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Effetti sulla qualità dell'RNA dei PBMC sotto diversi tempi di crioconservazione e metodi di elaborazione in pazienti con cancro polmonare avanzato non a piccole cellule

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DOI:

10.3791/70261

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21 aprile 2026

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1Biobank, Jilin Cancer Hospital, 2Medical Oncology Translational Research Lab, Jilin Cancer Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio confronta il Triple Isolation Reagent (TRIzol) e la soluzione classica (FBS + DMSO) per la criopreservazione dei PBMC dei pazienti NSCLC. TRIzol mantiene un'integrità soddisfacente dell'RNA fino a 6 mesi, il che lo rende raccomandato per la conservazione dell'RNA di alta qualità.

Abstract

Le cellule mononucleari del sangue periferico criopreservate (PBMC) sono ampiamente utilizzate nel sequenziamento dell'RNA (RNA-seq), e la qualità del loro RNA influenza direttamente gli esiti dei test. Tuttavia, la crioconservazione può facilmente portare alla degradazione dell'RNA nei PBMC, e la questione di come migliorare la qualità dell'RNA durante la crioconservazione a lungo termine rimane irrisolta. Sono stati utilizzati PBMCS da campioni di sangue fresco raccolti da pazienti con cancro polmonare avanzato non a piccole cellule (NSCLC) come controllo. L'efficacia di conservazione dell'RNA dei campioni di PBMC è stata confrontata tra la soluzione classica di crioconservazione cellulare (siero bovino fetale al 90% [FBS] + 10% dimetilsolfossido [DMSO]) e il reagente comune di estrazione di RNA (TRIzol) a -80 °C per 1, 3 e 6 mesi. La concentrazione, purezza e integrità dell'RNA (misurate dal numero di integrità dell'RNA [RIN]) sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis micro-volume multi-campione e un bioanalizzatore elettroforetico microfluidico automatico per fornire una base teorica alla conservazione di campioni di RNA di alta qualità. Questo studio ha dimostrato che la concentrazione, la purezza e l'integrità dell'RNA nei PBMC diminuivano con la durata prolungata della crioconservazione. Sebbene i due metodi di elaborazione non abbiano avuto effetto sulla concentrazione di RNA, hanno comunque influito sulla purezza e l'integrità dell'RNA. L'integrità dell'RNA dei PBMC criopriservati con TRIzol per 6 mesi è rimasta soddisfacente. I nostri risultati indicano che TRIzol contribuisce a una crioconservazione efficace e mantiene l'RNA di alta qualità.

Introduzione

L'RNA-seq della PBMC nei pazienti con NSCLC svolge un ruolo fondamentale nella valutazione dell'efficacia dell'immunoterapia. Il cancro ai polmoni a cellule non piccole (NSCLC) è un tumore maligno comune a livello mondiale, e circa il 70% dei pazienti viene diagnosticato in uno stadio avanzato con una prognosisfavorevole 1,2. L'immunoterapia ha rivoluzionato il paradigma terapeutico per le NSCLC, fornendo strategie terapeutiche innovative 3,4. Nel trattamento degli inibitori dei checkpoint immunitari (ICI), il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) ottenuto dai pazienti con NSCLC può monitorare i cambiamenti dinamici dei benefici clinicidell'immunoterapia 5. Le fonti campionarie per RNA-seq includono tessuto tumorale e PBMC 6,7, con PBMC che fungono da campione biologico vitale sia negli studi clinici che nella ricercascientifica di base8. La crioconservazione rappresenta il metodo principale per la conservazione a lungo termine dei campioni, mantenendo cellule e tessuti in uno stato di quiete preservandone il potenziale biologico e le caratteristiche. Di conseguenza, la crioconservazione dei PBMC è emersa come un approccio fattibile e ampiamente adottato. Cryopreservation PBMC facilita l'analisi batch dei campioni, minimizza la variabilità intra-laboratorio e inter-laboratorio e ottimizza l'utilizzo delle risorse 8,9. Ad esempio, studi hanno dimostrato che l'uso di un mezzo RPMI-1640 congelato integrato con 40% di siero fetale (FCS) e 20% di dimetil solfossido (DMSO) per la crioconservazione PBMC dimostra che le proporzioni di cellule T e B che esprimono la combinazione di CD39 e CD73 sono rimaste relativamente stabili entro sei mesi dallaconservazione 10. Uno studio ha confrontato tre kit commerciali di crioconservazione e due agenti crioprotettivi (90% RPMI-10% DMSO, 90% plasma-10% DMSO), rivelando una vitalità cellulare simile (81,0%) e tassi di recupero (73,7%) tra i metodi. Tuttavia, tutti i PBMC criopreservati hanno mostrato una vitalità significativamente ridotta rispetto ai campionifreschi 5. Ulteriori ricerche hanno dimostrato che il PBMC risospeso precipita nel reagente TRIzol e li congela immediatamente a -80 °C. Dopo 1–2 giorni, hanno osservato che il valore RIN dei PBMC era superiore a quello dei campioni di sangueintero 11.

