli delle proteine mitocondriali nella patologia dell'AD.

Protocol

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Questo studio ha utilizzato dataset di espressione genica disponibili pubblicamente dal database Gene Expression Omnibus (GEO). Non sono stati accessibili dati identificabili dai pazienti e non sono stati raccolti nuovi campioni di pazienti. Pertanto, non era richiesta alcuna approvazione del comitato di revisione istituzionale (IRB) o consenso del paziente per questa analisi secondaria dei dati pubblicamente disponibili. Il software e i database utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1 Dati e risorse

I dati trascritomici dei pazienti con dermatite atopica (AD) sono stati ottenuti dal database GEO, inclusi quattro studi: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ e GSE277961 (N = 43)¹⁷. Tutti i dataset contenevano dati grezzi o pre-normalizzati provenienti da biopsie cutanee lesionali. Le matrici di conteggio grezzo sono state scaricate e integrate tra gli studi. Gli effetti dei lotti di studio incrociato sono stati corretti utilizzando il metodo ComBat-seq (pacchetto sva R, v3.44.0) per armonizzare i profili di espressione tra i quattro dataset GEO prima dell'analisi a valle. Tutti e quattro i dataset si basano su RNA-seq effettuati su campioni di biopsia cutanea umana e sono stati allineati al genoma di riferimento umano GRCh38 utilizzando pipeline specifiche per lo studio. La quantificazione dell'espressione a livello genico è stata effettuata utilizzando l'annotazione genica Ensembl (v105).

2 Clustering consensuale

Il clustering consensuale non supervisionato è stato condotto utilizzando il pacchetto Consensus ClusterPlus R (v1.64.0)¹⁸ per stratificare 266 campioni cutanei lesionali di pazienti con DA sulla base dei profili trascritomici. Prima del clustering, i dati grezzi di conteggio di tutti gli studi venivano uniti e gli effetti dei batch dello studio incrociato venivano corretti utilizzando la funzione removeBatchEffect dal pacchetto limma. I dati di espressione genica sono stati poi trasformati per stabilizzazione della varianza (VST) utilizzando DESeq2 e filtrati per trattenere i primi 5.000 geni più variabili. Il clustering è stato condotto utilizzando clustering gerarchico con correlazione di Pearson e collegamento medio su 1.000 iterazioni, subcampionando l'80% dei campioni per iterazione. Il miglior numero di cluster (k variazioni da 2 a 10) è stato determinato valutando la funzione di distribuzione cumulativa di consenso (CDF), i grafici dell'area delta e i punteggi di consenso per cluster. I cluster risultanti sono stati validati utilizzando heatmap consensuali e PCA e utilizzati in analisi biologiche e cliniche a valle.

3 Analisi differenziale dell'espressione genica

I livelli di espressione genica sono stati confrontati tra i sottogruppi molecolari utilizzando il pacchetto DESeq2 R (v1.46.0)¹⁹. Sono stati inseriti dati grezzi per stimare la dispersione genica e adattarsi a un modello binomiale negativo. I geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati identificati utilizzando il test di Wald, e i risultati sono stati filtrati utilizzando una soglia di significatività di valore p aggiustato < 0,01 e una variazione assoluta log2 volte > 1.

4 Analisi dell'arricchimento degli insiemi genici

L'analisi di arricchimento del set genico (GSEA) è stata eseguita utilizzando il pacchetto clusterProfiler R (v4.12.6)²⁰. Tutti i geni sono stati classificati in base al loro cambiamento log2 multipli dall'analisi di espressione differenziale, e la funzione GSEA è stata applicata con i parametri eps = 0, minGSSize = 10 e maxGSSize = 500, mentre le altre impostazioni sono state mantenute di default. L'arricchimento è stato eseguito contro i set genici MSigDB Hallmark. Per ogni cluster molecolare (Cluster 1 e Cluster 2), sono stati selezionati i tre migliori percorsi arricchiti in base al valore nominale p e al punteggio di arricchimento normalizzato (NES). I risultati sono stati visualizzati utilizzando il pacchetto GseaVis R (v0.1.0)²¹.

