Uno studio di randomizzazione mendeliano su tratti delle cellule immunitarie e dei metaboliti plasmamici nella tiroidite di Hashimoto

Sommario

Utilizzando analisi di randomizzazione e mediazione mendeliane su due campioni, questo studio identifica 32 fenotipi delle cellule immunitarie e 9 metaboliti plasmatici, causalmente associati alla tiroidite di Hashimoto, e supporta un asse immunometabolico parziale CD39+Treg-isovalerilcarnitine (C5)-HT. La citometria a flusso preliminare e i dati metabolomici forniscono una plausibilità biologica iniziale coerente con questa via.

Abstract

La tiroidite di Hashimoto (HT) è un disturbo autoimmune della tiroide. Sebbene le cellule immunitarie siano implicate nella sua patogenesi, i loro ruoli specifici devono ancora essere completamente chiariti. È stata condotta un'analisi di randomizzazione mendeliana (RM) su due campioni che integra statistiche riassuntive dello studio di associazione genomica a livello genoma (GWAS) da grandi dataset pubblici per caratteristiche delle cellule immunitarie (ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121), metaboliti plasmatici (GCST90199621-9020102) e HT (ebi-a-GCST90018855). Gli effetti causali sono stati stimati utilizzando metodi ponderati per varianza inversa (IVW), con analisi MR-Egger, mediana ponderata e lascia-uno-fuori per valutare pleiotropia e robustezza. Le analisi bidirezionali e di mediazione MR sono state ulteriormente applicate per testare la direzionalità e identificare potenziali vie mediate dai metaboliti. Le cellule di Treg CD3⁺CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ sono state quantificate in campioni di sangue periferico utilizzando citometria di flusso. L'isovalerilcarnitina (C5) è stata misurata tramite cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem. L'analisi IVW ha identificato 32 fenotipi di cellule immunitarie significativamente associati al rischio di HT (P < 0,05 dopo la correzione FDR). L'analisi RM inversa ha dimostrato che l'HT era positivamente associata causalmente a 2 caratteristiche immunitarie, mentre 4 caratteristiche immunitarie (tutte P < 0,05) erano inversamente associate all'HT. Le analisi di sensibilità non hanno rivelato pleiotropia orizzontale né eterogeneità. Inoltre, il metodo IVW ha identificato preliminarmente 9 metaboliti plasmamici come causalmente correlati all'HT, inclusi C5 potenziante (OR = 1,120, IC 95%: 1,032-1,215, P = 0,006) e ergotionina protettiva (OR = 0,958, IC 95%: 0,927-0,990, P = 0,010). La mediazione RM in due fasi ha identificato C5 come un possibile mediatore che collega CD3⁺ CD39⁺ Treg a HT (proporzione di mediazione 8,89%, IC 95%: 2,34%-15,4%, P = 0,008). La citometria di flusso ha elevato i livelli di CD39⁺Treg e il C5 plasmatico nei pazienti HT, con C5 positivamente correlato alla proporzione di cellule CD39⁺Treg. Questo studio stabilisce nuovi legami causali tra fenotipi delle cellule immunitarie e HT, e mette in evidenza i metaboliti plasmatici, in particolare il C5, come potenziali mediatori nella patogenesi HT. Questi risultati approfondiscono la comprensione meccanicistica della malattia tiroidea autoimmune e potrebbero guidare la scoperta futura di biomarcatori e bersagli terapeutici.

Introduzione

La tiroidite di Hashimoto (HT) è una comune malattia autoimmune in cui il sistema immunitario attacca la ghiandola tiroide, causando^{ipotiroidismo 1,2}. Studi recenti hanno riportato un aumento costante annuale dell'incidenza dell'HT. In Cina, la sua prevalenza è stimata tra lo 0,2% e l'1,3^%. La causa esatta dell'HT è sconosciuta, anche se si ritiene che la sua patogenesi includa un'interazione complessa di componenti genetici, ambientali e immunitari ^4,5.

Lo sviluppo della HT è fortemente influenzato dal sistema ^{immunitario 6,7,8}. Le risposte immunitarie aberranti colpiscono il tessuto tiroideo, scatenando la produzione di autoanticorpi, tra cui anti-perossidasi tiroidea (anti-TPO) e anti-tiroglobulina (anti-Tg)⁹. Questi autoanticorpi interagiscono con le cellule tiroidee, inducendo morte cellulare mediata dal sistema immunitario e reazioni infiammatorie, causando una funzione tiroidea^{compromessa 10}. Le specifiche vie patogeniche, in particolare i segnali metabolici che guidano la disfunzione delle cellule immunitarie, restano ancora non pienamente comprese. Le cellule T regolatorie (Treg), in particolare quelle che esprimono CD39, svolgono un ruolo fondamentale nel mantenere la tolleranza immunologica idrolizzando ATP extracellulare in adenosina immunosoppressiva. Interruzioni nella funzione del Treg o nel loro ambiente metabolico possono portare a una rottura dell'autotolleranza, tuttavia la relazione causale tra specifici sottoinsiemi del Treg e HT resta da^chiarire 11,12,13,14,15,16.

