Questo studio mirava a indagare gli effetti del Timochinone sullo stress ossidativo, sulla via di segnalazione Keap-1/Nrf-2 e sul comportamento nel plasma, nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo dei ratti esposti al bisfenolo A.
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Articolo metodologico
Questo studio mirava a indagare gli effetti del Timochinone sullo stress ossidativo, sulla via di segnalazione Keap-1/Nrf-2 e sul comportamento nel plasma, nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo dei ratti esposti al bisfenolo A.
L'esposizione cronica a basso dosaggio al bisfenolo A (BPA), un disturbatore endocrino ambientale ampiamente utilizzato, è stata sempre più associata a neurotossicità mediata dallo stress ossidativo. Il timochinone (TQ), un costituente bioattivo della Nigella sativa, presenta potenti proprietà antiossidanti; tuttavia, il suo potenziale neuroprotettivo contro la tossicità indotta dal BPA rimane incompletamente compreso. Data la natura pervasiva dell'esposizione al BPA, individuare strategie neuroprotettive efficaci e accessibili è di crescente importanza. Questo studio ha indagato gli effetti della TQ sullo stress ossidativo, sulla segnalazione Keap-1/Nrf-2, sul comportamento e sulle alterazioni istopatologiche nei ratti esposti al BPA. Un totale di 24 maschi adulti di ratti Wistar Albini sono stati assegnati casualmente in quattro gruppi (n = 6/gruppo): controllo, BPA, BPA + 10 mg/kg TQ (BPA+TQ I) e BPA + 20 mg/kg TQ (BPA+TQ II). BPA (50 μg/kg) e TQ sono stati somministrati intragicastricamente per 30 giorni. L'esposizione al BPA ha indotto significativi deficit comportamentali, stress ossidativo, interruzione della segnalazione di Keap-1/Nrf-2 e danni istopatologici marcati nell'ippocampo e nella corteccia cerebrale. Il trattamento TQ ha migliorato significativamente l'attività locomotoria e il comportamento simile alla depressione, ha ridotto la perossidazione lipidica e i livelli di ossido nitrico, ha ripristinato la capacità antiossidante correlata al glutatione e ha normalizzato l'espressione di Keap-1 e Nrf-2 (p < 0,001). Questi effetti protettivi erano più evidenti alla dose TQ più alta. Questi risultati complessivamente dimostrano che il timochinone mitiga la neurotossicità indotta dal BPA attraverso la modulazione dello stress ossidativo e della via di segnalazione Keap-1/Nrf-2, mettendo in evidenza il suo potenziale come agente neuroprotettivo contro l'esposizione ambientale al BPA.
Il bisfenolo A (BPA) è un composto sintetico ampiamente utilizzato nelle plastiche e nelle resine epossidiche ed è comunemente rilevato nei materiali per imballaggi alimentari, sistemi idricci, dispositivi medici e prodottiper la casa. L'esposizione ambientale continua ha sollevato preoccupazioni riguardo ai suoi potenziali effetti neurotossici, in particolare in condizioni croniche a bassa dose che riflettono l'esposizione umana reale.
Sebbene agenzie regolatorie come la Food and Drug Administration degli Stati Uniti e l'Agenzia per la Protezione Ambientale degli Stati Uniti abbiano definito 50 μg/kg/giorno come il livello senza effetti avversi osservati, le evidenze sperimentali ed epidemiologiche emergenti indicano che alterazioni comportamentali e cognitive possono verificarsi a dosi più basse. Di conseguenza, l'apporto giornaliero tollerabile in Europa è stato ridotto a 4 μg/kg/giorno, sottolineando la necessità di indagare gli effetti meccanicistici dell'esposizione ambientalmente rilevante alBPA 1,2.
Lo stress ossidativo è considerato un meccanismo centrale alla base della neurotossicità indotta dal BPA. Il BPA altera l'equilibrio redox cellulare riducendo le difese antiossidanti come il glutatione (GSH) e aumentando i marcatori di perossidazione lipidica, tra cui il malondialdeide (MDA)3,4. Tuttavia, i meccanismi regolatori a monte che controllano le risposte antiossidanti durante l'esposizione al BPA restano insufficientemente caratterizzati.