5 Analisi della rete di coespressione genica pesata

WGCNA è stato eseguito sul profilo di espressione genica di pazienti con DA per identificare i moduli di co-espressione genica associati all'identità del sottotipo trascrittomico, utilizzando il pacchetto R WGCNA (v1.73)²². I geni sono stati filtrati per mantenere il 75% superiore con la varianza più alta su tutti i campioni. Una rete di coespressione con segno veniva costruita utilizzando una potenza di soglia morbida selezionata da 1 a 30 per approssimare una topologia scale-free. I moduli genici sono stati identificati tramite clustering gerarchico e taglio dinamico degli alberi. Le associazioni modulo-tratto sono state studiate correlando gli autogeni dei moduli co-espressi con le etichette dei sottotipi molecolari, e sono stati selezionati moduli che mostrano correlazione significativa (p < 0,05) con il sottotipo molecolare per analisi a valle.

6 Proteine mitocondriali nei sottogruppi molecolari dell'AD

Per identificare geni associati al mitocondrio all'interno dei moduli DEG e WGCNA, questi set genici sono stati sovrapposti alla lista curata di proteine mitocondriali di MitoCarta3.0-23. I geni che si intersecano sono stati considerati proteine mitocondriali presunte rilevanti per il contesto della malattia dell'AD.

7 Ontologia genica e analisi dell'arricchimento KEGG

Identificare le principali funzioni cellulari e i processi biologici che differenziano i sottogruppi molecolari. Sono state effettuate analisi di arricchimento GO e KEGG per geni associati al mitocondrio utilizzando clusterProfiler. L'arricchimento GO è stato condotto separatamente per le categorie Processo Biologico (BP), Componente Cellulare (CC) e Funzione Molecolare (MF) utilizzando la funzione enrichGO con OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "ALL" e parametri predefiniti. L'arricchimento della via KEGG è stato eseguito utilizzando la funzione enrichKEGG con l'organismo impostato su "has". I termini arricchiti con p-value aggiustato < 0,05 sono stati considerati significativi.

8 Reti di interazione proteina-proteina

Gli 85 DEG e i geni mitocondriali sovrapposti al modulo AD sono stati interrogati nel database STRING (https://string-db.org)²⁴ per recuperare PPI noti e predetti. L'analisi topologica della rete è stata effettuata utilizzando sette misure (Degree, Closeness, Betweenness, Eigenvector, PageRank, Hub e Authorities) per classificare l'importanza del nodo di ciascuna proteina. Sono stati selezionati i primi 30 geni di ciascuna misura e le intersezioni tra tutti e sette gli approcci sono stati visualizzati utilizzando un grafico UpSet. I 4 geni intersecanti delle misure sono stati utilizzati per costruire un modello di classificazione basato sui loro livelli di espressione genica. Accuratezza, sensibilità, specificità e area del modello sotto la curva ROC (AUC) sono state calcolate per valutare le prestazioni di classificazione.

9 Analisi della regolazione trascrizionale

Il database hTFtarget (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ è stato interrogato per recuperare le interazioni TF-target supportate sperimentalmente per quattro geni hub intersecanti. La rete regolatoria del gene TF risultante è stata costruita e visualizzata utilizzando i pacchetti R igraph²⁶ e ggraph²⁷ .

10 Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie a RNA-seq in blocco

L'algoritmo^{CIBERSORT 28} (https://cibersort.stanford.edu/) è stato utilizzato per stimare le proporzioni relative di 22 tipi di cellule immunitarie nei dati del trascrittoma cutaneo lesionale. I dati di espressione genica normalizzati sono stati inseriti nel CIBERSORT (v0.1.0) insieme alla matrice di firma LM22. L'analisi è stata eseguita con 1.000 permutazioni e disabilitata la normalizzazione quantile. Campioni con valori p di output CIBERSORT < 0,05 sono stati presi in considerazione per analisi a valle. Le frazioni stime delle cellule immunitarie sono state confrontate tra sottogruppi molecolari utilizzando il test di Wilcoxon a somma dei rangi con correzione FDR per confronti multipli tra i 22 tipi di cellule immunitarie (p.adjust.method = "FDR"), e i risultati sono stati visualizzati con boxplot utilizzando il pacchetto ggplot2²⁹ R.

