Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e le linee guida etiche ospedaliere ed è stato approvato dal Wuxi Second People's Hospital, dal Jiangnan University Medical Center e dai comitati etici (Ethic No. 2024-Y-231). Tutti i campioni biologici umani (sangue venoso e aliquote sieriche) sono stati gestiti in rigorosa conformità con le normative sulla biosicurezza (GB 19489-2008). Tutte le operazioni sono state svolte in un armadietto di biosicurezza per evitare contaminazioni del campione ed esposizione del personale. Lo smaltimento di campioni biologici usati, punte di pipette contaminate e tubi microcentrifughe è stato effettuato secondo gli standard di gestione dei rifiuti medici: campioni e materiali contaminati sono stati autoclavati a 121 °C per 30 minuti, poi consegnati a istituti qualificati per lo smaltimento dei rifiuti medici per un trattamento centralizzato al fine di garantire la biosicurezza.
Progettazione della ricerca
Si trattava di uno studio retrospettivo a centro singolo per indagare il valore prognostico dei livelli sierici di HGF e IBPS preoperatori sugli esiti patologici postoperatori dei pazienti OSCC. Questo disegno dello studio segue le linee guida REMARK (Tumor Marker Prognostic Study Report Recommendations). La popolazione che ha frequentato il Dipartimento Odontoiatrico del Wuxi Second People's Hospital, Centro Medico dell'Università di Jiangnan, da gennaio 2020 a dicembre 2022, è stata selezionata come popolazione di studio. Sono stati raccolti in totale 170 casi di informazioni, 165 casi inclusi dopo l'esclusione, 7 casi persi durante il periodo di follow-up, e infine 79 casi nel gruppo A (gruppo controllo sano, persone sane ricoverate in ospedale per esame fisico nello stesso periodo) e 79 casi nel gruppo B (gruppo OSCC, erano inclusi i pazienti con OSCC). Il diagramma di flusso di questo studio è illustrato nella Figura 1. Ha recuperato i soggetti idonei tramite il sistema elettronico della cartella clinica ospedaliera e il database del centro di esame fisico, e ha raccolto dati clinicopatologici dettagliati del gruppo A (gruppo controllo sano) e del gruppo B (gruppo OSCC). Durante lo studio è stato effettuato un follow-up post-operatorio dei pazienti del gruppo B per registrare recidiva, metastasi e sopravvivenza. Inclusi solo un gruppo di controllo sano per identificare l'espressione differenziale dei marcatori infiammatori tra pazienti OSCC e individui sani, fornendo una base razionale per fissare il valore di soglia per l'IBPS auto-costruita. Ha valutato il valore prognostico dell'IBPS e lo ha verificato all'interno della coorte di pazienti OSCC sulla base degli esiti patologici post-operatori. Questo disegno dello studio ha garantito l'accuratezza dei dati e la validità scientifica dello studio attraverso criteri di aggregazione rigorosi, un processo di test di laboratorio standardizzato e un meccanismo sistematico di follow-up, fornendo un rigoroso quadro di ricerca per analizzare il valore prognostico dei livelli di HGF e dei punteggi IBPS negli esiti patologici postoperatori dell'OSCC, che dovrebbe fornire una base scientifica per lo sviluppo di protocolli di valutazione prognostica personalizzata e di terapie strategie in clinica.
Criteri di inclusione ed esclusione
Criteri di inclusione: (1) Pazienti diagnosticati conOSCC 21; (2) Età 40–65 anni; (3) Con informazioni cliniche complete; (4) Ha ricevuto un piano di trattamento sequenziale completo basato su intervento chirurgico e integrato da radioterapia selettiva; (5) Pazienti con buona compliance e disponibilità a collaborare con il piano di trattamento sviluppato dallo studio; (6) Lo stato mentale generale dei pazienti è buono, i loro corpi sono sostanzialmente sani e possono esprimere sinceramente le loro lamentele sui sintomi e rispondere alle domande pertinenti dei professionisti sanitari; (7) I pazienti e le loro famiglie sono stati informati, hanno acconsentito e hanno firmato un modulo di consenso informato.
Criteri di esclusione: (1) Pazienti con tumori maligni combinati diversi dall'OSCC; (2) Pazienti con una combinazione di gravi malattie sistemiche o malattie del sistema immunitario; (3) Pazienti con disfunzione coagulante emorragica combinata, o gravi difetti funzionali cardiaci, epatici o renali, gravi malattie cardiovascolari o altre malattie più gravi; (4) Malattie infettive croniche combinate, combinate con altre malattie sessualmente trasmissibili (ad esempio sifilide, gonorrea, ecc.); (5) Anomalie combinate della funzione cerebrale, cardiaca, epatica e renale; (6) Pazienti che sono stati coinvolti in studi clinici o clinici di farmaci; (7) Richiesta di sospensione del trattamento o dimissione automatica per motivi personali; (8) Altre condizioni che, a giudizio del medico dello studio, non dovrebbero essere incluse; (9) Altre circostanze che influenzano gli indicatori dell'osservazione di follow-up.