Gli studi osservazionali tradizionali sono spesso limitati da variabili di confusione e dal potenziale di causalità inversa, il che complica la capacità di determinare relazioni causali definitive tra fenotipi delle cellule immunitarie e HT¹⁷. Inoltre, poiché l'HT è una malattia sistemica influenzata da vari sottogruppi immunitari e intermediari metabolici, un focus ristretto sui singoli candidati può trascurare nuovi fattori patogeni¹⁸. Pertanto, è necessario un approccio di screening su larga scala per fornire un panorama imparziale e completo dei fattori immunometabolici che contribuiscono all'HT. I recenti progressi negli studi di associazione genomica a livello genomico (GWAS) hanno fornito dati completi sui fenotipi delle cellule immunitarie e sui metaboliti plasmatici, offrendo nuove strade per esplorare i meccanismi sottostanti di HT¹⁹. La randomizzazione mendeliana (MR) segue i principi dell'assegnazione casuale dei gameti mendeliani e delle combinazioni^{libere 16} e dell'utilizzo dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) come variabili strumentali (IV) per dedurre potenziali effetti causali delle esposizioni sugli^{esiti 20,21}. Questo metodo aiuta a mitigare l'influenza dei fattori di confusione e la causalità inversa, che spesso complicano gli studi osservazionali^{tradizionali 16,22}.

Alla luce di questi sviluppi, l'obiettivo di questo studio è duplice. Per prima cosa, è stata condotta un'analisi esplorativa che genera ipotesi utilizzando un quadro di risonanza magnetica a due campioni per analizzare sistematicamente 731 fenotipi delle cellule immunitarie e 1.400 metaboliti plasmatici, al fine di identificare nuovi fattori di rischio candidati per l'HT. In secondo luogo, è stata effettuata una transizione verso un'indagine guidata da ipotesi per valutare il ruolo mediatorio specifico dei metaboliti identificati, come l'isovalerilcarnitina, nel percorso che collega le cellule T regolatorie al rischio di HT. Questo studio, quindi, integra lo screening RM su larga scala con analisi di mediazione e convalidazione clinica preliminare per fornire prove geneticamente supportate coerenti con un quadro immunometabolico presuntivo (Treg–metabolita–HT), sottolineando al contempo la natura esplorativa di questi risultati. Identificando queste catene causali precise, si offrono nuove prospettive sulla regolazione metabolica dell'autoimmunità tiroidea, insieme a candidati robusti per future mirature terapeutiche.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale Affiliato dell'Università Medica della Mongolia Interna. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e le relative linee guida etiche. Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima dell'avvio di qualsiasi procedura relativa allo studio. Questo studio ha incluso due gruppi di partecipanti: il gruppo tiroidite di Hashimoto (HT, n = 10) e il gruppo controllo sano (Sano, n = 10). I due gruppi sono stati abbinati per età e sesso. Tutti i campioni di sangue periferico sono stati prelevati da ambulatori o da individui sottoposti a visite sanitarie di routine, con prelievo di sangue al mattino dopo un digiuno notturno.

Progettazione dello studio

In questo studio, sono state impiegate un'analisi RM su due campioni e un'analisi di mediazione per valutare la relazione causale tra 731 fenotipi delle cellule immunitarie (7 gruppi) e HT, ed hanno esplorato il potenziale ruolo modulatore dei metaboliti plasmici in questa relazione. Il flusso di lavoro analitico consisteva in 5 passaggi sequenziali: (1) selezione dei dataset GWAS di esposizione per i fenotipi immunitari; (2) selezione del dataset GWAS per l'esito per HT; (3) identificazione e armonizzazione delle variabili strumentali; (4) analisi primaria di risonanza magnetica a due campioni e validazione bidirezionale; e (5) analisi RM di mediazione in due fasi. Una panoramica schematica del disegno dello studio è presentata nella Figura Supplementare 1. Nell'analisi RM, le varianti genetiche fungono da proxy per esposizioni modificabili. Per un'inferenza causale valida, le variabili strumentali (IV) devono soddisfare tre criteri fondamentali: (1) sono fortemente associate all'esposizione di interesse; (2) sono indipendenti da qualsiasi elemento di confusione che possa influenzare sia l'esposizione che l'esito; e (3) influenzano l'esito esclusivamente attraverso l'esposizione, senza vie causali alternative.

GWAS della sorgente dati HT

Per garantire la compatibilità dei dataset e minimizzare la stratificazione della popolazione, tutte le statistiche riassuntive GWAS sono state principalmente derivate da individui di origine europea. Il database GWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/) forniva i dati sugli esiti HT e veniva utilizzato il dataset ebi-a-GCST90018855. Lo studio ha eseguito GWAS su 395.640 europei (_caso N = 15.654,_{N controllo} = 379.986); dopo controllo qualità e interpolazione, sono stati analizzati 24.146.037 SNP. Per i confondenti specifici HT (ad esempio, genere, età), il GWAS originale (ebi-a-GCST90018855) includeva queste covarie nei loro modelli, come standard nelle pipeline GSA.

Fonti di dati GWAS per le cellule immunitarie

Le statistiche riassuntive per GWAS relative ai tratti delle cellule immunitarie sono state ottenute dal GWAS Catalog, che copriva dataset con numeri di accessione da ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121 (disponibili a https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Nell'analisi sono stati inclusi in totale 731 fenotipi immunologici, tra cui il conteggio cellulare relativo (n = 192), il parametro morfologico (MP) (n = 389), i coefficienti di attivazione (AC, n = 118) e l'intensità media di fluorescenza (MFI, n = 389) che rappresentano il grado di antigene^{superficiale 23}. L'impatto di quasi 22 milioni di polimorfismi su 731 fenotipi delle cellule immunitarie in 3757 sardi è stato documentato dal GWAS iniziale sulle cellule immunitari.

Fonti di dati GWAS per i metaboliti plasmatici

I dati riassuntivi GWAS per un totale di 1.400 metaboliti plasmatici sono stati recuperati dal Catalogo GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020), comprendente 1.091 concentrazioni individuali di metaboliti e 309 tratti del rapporto metabolitico. I dataset GWAS utilizzati per l'analisi della risonanza magnetica nel presente studio sono stati derivati da individui di origine europea. Le caratteristiche dettagliate dei dati GWAS del metabolito plasmatico utilizzati sono fornite nella Tabella Supplementare 1.