Results

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Sottogruppi trascrizionali nella dermatite atopica

I dati RNA-seq provenienti da 266 campioni di pazienti con AD sono stati analizzati per indagare l'eterogeneità trascrizionale all'interno della malattia. Dopo il controllo qualità e la correzione degli effetti dei lotti in più studi, il clustering consensuale non supervisionato ha rivelato due sottogruppi molecolari distinti (Figura 1A). La stabilità del cluster e il numero ottimale del cluster sono stati valutati utilizzando il grafico della funzione di distribuzione cumulativa (CDF) (Figura 1B), il grafico dell'area delta (Figura 1C) e la mappa di calore della matrice di consenso (Figura 1D). Insieme, questi risultati supportano l'esistenza di due sottotipi trascrizionali robusti nell'Alzheimer, riflettendo l'eterogeneità genetica sottostante.

Geni espressi differenzialmente tra sottogruppi dell'DA

Il grafico t-SNE basato sulla matrice di espressione genica normalizzata ha ulteriormente validato i sottogruppi trascrizionali identificati tramite clustering consenso. Il grafico t-SNE ha rivelato due cluster ben separati, ciascuno corrispondente a uno dei sottogruppi precedentemente definiti (Figura 2A), a supporto della presenza di profili molecolari distinti tra i pazienti con DA. L'espressione differenziale tra i due sottogruppi è stata poi analizzata usando DESeq2, con una soglia di p < aggiustata da 0,01 e |log₂ di variazione di piegatura| > 1. Il grafico vulcanico risultante (Figura 2B) mostrava geni espressi differenzialmente (DEG), indicando una forte divergenza trascrizionale. I 10 geni più alzati sono ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN e AHNAK nel cluster 1 e C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D e PMPCA nel cluster 2 (Figura 2C).

Sottogruppo di geni associato al gruppo di Alzanza

L'Analisi di Arricchimento del Set Genico (GSEA) ha rivelato profili di arricchimento funzionale distinti tra i due cluster trascritomici (Figura 3A). Il cluster 1 ha mostrato un arricchimento significativo per i percorsi coinvolti nella segnalazione e nell'adesione cellulare, inclusa l'adesione focale (Figura 3B) e la via di segnalazione MAPK (Figura 3C), suggerendo uno stato attivo caratterizzato da interazioni e proliferazione potenziate cellula-cellula-matrice extracellulare. Al contrario, il Cluster 2 ha mostrato un forte arricchimento per la fosforilazione ossidativa (Figura 3D) e la funzione proteasomica (Figura 3E), suggerendo un fenotipo metabolico attivo ossidativo e proteolitico.

Geni co-espressi nei gruppi molecolari AD

Per identificare i moduli di co-espressione associati ai sottotipi trasscrittomici, il WGCNA è stato eseguito dopo la pre-elaborazione dei dati. I campioni outlier sono stati identificati e rimossi inizialmente sulla base del clustering gerarchico delle distanze dei campioni per garantire la robustezza della costruzione della rete a valle (Figura 4A). Una potenza di soglia morbida veniva quindi selezionata utilizzando il criterio di topologia scale-free, con una potenza di 6 scelta per ottenere una scala libera di R² > 0,85 (Figura 4B). I moduli genici sono stati identificati tramite clustering gerarchico e dynamic tree cutting, seguiti da clustering degli eigengeni per fondere moduli strettamente correlati (Figura 4C e Figura 4D). La rete genica risultante è stata visualizzata utilizzando una mappa termica di sovrapposizione topologica, confermando la presenza di distinti pattern di co-espressione genica (Figura 4E). L'analisi delle relazioni modulo-tratto ha rivelato una forte e significativa correlazione tra il modulo MEyellow (_gene N = 743) e il sottogruppo molecolare (Figura 4F).

L'arricchimento funzionale del sottogruppo dell'AD associava geni mitocondriali.

Successivamente è stata eseguita un'analisi di arricchimento GO e KEGG sui geni intersecati (N = 85) tra i DEG, i geni del modulo MEyellow e un elenco di proteine mitocondriali da MitoCarta3.0 (Figura 5A) per indagare i ruoli funzionali dei geni associati al mitocondrio che guidano le differenze trascrizionali tra i cluster. L'analisi delle vie KEGG ha identificato l'arricchimento nelle vie di fosforilazione ossidativa e metaboliche (Figura 5B). L'analisi di arricchimento GO ha rivelato una significativa sovrappresentazione di termini associati alla funzione mitocondriale, inclusa la sintesi di ATP mitocondriale guidata dalla forza motrice dei protoni, il complesso della catena respiratoria e l'attività di NADH deidrogenasi (Figura 5C), suggerendo che questi geni siano principalmente associati al metabolismo e alla regolazione energetica mitocondriale.

