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Articolo di ricerca
Questa ricerca ha scoperto livelli aumentati di HMGA1 e una diminuzione dell'espressione di HAND1 nel cancro della laringe, indicando una relazione inversa e associazioni significative con metastasi e stadio clinico, suggerendo che entrambi contribuiscono alla progressione tumorale.
Questo studio ha indagato i profili di espressione dei geni HMGA1 e HAND1 nel carcinoma squamoso laringeo (LSCC) così come nei tessuti mucosi laringei normali adiacenti tramite l'applicazione di metodologie immunoistochimiche e RT-PCR. L'obiettivo era indagare i possibili ruoli nel lancio, avanzamento, invasione e metastasi del LSCC. Sia HMGA1 che HAND1 sono stati rilevati in tessuti cancerosi e normali adiacenti. Tuttavia, HMGA1 ha mostrato un'espressione significativamente elevata nei tessuti LSCC, mentre HAND1 ha mostrato livelli di espressione notevolmente ridotti. L'espressione elevata di HMGA1 è stata positivamente associata a metastasi linfatica (100,0% contro 50,0%) e a stadio clinico avanzato (91,7% contro 44,4%), ma non è stata associata al grado istologico tumorale, al tipo clinico o all'età del paziente. Al contrario, la riduzione dell'espressione della proteina HAND1 era associata a metastasi linfonodali, stadio clinico e grado patologico, suggerendo un ruolo nella progressione e metastasi tumorale. Inoltre, è stata osservata una correlazione lineare negativa tra le espressioni di HMGA1 e HAND1, suggerendo una potenziale interazione regolatoria in cui HMGA1 potrebbe sopprimere l'espressione di HAND1. Questi risultati implicano che HMGA1 e HAND1 abbiano funzioni complementari nella patogenesi delle LSCC, con HMGA1 che potenzialmente facilita lo sviluppo tumorale e HAND1 che funge da soppressore. L'interazione tra questi due geni può offrire nuove prospettive sui meccanismi molecolari che guidano la progressione e la metastasi delle LSCC.
Il tumore della laringe è il secondo tumore maligno primario più comune della testa e del collo, dopo il cancro al riforniringeo, rappresentando il 26%–30% di tutti i tumori alla testa e al collo nelmondo 1. Oltre il 90% dei tumori laringei è classificato come carcinoma squamoso laringeo (LSCC)2. I trattamenti principali per il cancro della laringe sono la chirurgia e la radioterapia. La recidiva locale e la metastasi dei linfonodi sono le principali cause di morte nei pazienti con cancro della laringe. Pertanto, la gestione efficace della recidiva e della metastasi rimane una sfida clinica importante. Con il progresso della biologia molecolare, sono stati identificati vari geni con espressione anomala nel cancro della laringe. Tuttavia, i meccanismi alla base dell'invasione tumorale e delle metastasi nel cancro laringeo rimangono poco chiari e restano un'area che richiede ulteriori indagini.
Le proteine del gruppo A ad alta mobilità (HMGA) sono proteine non istone-leganti la cromatina situate nel nucleo cellulare. HMGA1 si lega al DNA e alle proteine associate, inducendo alterazioni strutturali della cromatina che regolano la trascrizionegenica 3. Come regolatore trascrizionale associato alla cromatina, HMGA1 modula l'espressione di molteplici geni tumorili coinvolti nella proliferazione e nella metastasi. Studi precedenti hanno dimostrato che HMGA1 è sovraespressa in un'ampia gamma di tumori umani, tra cui tiroide, colorettale, pancreas, e neoplasie di testa e collo 4,5,6,7, oltre ad altri tumori epiteliali e solidi riportati in letteratura. HMGA1 regola la tumorigenesi modulando l'espressione di molteplici geni bersaglio a valle coinvolti nella proliferazione emetastasi 8.