I dataset GWAS per fenotipi delle cellule immunitarie (coorte sarda), HT (FinnGen/EBI-a-GCST90018855) e metaboliti plasmatici (coorti europee) sono indipendenti e senza sovrapposizione campionaria, come confermato dalle rispettive pubblicazioni del consorzio. Questo soddisfa l'assunzione di indipendenza per la MR a due campioni.

Selezione delle variabili strumentali (IV)

Si presumeva che le flebo fossero fortemente associate all'esposizione, pur rimanendo indipendenti dalle variabili di esito. Inoltre, si ipotizzava che solo il fattore di esposizione avesse un effetto diretto sull'esito. Per identificare le flebo appropriate, sono stati selezionati SNP associati ai fattori di esposizione con un livello di significatività fissato a 5 × ^10-8. Per tenere conto dello squilibrio di collegamento (LD), gli SNP sono stati raggruppati utilizzando una soglia di^R2 di 0,001 all'interno di una finestra di 10.000 kilobasi (kb). Le varianti che mostrano^{R a} coppie > 0,001 entro questa distanza sono state escluse per garantire l'indipendenza delle variabili strumentali selezionate ed eliminare potenziali correlazioni LD. I test di eterogeneità hanno escluso SNP significativamente eterogenei con una F-statistica < 10. Infine, per controllare l'effetto dei confondenti sulle IV, fu preso P < 1×^10-5 per eliminare SNP palindromici e SNP incompatibili, mantenendo SNP validi come variabili strumentali.

Analisi di randomizzazione mendeliana a due campioni

Per valutare la relazione causale bidirezionale tra fenotipi delle cellule immunitarie e HT, sono state effettuate sia analisi di randomizzazione mendeliana (RM) a due campioni sia analisi RM di mediazione. In particolare, è stata applicata la risonanza magnetica a due campioni per valutare molteplici caratteristiche legate alle cellule immunitarie. Per queste analisi, sono stati impiegati diversi metodi RM complementari, tra cui la ponderazione inversa della varianza (IVW⁾²⁴, la regressione^{MR-Egger 25}, lo stimatore mediano ponderato (WME⁾²⁶, la stima semplice^{basata sui modi 27} e la stima basata sui modi ponderati. Tra questi, IVW è stato designato come approccio analitico principale, con significatività statistica definita come P < 0,05. Il metodo IVW è stato scelto come stimatore principale della risonanza magnetica grazie al suo equilibrio ottimale tra precisione e assunzione di pleiotropia bilanciata. Il metodo IVW migliora la precisione assegnando un peso maggiore agli SNP con varianze minori, producendo così stime causali più affidabili. La regressione MR-Egger è stata utilizzata per la valutazione della pleiotropia, un processo in cui i geni influenzano più fenotipi. Se l'intercettazione ha indicato che non c'è stata una pleiotropia orizzontale significativa (P > 0,05), questo approccio ha combinato la valutazione dell'intercettazione per determinare la pleiotropia. L'eterogeneità è stata valutata utilizzando la statistica Q dei metodi MR-Egger e IVW, che misura in che misura la variazione genetica influenza il fenotipo, se P > 0,05 indica che non vi è eterogeneità significativa negli effetti della variazione genetica. Sono state applicate soglie adeguate da Bonferroni per tenere conto di 731 fenotipi immunitari (P < 6,84 × 10⁻⁵) e 1.400 metaboliti (P < 3,57 × 10⁻⁵). I risultati significativi sono sopravvissuti alla correzione salvo diversa indicazione. Inoltre, la causalità inversa è stata valutata utilizzando lo stesso metodo di RM per indagare se le caratteristiche delle cellule immunitarie fossero influenzate dalla HT. Nello studio di risonanza inversa, l'HT è stata considerata il fattore di esposizione e sono state considerate diverse caratteristiche delle cellule immunitarie come risultato.

In questo studio, l'analisi di mediazione è stata condotta utilizzando un quadro di risonanza magnetica in due fasi per esplorare se i metaboliti plasmatici agiscano come intermediari nella via causale che collega i fenotipi delle cellule immunitarie all'HT. Questo approccio consente di suddividere l'effetto causale totale dei fenotipi delle cellule immunitarie sulla HT in un effetto diretto e un effetto indiretto trasmesso attraverso gli intermediari metabolici identificati. L'effetto totale delle cellule immunitarie sull'HT è stato inizialmente stimato, seguito dall'effetto delle cellule immunitarie sui metaboliti (β1), dall'effetto dei metaboliti sull'HT (β2) e dall'effetto mediatore (β1*β2), con l'effetto diretto calcolato come l'effetto totale meno l'effetto mediatore. Effetto totale (β_totale) = Effetto diretto (β_diretto) + Effetto indiretto (β_indiretto); Effetto indiretto = β1 × β2; La proporzione mediata (%) = (β1 × β2)/β totale × 100%, dove β1 è l'effetto causale del fenotipo delle cellule immunitarie sul metabolita plasmatico, e β2 è l'effetto causale del metabolita plasmatico sulla HT. Il metodo delta è stato utilizzato per stimare intervalli di confidenza del 95% per l'effetto indiretto. Inoltre, è stata condotta un'analisi RM intermedia inversa per indagare gli effetti causali dell'HT su metaboliti e metaboliti sulle cellule immunitarie, al fine di integrare i risultati della RM diretta e migliorare l'affidabilità dell'inferenza causale. Tutte le analisi sono state effettuate da un ambiente di calcolo statistico e da pacchetti software relativi alla risonanza magnetica, che sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Rilevamento di Treg 3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺

50 μL di sangue intero anticoagulato sono stati miscelati accuratamente in una provetta con 10 μL ciascuno di anticorpi monoclonali CD3, CD4, CD25 e CD39. La miscela è stata protetta dalla luce e mantenuta a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, sono stati aggiunti 2 mL di soluzione FACS Lysing diluita 1:10. Il tubo veniva incubato per altri 10 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce durante la lisi. Il tubo è stato centrifugato a ~300 x g per 5 minuti, e il soprantantante è stato rimosso. Dopo aver aggiunto 2 mL di soluzione tampone fosfatica (PBS), il tubo è stato nuovamente centrifugato a ~300 x g per 5 minuti. Il sovrantantante fu rimosso e fu aggiunto 500 μL di PBS per la rilevazione. La rilevazione è stata effettuata utilizzando un citometro a flusso multi-laser e analizzata dal software di acquisizione e analisi per ottenere la proporzione di CD3⁺CD4⁺CD25⁺Treg e il sottoinsieme che esprime CD39 (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Treg).

Misurazione dei livelli di Isovalerilcarnitina (C5)

I dati sui livelli di C5 dei pazienti sono stati ottenuti dal Dipartimento di Laboratorio Clinico dell'Ospedale dell'Università Medica della Mongolia Interna. In particolare, il C5 è stato misurato come parte di cromatografia liquida–spettrometria di massa tandem (LC–MS/MS), seguendo procedure di laboratorio standardizzate e protocolli di controllo qualità.

Analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un ambiente software statistico. Le variabili continue sono state confrontate utilizzando il test t di Student per dati normalmente distribuiti o il test di Wilcoxon per dati non normalmente distribuiti. Le variabili categoriche sono state analizzate utilizzando il test del chi-quadrato. L'analisi di correlazione di Pearson è stata utilizzata per condurre un'analisi di correlazione. Un p-valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Effetti causali genetici dei fenotipi delle cellule immunitarie sull'HT

A seguito dell'esclusione di potenziali fattori di confusione e dell'assenza di pleiotropia orizzontale (P > 0,05), è stata condotta un'analisi RM su due campioni per valutare gli effetti causali dei fenotipi delle cellule immunitarie sul rischio di HT. Per ogni fenotipo delle cellule immunitarie utilizzato come esposizione, la statistica F è stata calcolata per valutare la forza delle variabili strumentali. Tutti gli strumenti superavano la soglia convenzionale di F > 10, indicando un bias minimo debole dello strumento. Le statistiche dettagliate delle F-statistiche per i principali tratti immunitari discussi nel testo principale sono fornite nella Tabella Supplementare 2. In totale, 32 fenotipi immuno-correlati hanno mostrato associazioni significative con il rischio di HT (P < 0,05) (Figura 1). La robustezza di questi risultati è stata supportata da analisi a scatter plot (Figura supplementare 2A,B) e analisi di sensibilità utilizzando l'approccio leave-one-out (Figura supplementare 3A,B).

Tra i primi risultati, il fenotipo di Treg ha mostrato il coinvolgimento più esteso, con CD3 su CD39+ che secreve Treg (OR = 1,063; IC 95%: 1,023–1,105; P = 0,002) e CD39+ attivato Treg %attivato (OR = 1,081; IC 95%: 1,008–1,161; P = 0,030) emergendo come caratteristiche chiave associate al rischio che sono state successivamente prioritizzate per l'analisi della mediazione. Nelle fasi di maturazione delle cellule T, CD3 su CD8br CM ha mostrato la dimensione dell'effetto più grande tra le caratteristiche associate al rischio (OR = 1,094; IC 95%: 1,040–1,150; P < 0,001), mentre TD DN (CD4⁻CD8⁻) AC mostrava un'associazione protettiva significativa (OR = 0,930; IC 95%: 0,881–0,982; P = 0,009). Tra i fenotipi delle cellule B, i sottogruppi di cellule mieloidi che esprimono HLA-DR mostrarono costantemente effetti di aumento del rischio, con HLA DR su CD33dim HLA DR+ CD11b⁻ che raggiunse OR = 1,095 (IC 95%: 1,032–1,162; P = 0,003). I risultati completi in tutte e sei le categorie di cellule immunitarie: cDC, Treg, stadi di maturazione delle cellule T, TBNK, fenotipi monociti, B e mieloidi sono riassunti nella Figura 1.

Le analisi di sensibilità hanno ulteriormente convalidato i risultati. Non sono state rilevate prove significative di eterogeneità e pleiotropia orizzontale basate su valutazioni statistiche rilevanti (Tabella Supplementare 3 e Tabella Supplementare 4). Questi risultati sono stati confermati dall'analisi "lascia uno fuori".

Gli effetti causali dell'HT sulle cellule immunitarie

I risultati hanno rivelato che l'HT era positivamente associata causalmente a due caratteristiche immunitarie: la cellula T regolatoria secretrice CD4 (1.143: 1.023-1.277; P = 0,018) e cellule soppressrici derivate da mieloidi monocitotiche (1,373: 1,058-1,782; P = 0,017). Al contrario, la HT era associata causalmente negativamente a 4 caratteristiche immunitarie: cellula T regolatoria CD4 attivata (0,818: 0,679-0,987; P = 0,036), CD4+ attivo la cellula T regolatoria (0,790: 0,676-0,924; P = 0,003), cellula T regolatoria CD4 attivata e a riposo (0,871: 0,780-0,974; P = 0,015) e CD25++ CD4+ T cell (0,855: 0,747-0,980; P = 0,017) (Figura 2). Questi risultati suggeriscono una relazione reciproca tra gli stati di attivazione HT e Treg, che potrebbe riflettere un rimodellamento immunitario guidato dalla malattia. I diagrammi a scatter (Figura Supplementare 4) e il metodo "lascia uno fuori" (Figura Supplementare 5) hanno confermato la stabilità dei risultati. Anche le analisi di sensibilità hanno convalidato i risultati. La forza di questi risultati è stata confermata da valutazioni di eterogeneità e molteplicità orizzontale (Tabella Supplementare 5 e Tabella Supplementare 6). Queste conclusioni sono supportate dall'analisi "lascia fuori uno".