Geni mitocondriali hub nella differenziazione molecolare dell'AD

Per identificare i geni chiave negli 85 geni associati al sottogruppo del trascritoma mitocondriale, è stata costruita una rete PPI (Figura 6A). Sulla base della classifica in ciascuna delle sette misure topologiche (vedi metodi), sono stati selezionati i primi 30 geni e le loro intersezioni sono state analizzate e visualizzate in un grafico UpSet (Figura 6B). Questa analisi ha portato a quattro geni hub identificati costantemente come nodi centrali basati su tutti i criteri di classificazione (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2). I loro profili di espressione sono stati esaminati nei due cluster trascrittomici e hanno riscontrato che tutti e quattro i geni hub erano significativamente aumentati nel Cluster 1 rispetto al Cluster 2 (Figura 6C). L'analisi di correlazione dell'espressione genica a coppie ha mostrato correlazioni positive tra tutti e quattro i geni, indicando una regolazione coordinata, con CHCHD5 e ISOC2 che hanno mostrato la correlazione più forte (Figura 6D). Inoltre, un modello di classificazione che abbiamo costruito utilizzando l'espressione di questi quattro geni ha dimostrato un robusto potere discriminatorio tra i due cluster, con la curva ROC che mostra un'area sotto la curva (AUC) > 0,7 (Figura 6E). Inoltre, è stata effettuata un'analisi della rete regolatoria del fattore di trascrizione (TF) per studiare i meccanismi regolatori che regolano l'espressione dei quattro geni hub identificati. Tutti i fattori di trascrizione noti e previsti che potenzialmente regolano questi geni hub sono stati interrogati da hTFtarget, e i risultati sono stati integrati e visualizzati come una rete regolatoria trascrizionale (Figura 7). Nella rete regolatoria dei geni TF-hub, BAD aveva il maggior numero di TF, e ATF3, BRD2, BRD4 e CEBPA interagivano ciascuno con tutti e quattro i geni hub, suggerendo un meccanismo regolatorio condiviso.

Confronto dell'infiltrazione delle cellule immunitarie tra sottogruppi dell'DA

Per indagare il panorama immunologico associato ai sottogruppi trascritomici, è stata effettuata un'analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie utilizzando CIBERSORT, che stima le proporzioni relative di 22 tipi di cellule immunitarie basandosi sui dati del trascritoma globale (Figura 8). Tra i sottogruppi immunitari, i linfociti T regolatori (Treg) sono risultati significativamente più abbondanti nel Cluster 1, suggerendo un microambiente immunosoppressore potenzialmente associato all'attività mitocondriale e a vie di segnalazione sovraregolate in questo gruppo. Al contrario, le cellule T follicolari helper erano significativamente arricchite nel Cluster 2, indicando una potenziale risposta immunitaria adattativa più attiva in questo sottogruppo.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dati trascritomici analizzati in questo studio sono disponibili pubblicamente nel repository Gene Expression Omnibus (GEO) con i numeri di accessione GSE121212, GSE157194, GSE193309 e GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