I geni espressi da HAND (derivati cardiaci e della cresta neurale) sono membri della famiglia bHLH (elica–loop–elica basica), inclusi HAND1 e HAND2. HAND1, come fattore di trascrizione, svolge un ruolo nella differenziazione dei trofoblast e nello sviluppo delcuore 9. Tuttavia, il meccanismo di espressione di HAND1 nello strato cellulare extra-embrionale rimane poco chiaro. È stato confermato che HMGA1 si lega direttamente al promotore HAND1, inibendo l'attività di HAND1 sia in vivo che invitro 10. HAND1, in quanto proteina repressore, è stata implicata nella regolazione della differenziazione cellulare e della formazione del cancro. Gli studi hanno rilevato che l'espressione di HAND1 è silenziata e ipermetilata nel cancro gastricoumano 11, nel cancropancreatico 12, nel cancroovarico 13 e nel cancrotiroideo 14. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, studi limitati hanno studiato l'espressione di HAND1 nei tessuti tumorali della laringea.
Nel presente studio, sono state utilizzate immunoistochimiche (metodo di rilevamento in due fasi) e reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) per rilevare l'espressione delle proteine HMGA1 e HAND1 e dell'mRNA nelle LSCC e nei tessuti mucosi normali adiacenti. L'immunoistochimica consente la visualizzazione della localizzazione delle proteine all'interno dell'architettura tissutale, mentre la RT-PCR consente la rilevazione sensibile dell'espressione genica a livello trascrizionale, fornendo informazioni complementari sui modelli di espressione di proteine e mRNA. Rispetto alla PCR quantitativa (qPCR), che offre maggiore sensibilità e quantificazione precisa, al Western blotting, che consente la validazione a livello proteico ma manca di contesto spaziale, e al sequenziamento dell'RNA (RNA-seq), che offre una profilazione trascritomica completa ma richiede un'analisi computazionale avanzata, l'uso combinato di immunoistochimica e RT-PCR rappresenta una strategia economicamente efficace e clinicamente applicabile per la ricerca dei biomarcatori. Lo studio mirava a esplorare il ruolo e la correlazione di questi due fattori nell'occorrenza, nello sviluppo, nella progressione e nella metastasi delle LSCC. Inoltre, la valutazione dell'espressione di HMGA1 e HAND1 potrebbe fornire biomarcatori per la diagnosi e la valutazione prognostica nel cancro della laringe, potenzialmente migliorando la stratificazione del rischio e facilitando le decisioni cliniche.
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Questo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico della Ricerca dell'Ospedale Popolare Shijiazhuang (Approvazione n. YKLS 2026 n. 041; 27 marzo 2026). Lo studio è stato condotto in conformità con i Regolamenti sulla Revisione Etica della Ricerca Biomedica che coinvolge Soggetti Umani, i Regolamenti sulla Revisione Etica delle Scienze della Vita e della Ricerca Medica che coinvolgono Soggetti Umani, la Dichiarazione di Helsinki e le Linee Guida Etiche Internazionali per la Ricerca Sanitaria che coinvolge l'Uomo. Campioni di tessuto umano sono stati prelevati da campioni chirurgici archiviati in conformità con i requisiti etici istituzionali, garantendo l'anonimizzazione e la riservatezza dei dati dei pazienti. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai partecipanti, oppure è stata concessa una deroga al consenso dal comitato etico per l'uso di campioni archiviati anonimizzati, a seconda delle applicazioni.
Materiali sperimentali
Fonte degli esemplari
Un totale di 42 casi di tessuti LSCC e 25 casi di tessuti mucososi laringei normali adiacenti sono stati prelevati da campioni chirurgici di resezione LSCC presso il Dipartimento di Otolaringoiatria-Chirurgia della Testa e del Collo dell'Hebei tra febbraio 2011 e agosto 2012. Tra questi, 25 casi di mucosa normale adiacente (prelevati da un sito > 1,0 cm dal bordo del cancro) sono stati patologicamente confermati come mucosa infiammatoria o normale. I 42 campioni LSCC sono stati tutti patologicamente confermati come carcinoma a cellule squamose. Tutti i tessuti venivano conservati a -80 °C. I 42 pazienti erano uomini, senza pazienti femminili. Tra i casi LSCC, 15 erano ben differenziati, 18 moderatamente differenziati e 9 scarsamente differenziati. Diciotto casi hanno avuto metastasi linfonodale, mentre 24 casi no. La stadiazione clinica si basava sul sistema di classificazione e stadiazione TNM (UICC, 2002), con 20 casi nelle fasi I e II, e 22 casi nelle fasi III e IV. Sono stati presenti 30 casi di tipo supraglottico, 11 casi di tipo glottico e 1 caso di tipo subglottico. La fascia d'età dei pazienti era di 40 a 75 anni, con un'età mediana di 60 anni. Nessuno dei pazienti ha ricevuto radioterapia o chemioterapia prima dell'intervento chirurgico e i dati clinici erano completi.