Effetti causali genetici dei metaboliti plasmamici sulla HT

Dopo aver selezionato variabili strumentali adeguate ed escluso squilibri di catena e strumenti deboli, sono stati identificati in totale 34.843 SNP associati a metaboliti plasmatici, con la statistica minima F-statistica che ha raggiunto 19,50 (Tabella Supplementare 7). Utilizzando il metodo IVW, 9 metaboliti plasmamici sono stati preliminarmente identificati come causalmente associati all'HT. Tra questi, 4 metaboliti erano positivamente associati a un aumento del rischio di HT: rapporto glucosio/maltosio (1,195: 1,082-1,319; P < 0,001), acido taurocolico (1,190: 1,073-1,321; P = 0,001), 5-idrossimetil-2-furoilincarnitina (1,127: 1,046-1,215; P = 0,002), e C5 (1,120: 1,032-1,215; P = 0,006) (Tabella 1).

Al contrario, 5 metaboliti possono essere negativamente associati al rischio di HT, inclusa l'ergotionina (0,958: 0,927-0,990; P = 0,010), rapporto Carnitina a propionilcarnitina (C3) (0,895: 0,825-0,970; P = 0,007), rapporto tra adenosina 5'-difosfato (ADP) e N-acetilneuraminato (0,890: 0,823-0,963; P = 0,004), rapporto arginina/glutammato (0,882: 0,802-0,968; P = 0,009), e 1-(1-enil-palmitoil)-2-linoleoil-GPE (p-16:0/18:2) (0,873: 0,798-0,955; P = 0,003).

Anche le analisi di sensibilità hanno convalidato i risultati. La forza di questi risultati è stata confermata da valutazioni di eterogeneità e molteplicità orizzontale (Tabella Supplementare 8 e Tabella Supplementare 9). Queste conclusioni sono supportate dall'analisi "lascia fuori uno".

Mediazione del rischio di HT delle cellule immunitarie da parte dei metaboliti plasmatici

Basandosi sui fenotipi delle cellule immunitarie e sui metaboliti plasmamici identificati in precedenza, è stata applicata una strategia di risonanza magnetica a due campioni per stimare i potenziali effetti medianti. Nel primo passo, sono state condotte analisi RM utilizzando 32 fenotipi delle cellule immunitarie come esposizioni e 9 metaboliti plasmamici come risultati, rivelando 12 associazioni causali significative che coinvolgono 10 fenotipi delle cellule immunitarie e 8 metaboliti plasmatici, con stime corrispondenti di effetto β1 dalle cellule immunitarie ai metaboliti. Tra questi, l'associazione più significativa è stata identificata tra CD3 nelle cellule Treg secretrici CD39+ e i livelli di C5 (1,050: 1,016-1,085; P = 0,004). Nel secondo passaggio, C5 è stato considerato come esposizione e HT come risultato. Sono state effettuate analisi RM, inclusa la rilevazione degli outlier MR-PRESSO e valutazioni per eterogeneità e pleiotropia orizzontale. Non sono stati rilevati SNP fuori dagli schemi né evidenze di eterogeneità o pleiotropia (Tabella 2), permettendoci di stimare l'effetto causale dal metabolita plasmatico a HT (β2) (Figura supplementare 6).

Nella fase finale dell'analisi RM, sono state condotte analisi di mediazione per chiarire se l'effetto causale dei fenotipi delle cellule immunitarie sull'HT fosse mediato tramite metaboliti plasmatici. I risultati hanno indicato che livelli aumentati di C5 agivano come mediatori nel percorso che collegava CD3 nelle cellule Treg secretrici CD39+ a un rischio maggiore di sviluppare HT (Figura supplementare 7 e Figura 3). I test di rilevamento degli outlier MR-PRESSO, eterogeneità e pleiotropia non hanno mostrato SNP distorti né segni di eterogeneità o pleiotropia orizzontale (Tabella 3, Tabella Supplementare 10 e Tabella Supplementare 11). Tra questi, la proporzione mediata dei livelli di C5 era dell'8,89% (2,34% a 15,4%) (P = 0,008). Infine, sono state effettuate analisi MR con mediazione inversa per testare rigorosamente le assunzioni di direzionalità. Per i metaboliti delle cellule immunitarie, la RM inversa (livelli di C5 a CD3 su Treg secretrice CD39+) non ha mostrato effetti causali significativi ( IVW P > 0,05 dopo la correzione di Bonferroni), supportando l'unidirezionalità (Tabella 4). Per la HT ai metaboliti, la RM inversa (livelli da HT a C5) non ha mostrato associazioni causali (IVW P > 0,05 dopo la correzione di Bonferroni), supportando la direzionalità assunta (Tabella 5). Dato il modesto effetto totale e la mancanza di evidenze reciproche nella risonanza bidirezionale, questi risultati della mediazione dovrebbero essere considerati esplorativi.