Un'altra indagine ha confrontato campioni di leucociti trattati con TRIzol, RNAlater e altri reagenti, mostrando che tutti i metodi hanno raggiunto valori di numero di integrità dell'RNA (RIN) >7. L'integrità dell'RNA è stata valutata utilizzando un bioanalizzatore elettroforetico microfluidico automatico, e il RIN è stato calcolato come misura quantitativa della qualità dell'RNA. I campioni con RIN ≥7 sono stati considerati idonei per l'analisiRNA-seq 12. In particolare, il gruppo leucociti + RNAlater ha mostrato una resa RNA significativamente inferiore rispetto al gruppo leucociti +TRIzol 12. Tuttavia, le ricerche attuali sulla crioconservazione del PBMC si concentrano prevalentemente sulla vitalità cellulare e sull'analisi dei fenotipi delle cellule immunitarie dopo lo scongelamento; l'attenzione è stata dedicata in modo limitato alla valutazione sistematica e a lungo termine della qualità dell'RNA in diverse condizioni di conservazione. Inoltre, i protocolli standardizzati per la crioconservazione dei campioni di PBMC al fine di preservare l'integrità dell'RNA restano pocosviluppati 13,14,15. Questa lacuna è particolarmente rilevante per l'immunoterapia NSCLC, dove RNA di alta qualità proveniente da PBMC raccolti longitudinalmente è essenziale per la scoperta affidabile dei biomarcatori e il monitoraggio della risposta al trattamento.

In questo studio, ipotizziamo che la scelta del metodo di criopreservazione influenzi significativamente l'integrità e la qualità a lungo termine dell'RNA derivato dalle PBMC, e un protocollo ottimizzato può mantenere l'idoneità dell'RNA per test sensibili come l'RNA-seq. Per affrontare questo problema, sono stati utilizzati PBMC appena isolati da campioni di sangue raccolti da pazienti avanzati con NSCLC come controlli. L'efficacia di conservazione dell'RNA dei campioni di PBMC è stata confrontata tra due metodi di trattamento (90% FBS + 10% DMSO e TRIzol) a -80 °C per 1, 3 e 6 mesi (Figura 1). La concentrazione, purezza e integrità dell'RNA (misurate dal RIN) sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis micro-volume multi-campione e un bioanalizzatore elettroforetico microfluidico automatizzato. Questo studio mira a fornire una base teorica per la conservazione di campioni di RNA di alta qualità e a promuovere la ricerca traslazionale e la conservazione del campione nella medicina di precisione dei tumori.

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Protocollo

Tutte le procedure che hanno coinvolto campioni di tessuto umano e campioni clinici in questo studio sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Oncologico di Jilin (Approvazione etica n. 202507-002-01). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti o dai loro tutori legali prima della raccolta del campione. Campioni di sangue periferico (10 mL per paziente) sono stati raccolti da 19 pazienti con cancro polmonare non a piccole cellule avanzato (NSCLC) presso il Jilin Cancer Hospital, ottenendo un totale di 133 campioni di RNA. Per garantire la sicurezza del laboratorio, tutte le operazioni che coinvolgevano sostanze chimiche pericolose venivano eseguite in un armadietto di sicurezza biologica.

Informazioni dettagliate sugli strumenti, reagenti e consumabili utilizzati nell'esperimento sono state fornite nella Tabella dei Materiali.

Isolamento del PBMC
I campioni di sangue periferico sono stati processati per l'isolamento PBMC entro 2 ore dalla prelievo. I PBMC sono stati isolati e purificati tramite centrifugazione a gradiente di densità Ficoll-Paque a 400 × g per 25 minuti a temperatura ambiente con il freno disabilitato. Dopo la centrifugazione, lo strato linfociti bianchi lattiginosi intermedi (contenente PBMC) è stato aspiratocon cura 16. È importante sottolineare che abbiamo standardizzato rigorosamente la concentrazione di input PBMC per ogni campione e per ogni gruppo, per garantire numeri di cellule coerenti in tutte le condizioni sperimentali, minimizzando così la variazione causata dall'input e dall'elaborazione delle cellule. Questo garantisce che le differenze osservate riflettano effetti reali di diversi metodi di conservazione piuttosto che la variabilità tecnica. Per ogni paziente, i PBMC isolati sono stati suddivisi in 7 tube: un tubo è stato utilizzato per l'estrazione immediata di RNA e sono state valutate concentrazione, purezza e integrità. I restanti sei tubi sono stati criopconservati a una velocità di raffreddamento di -1 °C/min: tre sono stati trattati con 1 mL di 90% FBS + 10% DMSO, e gli altri tre con 1 mL di TRIzol, seguiti da una conservazione a -80 °C. L'estrazione e la valutazione della qualità dell'RNA sono state effettuate dopo 1, 3 e 6 mesi di conservazione congelata.