Metodi sperimentali e passaggi
Procedura di colorazione HE
Preparazione delle vetrine e colorazione con ematossilina–eosina
I vetrini di vetro per immunoistochimica venivano prima immersi in acido concentrato per 24 ore, seguiti da un lavaggio accurato sotto acqua del rubinetto corrente per almeno 10 minuti per rimuovere l'acido residuo, e immersione in acqua distillata per 30 minuti, due volte con una delicata agitazione per garantire un risciacquo completo. Dopo aver lasciato in ammollo al 95% di etanolo per 2 ore, i vetrini sono stati asciugati in forno a 60 °C, poi immersi in una miscela APES: acetone (1:49, v/v) per 1 minuto con una lieve agitazione per garantire un rivestimento uniforme, seguito da un risciacquo con acetone puro. Infine, venivano asciugate all'aria a temperatura ambiente (20–25 °C) per garantire una corretta adesione dei tessuti durante le successive procedure di colorazione.
Le sezioni di tessuto immerse in paraffina sono state immerse sequenzialmente nello xilene I e nello xilene II per 10 minuti ciascuna per rimuovere la paraffina, seguite da una reidratazione tramite etanolo gradato (100%, 95%, 80%) per 5–10 minuti ciascuna, e infine risciacquate in acqua distillata per 2 minuti. Le sezioni sono state poi sottoposte a colorazione con ematossilina–eosina (HE) come segue: colorazione con ematossilina per 4 minuti, risciacquo sotto acqua corrente del rubinetto per 3 minuti con flusso continuo per rimuovere l'eccesso di colorazione, differenziazione usando acido cloridrico all'1% in etanolo per 30 secondi, lavaggio tre volte con acqua del rubinetto per terminare la differenziazione e colorazione con eosina per 10 secondi. La disidratazione graduale di routine è stata eseguita in sequenza utilizzando successivamente 70% etanolo, 80% etanolo, 95% etanolo, etanolo anidro I ed etanolo anidro II per 5 minuti ciascuno. Dopo l'asciugatura, la carrella veniva montata usando balsamo neutro.
Procedura immunoistochimica
Sono state tagliate sezioni di paraffina di 4 μm di spessore, appiate su vetrine rivestite con APES e poste in forno a 67 °C durante la notte, seguite da una deparafinizzazione con Xylene I e II per 10 minuti ciascuna. La disidratazione graduale è stata effettuata usando alcol al 100%, 90% e 70% per 5 minuti ciascuno, seguita da un lavaggio con acqua del rubinetto e acqua distillata per 3 minuti. Per bloccare l'attività endogena della perossidasi, le vetrine sono state incubate con una soluzione fresca di perossido di metanolo e idrogeno al 3%, garantendo una copertura completa della sezione tissutale a temperatura ambiente (20–25 °C) per 20 minuti, seguiti da tre lavaggi con acqua distillata per 5 minuti in PBS di 0,01 M.