Rilevamento di Treg per il saggio di citometria a flusso CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Rilevamento Treg

Per convalidare i risultati dell'analisi metabolomica, è stata effettuata una validazione sperimentale in vitro per valutare le caratteristiche di espressione del CD39⁺ Treg e del plasma C5. La citometria a flusso è stata utilizzata per quantificare le cellule Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) e i loro sottoinsiemi CD39⁺ (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺) nel sangue periferico di pazienti con HT e controlli sani. Come mostrato nella Figura 4A–C, sia le cellule Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) che i sottogruppi CD39⁺ Treg erano significativamente elevati nei pazienti con HT rispetto agli individui sani (P < 0,001). La profilazione metabolomica del plasma mirato tramite spettrometria di massa tandem ha ulteriormente mostrato che i livelli di C5 erano nettamente più alti nel gruppo HT (P < 0,001, Figura 4D). Inoltre, l'analisi di correlazione di Pearson ha rivelato un'associazione positiva tra i livelli plasmici di C5 e la frequenza del sottoinsieme CD39⁺Treg (Figura 4E), coerente con il presunto percorso CD39⁺Treg-C5-HT identificato dalla risonanza magnetica. Tuttavia, il disegno trasversale e la piccola dimensione del campione impediscono l'inferenza causale da questi dati da soli.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

Le statistiche riassuntive dello studio di associazione genomica a livello genomico (GWAS) per la tiroidite di Hashimoto sono state ottenute dal GWAS Catalog (ebi-a-GCST90018855; https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Le statistiche riassuntive per i tratti delle cellule immunitarie sono state recuperate dal Catalogo GWAS (ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121; https://www.ebi.ac.uk/gwas/). I dati GWAS del metabolito plasmatico sono stati ottenuti dal GWAS Catalog (GCST90199621-GCST90201020; https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). I dati a supporto dei risultati di questo studio sono forniti nel File Supplementare 1.

Figura 1: Grafico forestale che mostra gli effetti causali delle caratteristiche delle cellule immunitarie sulla tiroidite di Hashimoto. Grafico forestale che riassume gli effetti causali di tutte le caratteristiche delle cellule immunitarie valutate in questo studio sulla tiroidite (HT) di Hashimoto. Abbreviazioni: nsnp, numero di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP); pval, valore P; OP, odds ratio; IC, intervallo di confidenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Grafico forestale che mostra gli effetti causali della tiroidite di Hashimoto sui fenotipi delle cellule immunitari. Grafico forestale che riassume gli effetti causali dell'HT su vari fenotipi delle cellule immunitarie. Abbreviazioni: nsnp, numero di SNP; pval, valore P; OP, odds ratio; IC, intervallo di confidenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Grafico forestale che mostra l'effetto mediativo dell'isovalerilcarnitina plasmatica (C5) tra CD39+ e la tiroidite di Hashimoto. Grafico forestale che riassume gli effetti causali del plasma C5 che mediano l'associazione tra CD39+ e HT. Abbreviazioni: OR, odds ratio; IC, intervallo di confidenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Espressione delle cellule T regolatorie CD39+ e livelli plasmici di isovalerilcarnina (C5) nei pazienti con tiroidite di Hashimoto. (A) Strategia di gating della citometria a flusso per la T regolatoria (Treg; Celle CD3+CD4+CD25+) e celle Treg CD39+. (B) Livelli totali delle cellule Treg. (C) Livelli di cellule Treg CD39+. (D) Livelli plasmici di isovalerilcarnina (C5) misurati tramite spettrometria di massa tandem. (E) Analisi di correlazione di Pearson tra i livelli plasmici di isovalerilcarnitina (C5) e la proporzione di cellule Treg CD39+. Abbreviazioni: SSC-A, area di dispersione laterale; FSC-A, area di scatter frontale; FSC-H, altezza di scatter in avanti. P < 0,001 contro controlli sani. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Effetti causali di nove metaboliti plasmatici significativamente associati sulla tiroidite di Hashimoto.  Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 2: Effetto causale dei livelli di isovalerilcarnitina (C5) sulla tiroidite di Hashimoto (β₂). Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 3: Effetto causale delle cellule T regolatorie CD3+CD39+ sulla tiroidite di Hashimoto. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 4: Effetto causale dei livelli di isovalerilcarnitina (C5) sulle cellule T regolatorie CD3+CD39+. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 5: Effetto causale della tiroidite da Hashimoto sui livelli di isovalerilcarnitina (C5). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 1: Progettazione dello studio e flusso di lavoro analitico. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Grafici a dispersione che mostrano stime causali per le associazioni tra 32 tratti delle cellule immunitarie e la tiroidite di Hashimoto. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Analisi leave-one-out che valutano la robustezza degli effetti causali di 32 tratti delle cellule immunitarie sulla tiroidite di Hashimoto. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Diagrammi di dispersione che mostrano gli effetti causali della tiroidite di Hashimoto su sei fenotipi delle cellule immunitari. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Analisi Leave-one-out che valutano la robustezza degli effetti causali della tiroidite di Hashimoto su sei fenotipi delle cellule immunitari. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 6: Associazione causale tra i livelli di isovalerilcarnitina (C5) e il rischio di tiroidite di Hashimoto. (A) Grafico forestale che mostra l'effetto causale dei livelli di isovalerilcarnitina (C5) sul rischio di HT (β₂). (B) Diagramma di scatter che mostra la stima dell'effetto causale per ciascun SNP sul rischio HT. (C) Diagramma a imbuto che valuta l'eterogeneità delle stime di randomizzazione mendeliana (MR) per l'effetto dei livelli di C5 sul rischio di HT. (D) Analisi Leave-one-out che dimostra che la stima complessiva del rischio non è stata sostanzialmente influenzata da alcun singolo SNP. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 7: Associazione causale tra cellule T regolatorie CD3+CD39+ e rischio di tiroidite di Hashimoto. (A) Grafico forestale che mostra l'effetto causale totale delle cellule T regolatorie CD3+CD39+ sul rischio di HT. (B) Diagramma di scatter che mostra la stima dell'effetto causale per ciascun SNP sul rischio HT. (C) Grafico a imbuto che valuta l'eterogeneità delle stime della RM per l'effetto delle cellule T regolatorie CD3+CD39+ sul rischio HT. (D) Analisi Leave-one-out che dimostra che la stima complessiva del rischio non è stata sostanzialmente influenzata da alcun singolo SNP. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Caratteristiche degli insiedi di dati di studi di associazione genomica a livello genomico per i metaboliti plasmatici utilizzati nell'analisi di randomizzazione mendeliana.  Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Caratteristiche delle variabili strumentali (SNP) e delle statistiche F per fenotipi chiave delle cellule immunitarie utilizzati come esposizioni nell'analisi di randomizzazione mendeliana. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Valutazione della pleiotropia per analisi di randomizzazione mendeliane dei fenotipi delle cellule immunitarie sulla tiroidite di Hashimoto. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Valutazione dell'eterogeneità per analisi di randomizzazione mendeliana dei fenotipi delle cellule immunitarie sulla tiroidite di Hashimoto. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 5: Valutazione della pleiotropia per analisi di randomizzazione mendeliane della tiroidite di Hashimoto sui fenotipi delle cellule immunitari. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 6: Valutazione dell'eterogeneità per analisi di randomizzazione mendeliane della tiroidite di Hashimoto sui fenotipi delle cellule immunitarie. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 7: Polimorfismi a singolo nucleotide associati ai metaboliti plasmatici. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 8: Valutazione della pleiotropia per analisi di randomizzazione mendeliana dei metaboliti plasmamici sulla tiroidite di Hashimoto. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 9: Valutazione dell'eterogeneità per analisi di randomizzazione mendeliane dei metaboliti plasmatici sulla tiroidite di Hashimoto. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 10: Valutazione della pleiotropia per le analisi di mediazione delle associazioni fenotipo delle cellule immunitari–tiroidite di Hashimoto da parte dei metaboliti plasmati. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 11: Valutazione dell'eterogeneità per le analisi di mediazione delle associazioni fenotipo delle cellule immunitari–tiroidite di Hashimoto da parte dei metaboliti plasmati. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Dati a supporto dei risultati di questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo studio, la randomizzazione mendeliana è stata applicata per indagare l'impatto causale dei fenotipi delle cellule immunitarie sulla tiroidite di Hashimoto (HT) e per esplorare il potenziale ruolo mediatore dei metaboliti plasmatici. Trentadue fenotipi immunitari sono stati associati al rischio di HT, comprendendo cellule dendritiche, cellule T regolatorie, stadi di maturazione delle cellule T, cellule B e cellule mieloidi, con effetti sia promotori che protettivi. Inoltre, 9 metaboliti plasmamici hanno mostrato legami causali con HT e hanno inoltre osservato che C5 può parzialmente mediare l'associazione tra l'espressione di CD3 nelle cellule Treg secernenti CD39⁺ e HT. Questi risultati dovrebbero essere interpretati come prove di effetti causali presunti dedotti da strumenti genetici, piuttosto che come conferma meccanicistica diretta.