Estrazione di RNA
I campioni venivano rimossi da una stoccaggio a -80 °C e scongelati a 4 °C fino a17 fino a 17 fino a essere completamente scongelati. I campioni conservati con soluzione di crioconservazione 90% FBS + 10% DMSO o TRIzol sono stati lavati una volta con PBS, centrifugati a 200 × g per 5 minuti a 4 °C, e il surnatante è stato scartato per trattenere il pellet cellulare. L'RNA totale è stato estratto utilizzando TRIzol. In particolare, il reagente TRIzol veniva aggiunto al tubo della microcentrifuga contenente il campione processato, miscelato per inversione e incubato a temperatura ambiente per 5 minuti per garantire una lisi completa. Successivamente, sono stati aggiunti 200 μL di cloroformio, mescolati accuratamente tramite scuotimento e incubati a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo la centrifugazione a 2400 × g per 15 minuti a 4 °C, la fase acquosa superiore è stata atmosfericata con cura e trasferita in un nuovo tubo di Eppendorf. È stato poi aggiunto isopropanolo (0,5 mL), mescolato bene e incubato a temperatura ambiente per 5–10 minuti. Dopo centrifugazione a 2400 × g per 10 minuti a 4 °C, il sovrantantante veniva scartato, lasciando il precipitato di RNA sul fondo del tubo.

Il precipitato è stato risospeso al 75% di etanolo (1 mL) con lieve scuotitura, seguito da centrifugazione a 1600 × g per 5 minuti a 4 °C. Il surnatante veniva scartato e il pellet di RNA veniva lasciato asciugare all'aria a temperatura ambiente per 5–10 minuti. Infine, i campioni di RNA sono stati disciolti in acqua trattata con DEPC da 50 μL e incubati in un bagno d'acqua a 55–60 °C per 5–10 minutie 18 minuti. Rilevamento della concentrazione e purezza dell'RNA. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state misurate utilizzando il metodo dell'assorbanza ultravioletta con uno spettrofotometro UV-Vis micro-volume multi-campione (intervallo di misurazione: 2,5–3000 ng/μL). La concentrazione di RNA è stata determinata in base al valore di assorbanza a 260 nm, mentre la purezza dell'RNA è stata valutata utilizzando il rapporto A260/A280. Fu lanciato il software di misurazione; "Nucleic Acid" fu cliccato sull'interfaccia principale. La piattaforma di rilevamento è stata risciacquata due volte con acqua doppiamente distillata, poi 1,5 μL del campione di RNA è stato pipettato sopra. È stato selezionato l'RNA-40 per il tipo di campione, è stato cliccato "Measure" e sono stati registrati i valori di concentrazione e purezza di A260/280. Un rapporto A260/A280 tra 1,9 e 2,1 indicava un'elevata purezza dell'RNA, mentre valori inferiori a 1,8 suggerivano contaminazione proteica, e valori superiori a 2,2 indicavano potenziale degradazione dell'RNA o isotiocianatoresiduo 19.

Rilevamento dell'integrità dell'RNA
L'integrità dell'RNA (RIN) è stata valutata utilizzando un bioanalizzatore elettroforetico microfluidico automatizzato e un kit di rilevamento. La RIN varia da 1 a 10, con 1 che indica RNA altamente degradato e 10 che indica RNA intatto. Per l'analisi, 1,2 μL di RNA veniva inserito in un tubo PCR, denaturato termicamente a 70 °C per 2 minuti tramite un termociclatore, e immediatamente posto sul ghiaccio. Successivamente, 1 μL di RNA denaturato è stato aggiunto ai pozzi di rilevamento del chip per l'analisi20. Il software veniva avviato, selezionato "Assay" e "RNA" selezionato dal menu a tendina. Il programma "Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy" è stato selezionato in base al reagente utilizzato. "Start" fu cliccato per avviare la rilevazione. Dopo circa 10 minuti, il numero di picco e l'altezza massima della scala sono stati controllati per verificare la normalità.