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Figura 1: Raggruppamento consensuale dei campioni di lesione della dermatite atopica basato su profili trascrivertici. (A) Mappa termica e clustering gerarchico della matrice di consenso tra i campioni di dermatite atopica (AD). (B) Grafico della funzione di distribuzione cumulativa (CDF) di consenso utilizzato per determinare il numero ottimale di cluster (k = 2–10). (C) Grafico dell'area delta che mostra la variazione relativa dell'area sotto la curva CDF per ogni k. (D) Assegnazione del cluster consensuale per k = 2. Ogni colonna rappresenta un campione individuale e i colori indicano l'appartenenza al cluster (Cluster 1, rosso; Cluster 2, turchese). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Espressione genica differenziale dei sottotipi molecolari della dermatite atopica. (A) grafico di incorporamento stocastico del vicino (t-SNE) a t-distribuzione (t-SNE) dei campioni AD. Ogni punto rappresenta un campione proiettato in due dimensioni ed è colorato secondo l'assegnazione del cluster. (B) Grafico vulcanico dei geni differenzialmente espressi (DEG) tra il Cluster 1 e il Cluster 2. Ogni punto rappresenta un gene, tracciato tramite variazione di log2 volte (asse x) e valore p aggiustato −log10 (asse y). I punti rossi e blu indicano geni significativamente aumentati rispettivamente nel Cluster 1 e nel Cluster 2, mentre i punti grigi indicano geni non significativi. (C) Mappa termica dei 10 geni più fortemente espressi nel Cluster 1 e Cluster 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi dell'arricchimento del set genico dei sottotipi molecolari della dermatite atopica. (A) Grafico a barre a due facce che mostra i risultati GSEA tra il Cluster 1 e il Cluster 2, con i percorsi superiori significativamente arricchiti. I percorsi arricchiti nel Cluster 1 sono mostrati a destra, e quelli arricchiti nel Cluster 2 a sinistra. (B–E) I grafici rappresentativi di arricchimento per l'adesione focale, la via di segnalazione MAPK, la fosforilazione ossidativa e le vie dei proteassomi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi della rete di co-espressione genica ponderata di campioni di dermatite atopica. (A) Campionamento di dendrogramma di clustering basato sui profili di espressione genica. (B) Indice di adattamento a topologia priva di scala e connettività media tra potenze di soglia morbida (1–30). (C) Clustering e heatmap degli autogeni dei moduli, con colori che indicano correlazioni a coppie. (D) Dendrogramma di clustering gerarchico che mostra geni raggruppati in moduli co-espressi. (E) Mappa termica della matrice di sovrapposizione topologica (TOM), che rappresenta la similarità di co-espressione tra coppie di geni. (F) Mappa termica delle relazioni modulo–tratto, che mostra correlazioni tra autogeni moduli e tratti clinici. I coefficienti di correlazione sono visualizzati all'interno di ogni cella, e l'intensità del colore indica la forza e la direzione della correlazione (rosso, positivo; blu, negativo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Ontologia genica e arricchimento della via KEGG dei geni mitocondriali associati a sottotipi. (A) Diagramma di Venn che mostra la sovrapposizione tra DEG, geni moduli associati a sottotipi e geni mitocondriali. (B) Grafico a bolla delle prime 20 vie KEGG arricchite di geni intersecianti. (C) I 10 termini più arricchiti dell'Ontologia Genica (GO) per Processo Biologico (BP), Componente Cellulare (CC) e Funzione Molecolare (MF). Tutte le analisi di arricchimento sono state effettuate utilizzando un valore p corretto < 0,05 (tasso di falsa scoperta) come soglia di significatività. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Analisi dell'interazione proteina-proteina e identificazione dei geni hub. (A) Rete di interazione proteina–proteina (PPI) di 85 geni che si intersecano. I nodi rappresentano proteine, e gli spigoli indicano interazioni previste o convalidate sperimentalmente dal database STRING. (B) Grafico UpSet che mostra le intersezioni tra i primi 30 geni classificati basandosi su sette misure di centralità di rete. (C) Diagrammi a scatola che mostrano i livelli di espressione di quattro geni hub nel Cluster 1 e nel Cluster 2. (D) Analisi di correlazione a coppie tra i quattro geni hub. (E) Curva della caratteristica operativa del ricevitore (ROC) che mostra le prestazioni di classificazione, con sensibilità rappresentata rispetto alla specificità. L'area sotto la curva (AUC) indica l'accuratezza complessiva. La significatività statistica nel panel (C) è stata valutata utilizzando il test di Wilcoxon per la somma dei ranghi (*p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Rete regolatoria dei geni hub. I cerchi rossi rappresentano geni hub e i cerchi blu rappresentano fattori di trascrizione (TF) associati. I bordi indicano interazioni regolatorie. La dimensione di ciascun nodo gene hub riflette il numero di TF interagenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Confronto dell'infiltrazione delle cellule immunitarie tra sottogruppi di dermatite atopica. Diagrammi a scatola che mostrano le proporzioni stimate di 22 tipi di cellule immunitarie in ciascun cluster (Cluster 1, rosso; Cluster 2, turchese). Gli asterischi (*) indicano differenze statisticamente significative tra i cluster, valutate utilizzando il test di Wilcoxon della somma dei rangi con correzione del tasso di scoperta falsa per confronti multipli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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La dermatite atopica è un disturbo infiammatorio cutaneo diffuso e geneticamente eterogeneo, che rappresenta notevoli sfide per strategie di trattamento personalizzate. Questo studio fornisce spunti sull'eterogeneità molecolare dell'AD identificando due sottogruppi trascrizionali distinti in 266 campioni di pelle lesionale di pazienti con AD. Questi sottogruppi presentano un arricchimento biologico e infiltrazione cellulare immunitaria diversi, con il Cluster 1 caratterizzato da vie attive di segnalazione e adesione cellulare e un arricchimento delle cellule T regolatorie (Treg), mentre il Cluster 2 è definito da un aumento della fosforilazione ossidativa e della funzione proteasomica, insieme a un aumento delle cellule T follicolari helper. È importante sottolineare che sono stati identificati quattro geni associati al mitocondrio (BAD, BOLA1, CHCHD5 e ISOC2) che sono stati alzati nel Cluster 1. Sono geni hub nella rete PPI di 85 geni che definiscono i due sottotipi trascrittomici e possono essere regolati simultaneamente da fattori di trascrizione, tra cui ATF3, BRD2, BRD4 e CEBPA.