Metodo di raggruppamento
Ha diviso i soggetti dello studio in due gruppi: gruppo A: gruppo controllo sano (n = 79), gruppo B: gruppo OSCC (n = 79).
Raccolta degli indicatori
Ho raccolto le informazioni di base sui pazienti di entrambi i gruppi.
Raccolta di campioni
Raccolta di campioni di sangue venoso a digiuno (5 mL) da tutti i partecipanti la mattina presto prima dell'intervento e mantenuti a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) durante il trasporto. Ho elaborato i campioni di sangue entro 30 minuti (1.800 s) dalla prelieva. Trasferito il siero soprantantante in aliquote da 0,5 mL utilizzando tubi microcentrifughe sterili in polipropilene dopo la centrifugazione a 3.000 × g per 15 minuti a temperatura ambiente (25 ± 2 °C). Immediatamente tutti gli aliquoti si mettono in un congelatore a temperatura ultra-bassa a -80 °C per conservazione a lungo termine fino all'analisi, evitando cicli ripetuti di congelamento-disgelo (non era consentito più di 1 ciclo congelamento-disgelo se necessario).
Livello siero di HGF
Determinate le concentrazioni seroniche di HGF utilizzando un kit commerciale di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) secondo le istruzioni delproduttore 22. Per un breve periodo, i campioni di siero scongelati a 4 °C per 30 minuti per evitare la denaturazione delle proteine, poi diluiscono in un rapporto 1:1 con il tampone di diluizione fornito dal kit. Aggiunto standard, controlli e campioni sierici diluiti (100 μL per pozzo) alla piastra ELISA e incubato a 37 °C per 60 minuti. Dopo aver lavato la piastra 5 volte con il buffer fornito, ho aggiunto il coniugato primario di anticorpi e ho incubato a 37 °C per altri 30 minuti. Dopo un secondo ciclo di lavaggio, veniva aggiunto il substrato cromogenico, e la reazione veniva incubata a 37 °C al buio per 15 minuti, e la reazione veniva terminata con la soluzione di stop. Ho misurato l'assorbanza a 450 nm usando un lettore ELISA entro 10 minuti dalla terminazione. Ha implementato procedure standard di controllo qualità durante tutto il test, incluso l'uso di calibratori e controlli forniti dal kit. Il coefficiente di variazione (CV) intra-saggio è stato < 5% e il CV inter-saggio è stato < 8%, confermando una performance analitica affidabile.
Calcolo IBPS
Ho analizzato i campioni di siero utilizzando l'analizzatore automatico di ematologia XN3000 e i reagentiassociati 23. Scongelare i campioni di siero a 4 °C per 20 minuti e equilibrarli a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) per 10 minuti prima del test. Sono stati effettuati esami del sangue di routine a 25 ± 2 °C per ottenere i conteggi di leucociti, neutrofili, linfociti e piastrine, e successivamente sono stati calcolati il NLR (conteggio dei neutrofili/conteggio dei linfociti) e il PLR (conteggio delle piastrine/conteggio dei linfociti). La calibrazione regolare degli strumenti di test è stata eseguita a 25 °C, con CV intra-batch < 3% e CV inter-batch < 5% per indicatori di routine del sangue. Ho utilizzato un saggio immunoturbidimetrico per misurare il contenuto di CRP sierico nell'analizzatore biochimico automatico. I campioni di siero sono stati scongelati a 4 °C per 20 minuti e equilibrati a 37 °C per 5 minuti prima della rilevazione. Eseguito il test a 37 °C con un tempo di incubazione di 10 minuti, monitorando la reazione continuamente a 546 nm. Lo strumento veniva utilizzato in rigorosa conformità con il manuale di istruzioni per completare il test. La rilevazione della CRP con CV intra-batch < 4% e CV inter-batch < 6%. La valutazione è stata effettuata secondo la nostra scala IBPS fatta in casa. Il sistema di punteggio IBPS si riferisce al metodo di costruzione dei punteggi pregressi della prognosi infiammatoria e aggiusta i pesi degli indicatori in base ai risultati pre-sperimentali di questo studio. Il valore NLR ≤3,0 è stato valutato come 0 punti, 3,0–5,0 come 1 punto, >5,0 come 2 punti. I valori PLR ≤150 venivano valutati come 0 punti, 150–300 come 1 punto e >300 come 2 punti. Il contenuto di CRP ≤50 mg/L era di 0 punti, 50–100 mg/L di 1 punto e >100 mg/L di 2 punti. Punteggio IBPS totale = punteggio CRP + punteggio NLR + punteggio PLR. Criteri di stratificazione: ≤ 4 punti per rischio medio-basso, 5–6 punti per alto rischio. I valori di soglia e i criteri di punteggio per NLR, PLR e CRP sono stati determinati sulla base di punteggi prognostici infiammatori precedentemente pubblicati, combinati con l'analisi esplorativa dei dati nella popolazione dello studio attuale, piuttosto che utilizzando ottimizzazioni statistiche come l'indice di Youden o l'analisi della curva funzionante del ricevitore.