Il recupero dell'antigene è stato eseguito immergendo vetri in un tampone di citrato (pH 6,0) e riscaldando in una pentola a pressione a ~ 95–100 °C per 8 minuti per HMGA1 e 10 minuti per HAND1 con i coperchi ben chiusi per mantenere condizioni di pressione costanti. Le sezioni sono state poi raffreddate a temperatura ambiente (20–25 °C) e lavate tre volte in 0,01 M PBS per 3 minuti ciascuna sotto delicata agitazione. Gli anticorpi primari contro HMGA1 e HAND1 sono stati diluiti nel diluente anticorpale (rispettivamente 1:150 e 1:100) e mescolati delicatamente tramite pipettaggio prima di essere applicati in modo uniforme per coprire completamente ogni sezione di tessuto. Le vetri sono state incubate durante la notte a 4 °C in una camera umidificata. Dopo un'incubazione notturna, le vetrine sono state rimosse dalla camera umidificata e lasciate in equilibrio a temperatura ambiente per 10 minuti. I vetrini sono stati lavati tre volte con 0,01 M PBS (5 min per lavaggio) sotto una delicata agitazione per rimuovere gli anticorpi non legati. Il liquido in eccesso è stato rimosso e è stato aggiunto un anticorpo secondario (polimero anti-coniglio/topo marcato con HRP) per coprire completamente le superfici delle sezioni tissutali. Ulteriori incubazioni sono state eseguite a 37 °C per 35 minuti.
La soluzione di substrato DAB è stata applicata a goccia per coprire il tessuto, e lo sviluppo del colore è stato monitorato al microscopio per 1–3 minuti fino alla comparsa delle macchie marroni, che si è fermata immediatamente risciacquando con acqua distillata una volta raggiunta l'intensità ottimale della colorazione. Sono stati eseguiti re-colorazioni con ematossilina, differenziazione dell'acido cloridrico e soluzione di ammoniaca per la inversione blu. A questo è seguito una disidratazione alcolica graduata di routine, trasparenza dello xilene e montaggio con balsamo neutro per l'osservazione al microscopio. Il PBS veniva utilizzato come controllo a vuoto al posto dell'anticorpo primario. Inoltre, come controlli positivi, sono state utilizzate sezioni di tessuto squamoso carcinoma di testa e collo e testa e col precedentemente positive a HMGA1 e sezioni di tessuto placentario positivo a HAND1 per garantire la qualità e la consistenza della colorazione.
Determinazione del risultato
Il cromogeno utilizzato in questo esperimento è il sistema DAB-H2O2. Dopo la ricolorazione dell'ematossilina, la colorazione positiva di HMGA1 e HAND1 si osserva principalmente nel nucleo cellulare, con una certa colorazione citoplasmatica. Per la valutazione, la regione con la maggiore densità di cellule colorate positivamente è stata identificata con un basso ingrandimento (×40). Con un ingrandimento ×100, sono stati selezionati cinque campi con la massima densità cellulare positiva e sono state conteggiate 100 celle in ciascun campo. La percentuale media di celle positive dei cinque campi viene utilizzata come risultato per ogni diapositiva. I criteri di valutazione erano i seguenti: nessuna cellula colorata (-), cellule positive < 25% (+), cellule positive 25%–50% (++) e cellule positive > 50% (+++), basate su un metodo di punteggio percentuale semi-quantitativo comunemente utilizzato nelle analisi immunoistochimiche. La valutazione è stata effettuata indipendentemente da due patologi qualificati in modo doppiocieco 15, 16, 17. Se le loro opinioni differiscono, dovrebbero discutere e giungere a unaconclusione 18.
Metodo RT-PCR
Primers
I primer sono stati progettati utilizzando software di progettazione di primer basato su sequenze geniche target, con attenzione alla specificità dell'inn, alla compatibilità con la temperatura di fusione e alla dimensione attesa del prodotto. Le sequenze dettagliate degli innesco, le dimensioni dei prodotti e le temperature di ricottura sono riassunte nella Tabella 1. Gli innesco sono stati sintetizzati a una concentrazione di 2 OD, divisi in due tubi e diluiti a 10 pmol/μL con acqua trattata con DEPC per la conservazione a -20 °C. La temperatura di ricottura è stata calcolata usando la formula: Tm = 2(A + T) + 4(G + C)
Trattamento RNase di materiali e apparecchiature sperimentali:
Articoli in plastica (ad esempio, punte di pipetta, tubi EP): Gli oggetti di plastica venivano posti in una bottiglia sterilizzata con reagenti a bocca larga, veniva aggiunta acqua preparata trattata con DEPC fino a quando gli oggetti non erano completamente sommersi, e i materiali venivano incubati durante la notte in una cappa a temperatura ambiente (20–25 °C). Sono poi stati sterilizzati sotto pressione per 120 minuti e asciugati a 65 °C.