Tra i fenotipi cDC, CD62L-plasmacitoide DC %DC e HLA DR su DCA plasmacitoide erano associati a un rischio aumentato di HT, mentre CCR2 su CD62L+ mieloide DC, CD39+ attivato Treg %activated Treg e CD62L sul monocito. Le associazioni identificate tra fenotipi specifici delle cellule immunitarie e l'HT offrono nuove intuizioni sulla patogenesi della malattia. Ad esempio, il rischio di HT è stato trovato correlato con caratteristiche come HLA DR su plasma citoide DC e CD62L-plasmacitoide DC, indicando che questi tipi cellulari possono essere essenziali per avviare o mantenere reazioni autoimmuni contro la ghiandola ^{tiroidea 28}. Numerose indagini hanno dimostrato che le cellule epiteliali tiroidei HLA DR+ stimolano attivamente le risposte immunitarie all'interno della ghiandola tiroidea nei pazienti con HT 28,29,30,31. Questo studio ha rivelato una correlazione tra HLA DR sul plasmacitoide e un rischio aumentato di HT, indicando che HLA DR su plasmacitoide potrebbe essere un fattore causale nell'HT. Studi precedenti hanno identificato geni chiave con alta accuratezza diagnostica per l'HT tramite metodi bioinformatici, e gli immunosei hanno dimostrato che l'infiltrazione dei monociti è negativamente correlata con l'espressione genica pivotal. Xu et ^al.32 hanno riportato che livelli più elevati di espressione di CD62L sui monociti erano associati a un rischio ridotto di HT, coerente con i risultati attuali. In particolare, fenotipi come CCR2 sulle cellule dendritiche mieloidi CD62L+ e CD62L sui monociti sono stati collegati a un effetto protettivo, indicando potenziali ruoli regolatori o soppressivi che potrebbero mitigare l'autoimmunità tiroidea.

Numerose linee di evidenza indicano il ruolo fondamentale che l'equilibrio delle cellule Th17 e Treg svolge nello sviluppo di HT ^33,34. Questa indagine ha identificato un legame causale tra HT e diverse caratteristiche di Treg. In particolare, il rischio di sviluppare HT era inversamente associato all'espressione di CD25 sulle cellule T regolatorie CD39+, mentre il rapporto Th17/Treg è stato osservato aumentare con la progressione di HT³⁵. La complessa funzione delle cellule T regolatorie nel preservare la tolleranza immunologica e prevenire disturbi autoimmuni è evidenziata dalle forti correlazioni tra diversi fenotipi di Treg con rischio sia elevato che ridotto di HT. Le cellule Treg sono duali, con alcuni sottogruppi che potenzialmente esacerbano le risposte autoimmuni mentre altri le sopprimono. Questo sottolinea la necessità di ulteriori ricerche per definire con precisione i loro ruoli nella HT.