Metodi statistici
Sono stati eseguiti test di normalità per tutti i dati. I dati normalmente distribuiti sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD), mentre i dati non normalmente distribuiti sono stati espressi come mediana (intervallo interquartile, IQR). I confronti tra due gruppi sono stati analizzati utilizzando il test t accoppiato per dati normalmente distribuiti e il test non parametrico a campioni correlati per dati non normalmente distribuiti. Per confronti tra tre o più gruppi, è stata utilizzata l'analisi di varianza a misure ripetute per dati normalmente distribuiti, mentre il test non parametrico a campioni correlati è stato utilizzato per dati non normalmente distribuiti. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 19.0 e GraphPad Prism 9.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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Risultati

Effetti dei diversi tempi di crioconservazione e metodi di elaborazione sulla concentrazione di RNA nei campioni di PBMC
L'effetto dei diversi tempi di crioconservazione: i campioni freschi di PBMC provenienti da pazienti avanzati con NSCLC hanno servito come gruppo di controllo. I campioni sono stati trattati con TRIzol o 90% FBS + 10% DMSO e conservati a -80 °C per 1, 3 e 6 mesi; l'RNA totale è stato estratto per misurare la concentrazione di RNA. Per i campioni tra...

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Discussione

Molti fattori influenzano la qualità dell'RNA nei campioni biologici, tra cui variabili pre-analitiche, condizioni di trasporto, durata del processo a temperatura ambiente, necrosi tissutale, prodotti di temperatura e congelamento, dimensione e numero di aliquote, così come la durata di stoccaggio, hanno un impatto significativo sulla qualitàdell'RNA 21. Per campioni identici, variazioni nei tempi di crioconservazione e nei metodi di elaborazione possono influenza...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo con gratitudine i partecipanti per il loro aiuto nell'esperimento e per il supporto al fondo. Questo studio è stato supportato dai finanziamenti del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia del Jilin (Grant n.YDZJ202501ZYTS691), della Health Commission della provincia di Jilin (Grant No.2023jc064).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bioanalizzatore Agilent 2100AgilentG2939BRilevamento dell'integrità dell'RNA, valutazione della qualità dell'RNA generando il Numero di Integrità dell'RNA (RIN)
Agilent RNA 6000 NanokitAgilent5067-1511         In collaborazione con l'Agilent 2100 Bioanalyzer, fornisce reagenti e chip dedicati per l'integrità dell'RNA
Centrifuga                                                         Eppendorf   5424RPer l'estrazione dell'RNA
Centrifuga                                           Eppendorf   5810RPer l'estrazione del PBMC
Cloroformio                                 China National Pharmaceutical Group Corporation20191031Per l'estrazione dell'RNA con il metodo Trizol, viene utilizzato per separare la fase acquosa contenente RNA da quella organica contenente impurità
DimetilsolfossidoBeijing Dingguo ChangshengDH105-2Come soluzione di criopreservazione per i PBMC, che consente la conservazione a lungo termine di campioni a -80 e gradi; C
TuboCorningMCT-150-CPer la conservazione del campione, la miscelazione di reagenti, la centrifugazione e altre operazioni sperimentali
EtanoloShandong Lierkang25071901AEstrazione di RNA IIn tramite il metodo Trizol, utilizzata per lavare i precipitati di RNA per rimuovere i residui
Siero bovino fetaleXpbiomedC04001-500Come soluzione di crioconservazione per PBMC, che consente la conservazione a lungo termine di
Soluzione di separazione di FicollBeijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTDCC0161Per isolamento e purificazione del PBMC tramite centrifugazione a gradiente di densità
GeneTouch(Plus) Thermal cyclerBioerTC-EA-48DAPer la denaturazione termica dell'RNA (70 e deg; C per 2 minuti), seguita dalla rilevazione con il bioanalizzatore
IsopropanoloChina National Pharmaceutical Group Corporation20210929Nell'estrazione dell'RNA tramite il metodo Trizol, utilizzato per la precipitazione dell'RNA
Spettrofotometro Nanodrop 8000GeneCompanyND-8000Per la concentrazione di RNA (basata sull'assorbenza a 260 nm) e la purezza (basata sul rapporto A260/A280) utilizzando il metodo dell'assorbanza ultravioletta
Tubi PCRCorningPCR-02-CPer la denaturazione termica dell'RNA (70 e deg; C per 2 minuti), seguita dalla rilevazione con il bioanalizzatore
Soluzione salina tamponata con fosfato & nbsp;Sistema ProcellPB180327Per la lisi diretta e la conservazione dei PBMC, o del successivo RNA totale
Reagente di Triplo Isolamento  Adsinads60154Per la lisi diretta e la conservazione dei PBMC, o del successivo RNA totale

Riferimenti

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