Oggetti in vetro: La vetreria è stata immersa tutta la notte nell'acido, sciacquata accuratamente, essiccata, avvolta nella carta stagnola e cotta in forno a 200 °C per 6 ore e conservata in un luogo pulito per un uso futuro.
Oggetti in metallo (ad esempio, forbici, pinzette): Gli oggetti in metallo venivano puliti, cotti in forno a 200 °C per 6 ore e conservati in un luogo pulito per un uso futuro.
Preparazione delle soluzioni
Soluzione DEPC 0,1% (v/v): 1 mL di DEPC è stato aggiunto a 1000 mL di acqua distillata per ottenere una concentrazione finale dello 0,1% (v/v), agitato bene, incubato a 4 °C durante la notte, sterilizzato tramite autoclaving e conservato a 4 °C.
75% (v/v) Soluzione di etanolo: 75 mL di etanolo assoluto sono stati miscelati con 25 mL di acqua trattata con DEPC per ottenere una concentrazione finale del 75% (v/v), e conservati a 4 °C.
Estrazione totale di RNA dal tessuto
Dopo l'estrazione dell'RNA, l'integrità dell'RNA è stata valutata prima della trascrizione inversa e dell'analisi a valle. 80 mg di tessuto venivano pesati con una bilancia elettronica, tagliati in piccoli pezzi e posti in un omogeneizzatore di vetro pretrattato. È stato aggiunto 1 mL di reagente di estrazione di RNA pre-raffreddato a 4 °C, e il campione è stato omogeneizzato sul ghiaccio tramite macinazione ripetuta fino a ottenere un lisato uniforme senza frammenti di tessuto visibili, evitando la formazione di bolle. La miscela omogenea è stata trasferita in un tubo EP privo di RNasi da 1,5 mL e incubato sul ghiaccio per 5 minuti. Sono stati aggiunti 400 μL di cloroformio a ogni provetta, vortice vigorosamente per 10–15 secondi per garantire una miscelazione completa delle fasi, seguita da incubazione sul ghiaccio per 5 minuti. I tubi sono stati centrifugati a 4 °C, 12.000 x g per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, la fase acquosa superiore veniva accuratamente aspirata utilizzando una pipetta senza RNasi senza disturbare lo strato di interfase in un nuovo tubo. Un volume uguale di isopropanolo è stato aggiunto, miscelato invertendo delicatamente il tubo 8-10 volte fino a che gli strati sono scomparsi, e incubato a -20 °C per almeno 10 minuti. La miscela è stata centrifugata a 4 °C, 12.000 x g per 10 minuti. Lo strato sovrantantante fu scartato, aggiungendo 400 μL di etanolo gelato al 75% per sospendere il pellet di RNA. La miscela è stata nuovamente centrifugata a 4 °C, 12.000 x g. per 5 minuti. Lo strato sovrantantante fu scartato e il pellet di RNA fu leggermente secco. Il pellet di RNA è stato disciolto in acqua priva di RNasi e conservato a -80 °C per un uso futuro.
Rilevamento dell'integrità dell'RNA
Per la rilevazione dell'integrità dell'RNA, 5 μL di campione di RNA sono stati miscelati con 5 μL di buffer di carico blu di bromofenolo, e l'elettroforesi è stata eseguita su un gel di agarosio al 2%. L'integrità dell'RNA era considerata accettabile quando erano visibili bande chiare 28S, 18S e 5S senza evidenti sbavamenti.
Trascrizione inversa (RT) per sintetizzare cDNA
6 μL di RNA sono stati preriscaldati a 70 °C per 10 minuti, poi 25 mM diMgCl2 (4,0 μL), dNTP (2,0 μL), AMV (0,7 μL), 10× AMV Buffer (2,0 μL), oligo(dT) (1,0 μL), RNasin (0,5 μL) e acqua deionizzata sono stati aggiunti sequenzialmente sul ghiaccio per ottenere un volume di reazione finale di 20 μL, seguiti da una miscelazione delicata e una breve centrifugazione. Le condizioni di reazione erano 25 °C per 1 minuto, 42 °C per 60 minuti, 98 °C per 5 minuti, e poi conservate a 4 °C indefinitamente. Una volta raggiunta i 4 °C, il prodotto veniva estratto dalla macchina PCR, usato come modello di cDNA per la reazione PCR successiva e conservato a -20 °C per un uso successivo.