La via della proteina ECH-associata simile a Kelch (Keap-1)/fattore eritroide 2-correlato al fattore 2 (Nrf-2) è un meccanismo di difesa antiossidante endogeno principale. In condizioni di stress ossidativo, Nrf-2 si dissocia da Keap-1, si trasloca al nucleo e attiva l'espressione genica dipendente dagli elementi di rispostaantiossidante 5. Nonostante il suo ruolo consolidato nella difesa cellulare, la modulazione specifica per regione della segnalazione di Keap-1/Nrf-2 nel cervello durante l'esposizione a BPA ambientalmente rilevante non è stata approfondita in concomitanza con gli esiti comportamentali.
Il timochinone (TQ), il principale componente bioattivo dell'olio di semi di Nigella sativa, è un benzochinone lipofilo capace di attraversare la barriera emato-encefalica. TQ presenta proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e anti-apoptotiche, in parte grazie all'attivazione della segnalazione di Nrf-2 e al potenziamento della capacità antiossidanteendogena 5,6. Sebbene studi precedenti abbiano dimostrato gli effetti protettivi della TQ in vari modelli di neurotossicità, manca un approccio metodologico integrato che valuti marcatori di stress ossidativo, segnalazione Keap-1/Nrf-2 e parametri comportamentali all'interno dello stesso paradigma di esposizione al BPA 5,6,7.
Qui descriviamo un protocollo sperimentale riproducibile per valutare i biomarcatori dello stress ossidativo, l'espressione delle vie Keap-1/Nrf-2 e le alterazioni comportamentali in un modello di ratto di esposizione ambientale al BPA, nonché per valutare gli effetti neuroprotettivi del timochinone in molteplici regioni cerebrali.
Abbiamo ipotizzato che l'esposizione a basse dosi al BPA induca alterazioni comportamentali attraverso la disregolazione mediata dallo stress ossidativo della via di segnalazione Keap-1/Nrf-2, e che il timochinone mitighi questi effetti ripristinando l'equilibrio redox e attivando risposte antiossidanti dipendenti da Nrf-2.
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Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico Locale per la Sperimentazione Animale Istituzionale (Approvazione n.: 68429034/07).
Animali e progettazione sperimentale
Ventiquattro maschi adulti di ratti Wistar Albini (200-250 g) sono stati ottenuti dal Laboratorio di Ricerca Animale Sperimentale e ospitati individualmente in condizioni controllate (ciclo chiaro/buio di 12 ore, 24 ± 2 °C) con accesso ad libitum al cibo standard e all'acqua del rubinetto. Gli animali sono stati acclimatati alle condizioni di laboratorio prima dell'esperimento, che è durato 32 giorni.
I ratti sono stati assegnati casualmente a gruppi sperimentali utilizzando un metodo di randomizzazione semplice generato al computer per minimizzare il bias di selezione, con un numero uguale di animali assegnato a ciascun gruppo (n = 6/gruppo): controllo, BPA, BPA + 10 mg/kg di timochinone (BPA + TQ I) e BPA + 20 mg/kg di timochinone (BPA + TQ II). La dimensione del campione è stata determinata tramite un'analisi di potenza a priori utilizzando il software G*Power (versione 3.1). Sulla base delle dimensioni degli effetti riportate in studiprecedenti 5,6,7 che valutavano la neurotossicità indotta da BPA e gli interventi antiossidanti, in particolare per misure biochimiche e comportamentali, si ha assunto un potere statistico di 0,80 per l'ANOVA unidirezionale. In queste condizioni, era necessario un minimo di sei animali per gruppo per rilevare differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali.
BPA (50 μg/kg) e TQ (10 o 20 mg/kg) sono stati somministrati intragicamente con gavage una volta al giorno per 30 giorni. Tutti i trattamenti sono stati preparati e somministrati con un volume totale di 1 mL/kg. La dose di BPA utilizzata nel presente studio (50 μg/kg/giorno) è stata selezionata in base alla sua designazione come livello senza effetti avversi osservati e alla dose di riferimento da parte dell'Agenzia per la Protezione Ambientale degli Stati Uniti e della Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Questa dose è stata ampiamente impiegata in studi sperimentali per modellare l'esposizione al BPA ambientalmente rilevante e per indagare potenziali alterazioni neurocomportamentali e biochimiche che si verificano a livelli di esposizione precedentemente considerati sicuri. È importante sottolineare che l'accumulo di evidenze sperimentali indica che effetti neurologici e comportamentali avversi possono verificarsi a questa dose o al di sotto, a sostegno della sua rilevanza per la valutazione della tossicità da BPAa basso dosaggio 1,2. La selezione delle dosi di TQ (10 e 20 mg/kg) si basava su precedenti studi sperimentali che ne dimostravano l'efficacia neuroprotettiva e antiossidante senza indurretossicità 5,6,7. Queste dosi sono state ampiamente utilizzate in modelli di neurotossicità, stress ossidativo e neuroinfiammazione, e sono ben al di sotto delle soglie di tossicità riportate per somministrazioni ripetute. Non è stato condotto uno studio pilota per la determinazione della dose; La selezione della dose è stata guidata dalla precedenza della letteratura e da profili di sicurezza consolidati per garantire sia l'efficacia che la rilevanza traslazionale.