Visite di follow-up
In questo studio è stato condotto un follow-up standardizzato di 20 mesi per valutare gli esiti postoperatori nei pazienti. L'orario di inizio del controllo era il giorno dell'intervento chirurgico per i pazienti del gruppo B (gruppo OSCC), e la fine era il 31 agosto 2024. È stata adottata una combinazione di follow-up ambulatoriale e follow-up telefonico. Eseguito l'esame fisico e l'esame di imaging a ogni follow-up per confermare la presenza di recidiva o metastasi tumorale. Gli indicatori prognostici principali erano la sopravvivenza complessiva (OS) e la sopravvivenza senza malattia (DFS). L'OS era definito come il tempo dal giorno dell'intervento fino alla morte per qualsiasi causa. La DFS è stata definita come il periodo dal giorno dell'intervento fino alla recidiva, progressione o morte del tumore per cause correlate al tumore.
Calcolo della dimensione del campione
Questo studio ha utilizzato G*Power 3.1.9.7 per la stima della dimensione del campione al fine di chiarire il valore prognostico dei livelli di HGF e dei punteggi IBPS per gli esiti patologici postoperatori nei pazienti OSCC. Impostare un livello di test di α di 0,05 (bilaterale), un'efficacia del test dell'85% e un fattore infiammatorio previsto AUC di 0,75, calcolato dal software, e sono stati necessari 75 casi in ciascun gruppo per soddisfare i requisiti statistici di analisi della curva ROC e regressione multifattoriale. Considerando le incertezze legate al possibile abbandono e ai dati mancanti, la dimensione del campione di questo studio è stata infine fissata a 79 casi per gruppo per garantire che lo studio avesse sufficiente efficacia statistica per trarre conclusioni affidabili.
Analisi statistica
Ho utilizzato il software statistico SPSS 28.0 per l'analisi dei dati. GraphPad Prism 9.0 viene utilizzato per disegnare curve di sopravvivenza, mentre Lucidchart è usato per disegnare diagrammi di flux. Ho testato prima i dati dello studio per la distribuzione normale. Confrontare le caratteristiche di base tra il gruppo A e il gruppo B utilizzando un test t a campioni indipendenti per i dati di misurazione e un test χ2 per i dati di conteggio. Descrivevano le caratteristiche di base come conteggio [n (%)] e dati di misurazione (espressi come x ± s). Indicatori come HGF, NLR, PLR e CRP sono stati espressi come x ± s, e sono stati effettuati confronti intergruppi di questi indicatori utilizzando un test t a campioni indipendenti. L'analisi di regressione logistica binaria è stata utilizzata per indagare l'associazione tra livelli di HGF, punteggi IBPS e esiti patologici postoperatori (variabile dipendente, 1 = avversa, 0 = favorevole), con coefficienti di regressione positivi che indicano una correlazione positiva tra indicatori ed esiti avversi. Il metodo Kaplan-Meier è stato utilizzato per tracciare le curve OS e DFS dei gruppi A e B, e il test log-rank è stato applicato per confrontare le differenze statistiche nei tassi di sopravvivenza tra i gruppi. Il valore prognostico delle metriche sopra descritte per i pazienti OSCC è stato analizzato utilizzando la curva della caratteristica operativa del ricevitore (ROC) e l'area sotto la curva (AUC) per determinare il valore ottimale di cutoff, la sensibilità e la specificità. I dati di conteggio sono stati presentati come n (%), e il confronto tra il gruppo A e quello B è stato analizzato utilizzando il test χ2 . Tutti i test statistici erano bilaterali e P < 0,05 indicava una differenza statisticamente significativa.