Amplificazione PCR
Per ogni reazione PCR, la miscela conteneva un template di cDNA (1 μL), un primer diretto specifico per HMGA1, HAND1 o GAPDH (1 μL), un primer inverso specifico per il gene target o GAPDH (1 μL), un mix master PCR (10 μL) e acqua trattata con DEPC (7 μL), per un volume totale di 20 μL. Sono state preparate reazioni separate per ogni gene bersaglio (HMGA1, HAND1) e il gene di controllo interno (GAPDH), con ciascuna reazione contenente la rispettiva coppia di primer anteriore e inverso specifica per il gene.
Il volume totale di reazione era di 20 μL. Dopo aver miscelato delicatamente i componenti della reazione e aver centrifugato brevemente per 5–10 secondi a bassa velocità, il tubo veniva posto in una macchina PCR preriscaldata e amplificato secondo le condizioni di reazione nella Tabella 2.
Conferma e analisi di prodotti amplificati per PCR
Preparazione del gel
2 g di agarosio venivano pesati e posti in una fiaschetta triangolare. Sono stati aggiunti 2 mL di tampone di elettroforesi TAE al 50× e 100 mL di acqua distillata (preparare un gel di agarosio al 2%), poi riscaldati in un forno a microonde con vortici intermittenti (intervalli di 15–20 secondi) fino a quando l'agarosio si è completamente dissolto. Dopo il raffreddamento a circa 55 °C, sono stati aggiunti 10 μL di soluzione EB e mescolati accuratamente. Il gel veniva poi versato in una vassoia pulita a temperatura ambiente (20–25 °C), lavato con acqua distillata e inserito un pettine per creare pozzi campione. Lo spessore del gel era di 0,4 cm. Il vassoio veniva posizionato su una superficie piana a temperatura ambiente (20–25 °C) per 30 minuti fino a quando il gel non si solidificava completamente. Il pettine fu rimosso con cura.
Caricamento campioni
4 μL di ogni campione di DNA venivano aggiunti nei pozzi del gel, e il DNA Marker veniva aggiunto al pozzo più a sinistra.
Elettroforesi
Il vassoio del gel caricato veniva inserito in un serbatoio di elettroforesi riempito con tampone di elettroforesi TAE, assicurando che il livello del tampone rimanesse circa 1 mm sopra la superficie del gel. Un'estremità dei pozzi era al catodo (per permettere al DNA di migrare verso l'anodo). Il sistema di elettroforesi era collegato a un alimentatore e funzionava a 120 V e 60 mA per circa 45 minuti, fino a quando il buffer di carico non si spostava oltre la linea centrale del gel, dopodiché l'alimentazione veniva spente.
Osservazione e imaging dei risultati
Dopo l'elettroforesi, il gel è stato accuratamente rimosso e i risultati sono stati osservati con un transilluminatore UV e confrontati con il DNA Marker per determinare se il peso molecolare dei frammenti amplificati apparisse nelle posizioni previste. Il sistema di imaging a gel veniva utilizzato per catturare immagini e salvare i risultati sul computer.
Configurazione dei comandi
Al posto del cDNA veniva usata acqua distillata come controllo negativo.
Analisi semi-quantitativa
I risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio sono stati analizzati e catturati utilizzando il sistema di imaging in gel. Veniva utilizzato un software di analisi delle immagini per analizzare la luminosità delle bande. Sono stati misurati i valori di OD assolutamente integrati della banda di amplificazione genica target e della corrispondente banda di amplificazione genetica di controllo interno. I risultati sono stati espressi come il rapporto tra il valore OD integrato assoluto della banda target e il valore OD integrato assoluto della corrispondente banda di controllo interna.