Il BPA è stato somministrato per 30 giorni consecutivi. Le valutazioni comportamentali sono state condotte nei giorni 31 e 32 dopo l'ultima esposizione. Gli animali sono stati sacrificati al giorno 32 dopo il completamento di tutti i test comportamentali. Questa tempistica è stata progettata per consentire tempo sufficiente per la valutazione comportamentale, minimizzando al contempo i potenziali effetti di confondimento della manipolazione acuta o dello stress procedurale sulle successive analisi biochimiche, molecolari e istopatologiche. Il timochinone è stato somministrato 1 volta al giorno immediatamente dopo il BPA tramite la stessa via intragastrica. I test comportamentali sono stati eseguiti dopo le somministrazioni finali di BPA e TQ. La cronologia sperimentale è riassunta nella Figura 1.
Misurazione del peso corporeo
I pesi corporei sono stati misurati utilizzando un bilanciere digitale calibrato (sensibilità ±0,1 g). Ogni ratto è stato pesato individualmente al mattino prima della somministrazione del trattamento, e le misurazioni sono state registrate nei giorni 1, 10, 20 e 32 in condizioni standardizzate per minimizzare la variabilità (Figura 2).
Valutazioni comportamentali
Tutti i parametri comportamentali sono stati valutati da un singolo osservatore cieco rispetto all'allocazione dei gruppi per minimizzare il bias e la variabilità tra osservatori. Gli animali sono stati abituati alla sala di prova per almeno 30 minuti prima dei test comportamentali per ridurre lo stress indotto da novità.
L'uso combinato del test in campo aperto (OFT) e del test del nuoto forzato (FST) consente una valutazione completa della tossicità neurocomportamentale indotta dal BPA, poiché è stato dimostrato che il BPA altera sia la reattività emotiva sia l'attività locomotoria neiroditori 2,3. Durante l'interpretazione dell'immobilità della FST sono stati considerati i risultati locomotori derivati dall'OFT per minimizzare i potenziali effetti di confusione legati all'alterazione dell'attività motoria.
FST: Il comportamento simile alla depressione è stato valutato utilizzando il test di nuoto forzato al giorno 32, preceduto da una sessione pre-test di 15 minuti condotta 24 ore prima. I ratti venivano collocati singolarmente in vasche cilindriche (35 cm di diametro, 50 cm di altezza) piene d'acqua (30 cm di profondità, 25 ± 1 °C) e lasciate nuotare per 5 minuti. I comportamenti di immobilità, nuoto e arrampicata sono stati registrati con una videocamera e analizzati offline per valutare la disperazionecomportamentale 7.
OFT: Il comportamento simile all'ansia e l'attività locomotoria spontanea sono stati valutati utilizzando il test in campo aperto al giorno 31. Ogni ratto è stato posizionato singolarmente in un'arena bianca in Plexiglas (90 cm x 35 cm) divisa in 24 quadrati uguali e lasciata esplorare liberamente per 5 minuti. I movimenti venivano registrati tramite una videocamera. Il tempo trascorso nelle zone centrali e periferiche e il numero di incroci con tutte e quattro le zampe sono stati quantificati come indici di comportamento e locomozione legatiall'ansia 8.
Raccolta di campioni
Al giorno 32, i ratti sono stati profondamente anestetizzati con ketamina intramuscolare (45 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). L'assenza del riflesso di ritiro del pedale è stata confermata una profondità adeguata dell'anestesia. Il sangue è stato raccolto tramite puntura cardiaca con una siringa sterile, e da ciascun animale sono stati prelevati circa 3-5 mL di sangue. L'eutanasia è stata completata tramite dissanguamento sotto anestesia profonda. I campioni di sangue sono stati trasferiti in tubi contenenti anticoagulanti e centrifugati a 3.000 x g per 10-15 minuti a 4 °C. Il plasma separato veniva allicito e conservato a −80 °C fino all'analisi biochimica.