Inoltre, all'interno delle fasi di maturazione delle cellule T, nei gruppi TBNK, monociti e B, è stato osservato un modello coerente in cui alcuni fenotipi immunitari erano collegati a un rischio più alto di HT, mentre altri sembravano conferire un effetto^protettivo 32,36,37,38. Questo sottolinea il coinvolgimento complesso delle cellule immunitarie nello sviluppo dell'HT. È stata inoltre effettuata un'analisi inversa della RM per esaminare l'effetto dell'HT sulle caratteristiche delle cellule immunitari. L'analisi ha rivelato che HT era associata a livelli aumentati di alcuni fenotipi delle cellule immunitarie, come la secernenza di cellule T regolatorie CD4 e MDSC monocitotici, e livelli diminuiti di altre, in particolare le cellule T regolatorie CD4 attivate e le cellule T CD25+ CD4+.

In particolare, l'analisi di mediazione evidenzia il ruolo causale dei livelli di C5 nella progressione dai fenotipi delle cellule immunitarie allo sviluppo dell'HT. Studi precedenti hanno dimostrato che i livelli plasmamici di C5 contribuiscono allo sviluppo della neuropatia periferica^{diabetica 39} e sono correlati sia con la sarcopenia sia con la riduzione dell'indice muscolare^{scheletrico 40}. Inoltre, in termini di metabolismo lipidico, sono state osservate concentrazioni più basse di isovalerilcarnitina in individui con fenotipo di^{fragilità 41}. La proporzione di mediazione dell'8,89% osservata in questo studio suggerisce che il C5 possa rappresentare un legame meccanicistico presunto nella via Treg–HT CD39⁺ , e richiede ulteriori indagini come biomarcatore candidato e bersaglio terapeutico in studi sperimentali e clinici prospettivi.

Sebbene questo studio fornisca preziose informazioni, alcune limitazioni meritano di essere considerate. Innanzitutto, l'approccio MR si basa sull'assunzione che le variabili strumentali utilizzate siano valide e non influenzate da fattori di confusione o da pleiotropia 42,43,44. In secondo luogo, le analisi MR primarie si basavano su dati GWAS di ascendenza europea, e il GWAS delle cellule immunitarie derivava da una popolazione fondatrice sarda la cui struttura di disequilibrio di collegamento distinta può limitare la generalizzabilità; sono necessari studi futuri su diverse coorti non europee per confermare l'applicabilità specifica della popolazione. In terzo luogo, l'analisi di mediazione ha identificato C5 come un fattore che potrebbe rappresentare un legame esplorativo. Sono necessari studi futuri che incorporino coorti più diverse per confermare queste associazioni ed esplorare potenziali effetti specifici della popolazione. Infine, esperimenti di citometria a flusso e validazione del plasma hanno fornito prove a supporto dei risultati della risonanza magnetica; tuttavia, la dimensione del campione era relativamente limitata. Sono necessari studi sperimentali e clinici di maggiori dimensioni per convalidare queste interazioni metaboliche immunitarie ed esplorare se il targeting delle cellule CD39⁺Treg o delle vie metaboliche correlate possa offrire nuove opportunità terapeutiche per l'HT.

Conclusione

In conclusione, questo studio offre nuove intuizioni sulle relazioni causali tra fenotipi delle cellule immunitarie, in particolare i Treg CD39⁺ e HT, con C5 identificato come candidato mediatore in questa via basandosi su analisi esplorativa di mediazione. Questi risultati rivelano un nuovo asse immunometabolico, offrendo intuizioni meccanicistiche e potenziali bersagli per lo sviluppo di biomarcatori e l'intervento terapeutico nelle malattie autoimmuni della tiroide. Studi futuri con coorti prospettiche più ampie possono ulteriormente convalidare questi risultati ed esplorare il potenziale valore applicativo dell'immunomodulazione nel trattamento HT.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CD25-PE monoclonal antibody	BD Biosciences	340938	Anticorpo per citometria a flusso per la rilevazione di CD25 umano
CD39-PE-Cy7 monoclonal antibody	BD Biosciences	567526	Anticorpo per citometria a flusso per la rilevazione di CD39 umano
CD4-FITC monoclonal antibody	BD Biosciences	340133	Anticorpo per citometria a flusso per la rilevazione di CD4 umano
D3-APC monoclonal antibody	BD Biosciences	555333	Anticorpo per citometria a flusso per la rilevazione di CD3 umano
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	Buffer di lisi dei globuli rossi per la preparazione dei campioni per citometria a flusso
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSCanto II	Strumento per citometria a flusso multicolore per immunofenotipizzazione
Flow cytometry analysis software (FACSDiva)	BD Biosciences	—	Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati di citometria a flusso
gwasglue package	R package	—	Armonizzazione dei set di dati GWAS
ieugwasr package	R package	—	Interfaccia al database GWAS IEU
Liquid chromatography–tandem mass spectrometry system (LC–MS/MS)	Thermo Fisher Scientific	—	Usato per la quantificazione dell'isovalerilcarnitina (C5) nel plasma
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9624	PBS sterile, pH 7,4, usato per il lavaggio e la resospesione
R software	Software open source	Versione 4.4.1	Ambiente per l'analisi statistica
TwoSampleMR package	R package	—	Pacchetto per l'analisi di randomizzazione mendeliana
VariantAnnotation package	Bioconductor	—	Annotazione dei dati delle varianti