I due cluster distinti sono stati identificati in base al modello di espressione genica, che suggerisce che l'AD presenta un'eterogeneità significativa nell'espressione genica. Studi precedenti hanno dimostrato che questa eterogeneità potrebbe essere guidata da meccanismi genetici, epigenetici e mediati dal sistema immunitario che definiscono endotipi molecolari^distinti ^5,30,31. Tra i due gruppi è stata osservata anche una diversa infiltrazione delle cellule immunitarie, il cluster 1 caratterizzato da cellule T regolatorie e il cluster 2 arricchito da cellule T helper follicolari (Tfh), implicando eterogeneità immunologica sottostante e potenzialmente diversi meccanismi della malattia nella coorte dell'AD. Un cluster dominato dal Treg suggerisce un ambiente immunitario in cui i meccanismi regolatori sono prominenti, riflettendo forse tentativi di controllare l'infiammazione o una risposta compensatoria all'attivazione immunitaria^cronica ^32,33. Tuttavia, nella DA, la funzione del Treg può essere compromessa nonostante l'aumento dei numeri, il che potrebbe non sopprimere efficacemente l'infiammazione. Al contrario, un cluster arricchito di Tfh indica un aiuto aumentato delle cellule B, un aumento dell'attività del centro germinale e probabilmente una produzione elevata di IgE, che sono caratteristiche distintive di risposte allergiche e di forme più gravi o estrinseche di AD^34,35. Le cellule TFH sono note per supportare la differenziazione delle cellule B e il cambio di classe di anticorpi, e la loro espansione è correlata con l'attività malatomica e la sensibilizzazione^{allergica 36}. La presenza di questi cluster distinti può riflettere fenotipi clinici differenti, gravità della malattia o risposte alla terapia, e sottolinea l'importanza di approcci personalizzati nella ricerca e nel trattamento dell'AD.

È noto che la disfunzione mitocondriale svolge un ruolo significativo nella patogenesi dell'AD attraverso meccanismi come il mantenimento della barriera^{epidermica 37}, la produzione della specie reattiva di ossigeno³⁸ e la regolazione della risposta delle cellule^{immunitarie 39}. Quattro proteine mitocondriali sono state identificate come nodi centrali dei geni associati alla differenziazione trascrittomica, che possono prevedere il sottotipo molecolare con alta accuratezza (AUC>0,7). Sebbene nessuno studio precedente abbia mostrato il legame diretto di questi geni con l'AD, questi risultati suggeriscono che siano potenziali biomarcatori per stratificare i pazienti con AD e valutare la disfunzione mitocondriale nei pazienti con AD. BAD (agonista associato alla BCL2 della morte cellulare) è un membro pro-apoptotico della famiglia BCL-2 coinvolto nella segnalazione apoptotica mitocondriale; la sua regolazione all'alto nel Cluster 1 potrebbe riflettere un aumento del priming apoptotico mitocondriale in questo sottotipo. BOLA1 è una proteina mitocondriale implicata nella biogenesi di cluster ferro-zolfo e nella regolazione dello stress ossidativo. CHCHD5 (coiled-coil-helix-coiled-coiled-helix domain containing 5) è una proteina della membrana interna mitocondriale associata all'organizzazione delle cristi e all'efficienza della catena di trasporto elettronico. ISOC2 (dominio isocorismatasi contenente 2) è stato collegato a processi metabolici e alla funzione mitocondriale. La regolazione al rialzo coordinata di questi quattro geni nel Cluster 1 suggerisce uno stato di attività metabolica mitocondriale elevata e segnalazione apoptotica in questo sottogruppo dell'AD.