L'ippocampo e l'emisfero cerebrale sinistro sono stati rapidamente dissezionati, pesati, congelati bruscamente in azoto liquido e conservati a −80 °C per analisi biochimiche successive, mentre l'emisfero cerebrale destro è stato fissato con formalina tamponata neutra al 10% per valutazioni istopatologiche e immunoistochimiche. Per garantire la coerenza metodologica e minimizzare la variabilità tra campioni, l'emisfero sinistro fu sistematicamente allocato per le misurazioni biochimiche e l'emisfero destro per le analisi morfologiche su tutti gli animali. È importante sottolineare che la fissazione della formalina era strettamente limitata ai tessuti designati per procedure istologiche e immunoistochimiche, e nessun tessuto fisso veniva utilizzato per saghi biochimici a base proteica, prevenendo così la degradazione proteica correlata alla fissazione. Per le valutazioni biochimiche, quantità definite di tessuto cerebrale congelato (tipicamente 50-100 mg per saggio) sono state omogeneizzate utilizzando buffer di omogeneizzazione specifici per saggio e rapporti tessuto-tampone standardizzati in base ai requisiti di ciascun parametro biochimico. Tutte le analisi sono state effettuate utilizzando quantità tessuti uguali all'interno di ciascun saggio tra i gruppi sperimentali.
La concentrazione totale di proteine negli omogeneati tissutali è stata determinata tramite un saggio proteico fluorometrico secondo le istruzioni del produttore. Tutti i parametri biochimici sono stati misurati utilizzando concentrazioni proteiche standardizzate e uguali all'interno di ciascun saggio per garantire la comparabilità tra campioni e gruppi sperimentali.
Valutazione dei parametri di stress ossidativo
La perossidazione lipidica è stata valutata misurando i livelli di MDA utilizzando il metodo delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) in plasmi e campionitissulari 7. I livelli ridotti di tiolo (RSH) e GSH sono stati determinati spettrofotometricamente utilizzando saghi basati su 5,5′-ditiobi (2-acido nitrobenzoico)(DTNB) 7. I livelli totali di ossido nitrico (NO) negli omogeneati plasmatico e tissutale sono stati misurati utilizzando la reazione di Griess dopo la riduzione delnitrato 7. Tutti i parametri biochimici sono espressi come proteina nmol/g o tessuto μmol/g, come indicato nella Figura 3 e nella Figura 4. Tutti i sagaggi biochimici sono stati eseguiti in duplicato e i valori medi sono stati utilizzati per l'analisi statistica.
Oltre alle analisi del tessuto cerebrale, sono state effettuate stime biochimiche su campioni di sangue per valutare lo stato ossidativo sistemico indotto dall'esposizione al BPA. I livelli di perossidazione lipidica plasmatica sono stati determinati dal metodo TBARS e i risultati sono stati espressi come equivalenti MDA. I livelli ridotti di solidrile (RSH) sono stati misurati usando DTNB, e i livelli totali di NO sono stati valutati utilizzando la reazione di Griess dopo la riduzione del nitrato, come descrittoin precedenza 7. I valori di assorbanza sono stati registrati spettrofotometricamente a 532 nm (TBARS), 412 nm (RSH) e 540 nm (NO). Tutti gli sagaggi venivano eseguiti in duplicato in condizioni standardizzate.
Il BPA è un tossico ambientale onnipresente che entra nella circolazione sistemica ed esercita effetti multiorganici; Pertanto, i marcatori di stress ossidativo circolanti forniscono informazioni complementari che riflettono lo squilibrio redoxcomplessivo 1,2. La valutazione dei parametri biochimici basati sul sangue consente di valutare la relazione tra alterazioni ossidative centrali e periferiche e aumenta la rilevanza traslazionale dei risultati, poiché tali marcatori sono comunemente utilizzati in studi ambientali e clinici per monitorare la tossicità correlata all'esposizione.
Analisi del western blot
L'analisi del Western blot è stata effettuata per determinare i livelli di proteine Keap-1 e Nrf-2 nel tessuto ippocampale. Circa 50 mg di tessuto sono stati omogeneizzati in 500 μL di tampone RIPA contenente un cocktail inibitore della proteasi. Gli omogeneati sono stati centrifugati a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C, e i soprannatanti sono stati raccolti. Le concentrazioni proteiche sono state determinate tramite un saggio di quantificazione proteica fluorometrica secondo le istruzioni del produttore, e le concentrazioni sono state calcolate da una curva di calibrazione standard. Quantità uguali di proteine (30 μg) sono state miscelate con tampone Laemmli contenente β-mercaptoetanolo, riscaldate a 95 °C per 5 minuti, separate su gel SDS-PAGE al 10% e trasferite sulle membrane PVDF a 110 V per 60-90 minuti. Le membrane sono state bloccate con il 3% di BSA e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro Keap-1 e Nrf-2 (1:3000) e β-actin (1:1000), seguite dall'incubazione con anticorpi secondari coniugati con HRP. Le bande proteiche sono state visualizzate tramite chemiluminescenza, e le intensità delle bande sono state quantificate tramite analisi densitometrica e normalizzate a β-actina.
Analisi istopatologica
I campioni di tessuto cerebrale dell'emisfero destro sono stati fissati in formalina tamponata al 10% di neutro per 72 ore, disidratati tramite serie di etanolo gradato, eliminati nello xilene e incorporati nella paraffina secondo procedure istologichestandard 9. I tessuti freschi erano riservati alle analisi biochimiche. Sono state ottenute sezioni coronali (5 μm) ai livelli della corteccia ippocampale ed entorinale basandosi su un atlantecerebrale di ratto 10. Quattro sezioni consecutive per animale sono state montate su vetrini di vetro per valutazioni istologiche e immunoistochimiche, garantendo uno spessore costante delle sezioni e una localizzazione anatomica. Le sezioni sono state deparaffinizzate, reidratate e colorate con ematossilina ed eosina (H&E) seguendo i protocolli di colorazionedi routine 11. L'esame istopatologico è stato eseguito in microscopia ottica da un singolo osservatore addestrato, cieco rispetto ai gruppi sperimentali, per minimizzare il bias ed eliminare la variabilità tra osservatori.
Analisi immunoistochimica
Le regioni di interesse, tra cui l'ippocampo e la corteccia entorrinale, sono state selezionate in base alla loro vulnerabilità alla neurotossicità indotta dal BPA e al loro ruolo nella regolazione cognitiva edemotiva 1,2. La colorazione immunoistochimica per Nrf-2 e Keap-1 è stata effettuata su sezioni cerebrali immerse in paraffina. Le sezioni sono state deparafinizzate nello xilene, reidratate tramite serie di etanolo gradato e sottoposte al recupero di antigeni indotto dal calore in tampone di citrato (pH 6,0). L'attività endogena della perossidasi è stata stinta prima dell'incubazione.
Le sezioni sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro Nrf-2 (1:100) e Keap-1 (1:200). La rilevazione è stata effettuata utilizzando un sistema di rilevamento HRP a base di polimeri disponibile commercialmente e pronto all'uso, contenente anticorpi secondari specifici per specie coniugati con perossidasi di rafano, secondo le istruzioni del produttore. L'immunoreattività è stata visualizzata utilizzando la 3,3′-diaminobenzidina (DAB) come cromogeno, seguita da una controcolorazione con ematossilina. Alcune sezioni sono state disidratate, liberate e coperte con slip.
Le sezioni di controllo negative sono state processate in parallelo senza incubazione primaria di anticorpi. Per l'analisi quantitativa, sono state valutate tre sezioni non adiacenti per animale. Le immagini sono state acquisite con impostazioni di esposizione identiche per tutti i gruppi. Sedici campi non sovrapposti per sezione sono stati analizzati utilizzando il software ImageJ. Le regioni di interesse sono state delineate manualmente, la colorazione di fondo è stata sottratta e l'immunoreattività è stata espressa come valore grigio medio. Il valore medio per animale è stato calcolato e utilizzato per l'analisi statistica.
Punteggio istopatologico
Le alterazioni istopatologiche sono state valutate in modo semi-quantitativo su sezioni colorate con H&E. Dieci campi selezionati casualmente e non sovrapposti per sezione sono stati esaminati e i parametri patologici sono stati valutati indipendentemente. La gravità del danno nell'ippocampo e nella corteccia entorinale è stata valutata utilizzando una scala di quattro punti basata sulla proporzione di cellule interessate: punteggio 0 (<5%), punteggio 1 (≤ un terzo), punteggio 2 (da un terzo a due terzi) e punteggio 3 (> due terzi). I punteggi medi per animale sono stati utilizzati per l'analisi statistica.