Questo studio presenta diverse limitazioni. Sebbene questo studio abbia identificato due sottogruppi molecolari con espressione genica distinta nei geni mitocondriali e infiltrazione separata delle cellule immunitari, mancano dati clinici dettagliati sul fenotipo che ci permettano di correlare la stratificazione con la gravità della malattia e le risposte longitudinali al trattamento. Per comprendere appieno cosa significhi l'alta espressione di questi quattro geni hub nel Cluster 1, studi futuri dovrebbero integrare metadati clinici completi e, idealmente, effettuare la validazione funzionale in modelli cheratinociti o murini. Inoltre, questo studio si basa su dati di RNA-seq in blocco disponibili pubblicamente; sebbene sia potente nell'analisi su larga scala, manca di risoluzione in specifici tipi cellulari. Questa limitazione rende difficile determinare se l'espressione differenziale osservata dei geni mitocondriali abbia origine da cheratinociti, cellule immunitarie infiltrate o altre popolazioni cellulari residenti nella pelle. Con l'ampio uso di approcci trascrivomici a singola cellula e spaziali, le ricerche future trarrebbero grande beneficio dal potere di deconvoluzione dei segnali di espressione e di fornire una panoramica più precisa del profilo trascritomico a livello cellulare. Inoltre, tutti i dati sono stati ottenuti da campioni di biopsia a punch, che campionano pelle a spessore completo. Studi futuri che incorporano RNA-seq a striscia a nastro potrebbero offrire un approccio complementare non invasivo per il profilo del trascritoma epidermico superficiale e potrebbero convalidare le firme di sottogruppo identificate in un contesto minimamente invasivo. L'integrazione futura di RNA-seq a singola cellula e dati trascritomici spaziali migliorerà ulteriormente la risoluzione delle firme mitocondriali specifiche per tipo cellulare nella pelle AD.

In conclusione, questo studio ha esaminato l'eterogeneità trascritomica dell'A in 266 campioni, identificato geni mitocondriali chiave e infiltrazioni uniche delle cellule immunitari, differenziando i sottogruppi. Questi risultati migliorano la comprensione dell'eterogeneità molecolare dell'AD e evidenziano il potenziale di sviluppare approcci di trattamento di precisione basati su profili molecolari specifici.

Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CIBERSORT	Università di Stanford	v0.1.0; deconvoluzione delle cellule immunitari; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Bioconduttore	v4.12.6; analisi di arricchimento GSEA e GO/KEGG; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Bioconduttore	v1.64.0; clustering consensuale non supervisionato; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Bioconduttore	v1.46.0; analisi differenziale dell'espressione genica; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Omnibus sull'Espressione Genica (GEO)	NCBI	repository pubblico di dati trascritomici; dataset GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	visualizzazione dei dati; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	CRAN	Visualizzazione di grafi e reti; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; visualizzazione GSEA; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong	database target di fattori di trascrizione umani; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	CRAN	costruzione e visualizzazione della rete; https://igraph.org
limma	Bioconduttore	funzione removeBatchEffect; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Broad Institute	database proteico mitocondriale curato; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (Set genici Hallmark)	Broad Institute	database dei set genici per GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	Bioconduttore	database di annotazione del genoma umano; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	R Core Team	Ambiente di calcolo statistico; https://www.r-project.org
STRING	EMBL	v12.0; database di interazioni proteina-proteina; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Bioconduttore	v3.44.0; correzione degli effetti batch; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; analisi della rete di coespressione genica pesata; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

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L'analisi trascritomica rivela sottogruppi guidati dal mitocondrio nelle lesioni della dermatite atopica

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