Analisi statistica
I dati sono stati analizzati utilizzando il software SPSS (versione 29.0) e sono presentati come media ± deviazione standard (SD). La dimensione del campione è stata determinata sulla base di studi precedenti e analisi di potenza, indicando che sei animali per gruppo forniscono l'>80% della potenza per rilevare differenze biologicamente rilevanti. La normalità della distribuzione dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. L'omogeneità delle varianze è stata valutata utilizzando il test di Levene. I confronti di gruppo sono stati effettuati utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey. La significanza statistica è stata fissata a p < 0,05.
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Peso corporeo
Non sono state osservate differenze statisticamente significative nel peso corporeo tra i gruppi nei giorni 1 e 32 dello studio (F(3,20)=2,750, p > 0,05; Figura 2).
Risultati dei test comportamentali
L'analisi di test in campo aperto ha rivelato che l'esposizione al BPA riduceva significativamente l'attività locomotoria, come indicato da un numero minore di incrociamen...
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Il presente studio ha valutato gli effetti del BPA, un componente strutturale delle plastiche policarbonatiche considerate sicure dalla USEPA a una dose di 50 μg/kg 1,2, sullo stress ossidativo, sulla segnalazione di Keap-1/Nrf-2, sul comportamento e sulle alterazioni istopatologiche nel cervello del ratto. Inoltre, sono stati studiati i potenziali effetti neuroprotettivi del TQ, un composto naturale con proprietà antiossidanti b...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo progetto è stato supportato dall'Ufficio di Coordinamento dei Progetti di Ricerca Scientifica dell'Università (numero di progetto TIP. A4.24.003).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5,5'-Ditiobis(2-nitrobenzoico acid) | Thermo Scientific | 69-78-3 | |
| Centrifugatrice da banco NF048 | Nüve | 43560 | |
| Beta_Actin | ThermoFisher Scientific, United States | 7D2C10 | |
| Bisfenolo A | Merck | 239658 | |
| Soluzione BSA | Proteintech, United States) | 66201-1-Ig | |
| Butilossitoluene | Sigma Aldrich | 128-37-0 | |
| Omogenizzatore digitale | Daihan Scientific | https://www.artlaboratuvarcih azlari.com/urun/daihan-hg- 15d-dijital-homojenizator-set -a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2 2Xhp00tgwWhJ-86Vc | |
| Ematossilina–eosina | Bio Optica | W01030708 | |
| Acido cloridrico | Merck | 7647-01-0 | |
| Software di imaging Image J | NIH; Washington, U.S.A. | https://imagej.net/ij/ | |
| Kit per colorazione immunoistochimica | Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polivalente | HRP, TA-125-HL | |
| Leica Autocut 14051956472 | Germania | https://www.leicabiosystems. com/histology-equipment/mic rotomes/histocore-autocut/ | |
| Microscopio ottico | Nikon, Eclipse | Ni-U, 940728 | |
| N-(1-Naftilet)etilen-diamina | Thermo Scientific | 1465-25-4 | |
| Lettore di micropiastre Nano | BMG LABTECH | SPECTROstar Nano | |
| Soluzione salina tamponata con fosfati | Merck | P4417 | |
| Anticorpi primari Keap-1 | Proteintech | Cat No. 10503-2-AP, 1:200 | |
| Anticorpi primari Nrf-2 | Proteintech | Cat No. 16396-1-AP, 1/100 | |
| Kit Qubit Protein BR Assay | ThermoFisher Scientific-INVITROGEN | Q33211 | |
| Citrato di sodio | Merck | 03-04-6132 | |
| Solfato di dodecilsodico | Thermo Scientific | 151-21-3 | |
| Idrossido di sodio | Merck | 1310-73-2 | |
| Nitrato di sodio | Merck | 7631-99-4 | |
| Streptavidina Perossidasi | Thermo Scientific | SHRP248-B | |
| Solfanilammide | Thermo Scientific | 63-74-1 | |
| Acido tiobarbiturico | Merck | 504-17-6 | |
| TQ | CAYMAN | 490-91-5 | |
| Acido tricarbalico, 99% | Thermo Scientific Chemicals | 139360500 | |
| Acido tricloroacetico | Thermo Scientific Chemicals | 76-03-9 | |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | |
| Cloruro di vanadio(III) | Sigma Aldrich | 7718-98-1 | |
| Substrato chemiluminescente West Pico PLUS e il sistema iBright 750 | Thermo Fisher Scientific system | https://www.clinxsci.com/product/mini _chemiluminescence_imaging_system ?gad_source=1&gad_campaignid= 16224184202&gbraid=0AAAAAoN6 UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD BoCgLoQAvD_BwE | |
| Soluzione di solfato di zinco | Merck | 7733-02-0 |
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