Cioè, espressione relativa = valore OD del gene target / valore OD del gene di controllo interno.
Analisi statistica
Tutti i dati venivano organizzati tramite Excel e analizzati tramite software statistici. Le variabili continue sono state espresse come media ± deviazione standard (SD) e confrontate tra due gruppi utilizzando il test t a campioni indipendenti. Le variabili categoriche nominali, inclusi i tassi di espressione positiva immunoistochimica, sono state analizzate utilizzando il testχ-2 . Le variabili ordinali categoriche, inclusi grado patologico e stadio clinico, sono state analizzate utilizzando il test della somma dei rangi (test Mann-Whitney U per confronti a due gruppi, dove applicabile). La correlazione tra l'espressione di HMGA1 e HAND1 è stata valutata utilizzando un'analisi di correlazione lineare. Tutti i test erano a doppia coda; P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo, mentre P. < 0,01 è stato considerato altamente significativo.
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Risultati di rilevamento immunoistochimico
Sono mostrate immagini rappresentative di colorazione ematossilina–eosina (HE) che illustrano la morfologia istologica della mucosa laringea normale adiacente e delle LSCC con diversi gradi di differenziazione (bene, moderato e scarso). In particolare, la Figura 1A mostra la mucosa laringea normale adiacente, la Figura 1B mostra LSCC ben diff...
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Il cancro laringeo, uno dei tumori più comuni della testa e del collo, ha mostrato un'incidenza crescente negli ultimi anni, probabilmente associato a fattori ambientali e legati allo stile di vita. Come altri tumori maligni, la recidiva e la metastasi rimangono le principali cause di morte. Con i progressi nella biologia molecolare, sono stati identificati molti fattori associati allo sviluppo del cancro della laringe, ma i meccanismi di insorgenza e metastasi non sono ancora completame...
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Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della loro istituzione e di tutti gli individui che hanno contribuito a questo studio.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Macchina automatica per l'incassamento dei tessuti | Sakura Finetek, Tokyo, Giappone | Tissue-Tek TEC 5 | Incorporamento della paraffina |
| Microtomo | Leica Microsystems, Wetzlar, Germania | RM2135 | Sezionamento (4 & mu; m) |
| Asciugatore a slitta | Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., Cina | CS-VI | Asciugatura a vetrata |
| Incubatore di riscaldamento | Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., Cina | 303-4A | Incubazione a temperatura controllata |
| Microscopio ottico | Olympus Corporation, Tokyo, Giappone | BX41 | Osservazione istologica |
| Sistema di cattura immagini | QImaging, Canada | QCapture Pro 7 | Imaging microscopico |
| Panca pulita | Fabbrica di Apparecchiature per Semiconduttori di Pechino Xicheng, Cina | SW-CJ-1FD | Spazio di lavoro sterile |
| Centrifuga refrigerata | Fabbrica di Riparazione Strumenti Medici di Pechino, Cina | LXJ-64-01 | Separazione dell'RNA |
| Centrifuga da tavolo | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., Cina | PQ-1600A | Elaborazione RNA/DNA |
| Agitatore magnetico | Fabbrica di Strumenti Medici Jintan del Jiangsu, Cina | HJ-3 | Preparazione della soluzione |
| Mini Mixer | Shanghai Peng' s Industrial Co., Ltd., Cina | H-1 | Miscelazione di campioni |
| Bilanciamento elettronico | METTLER Toledo, Svizzera | PB3002-S | Pesatura campione |
| Amplificatore PCR | Eppendorf AG, Germania | Mastercycler 5333 | Amplificazione PCR |
| Alimentatore per elettroforesi | Fabbrica di Strumenti Liuyi di Pechino, Cina | DYY-6C | Controllo della tensione |
| Serbatoio per elettroforesi | Fabbrica di Strumenti Liuyi di Pechino, Cina | DYCZ-24DN | Elettroforesi su gel |
| Forno a microonde | Istituto di Ricerca sulle Applicazioni Mediche Zhongda di Shanghai, Cina | WD800SL23 | Preparazione dell'agarosio |
| Trasilluminatore UV | Fabbrica di Strumenti Liuyi di Pechino, Cina | WD-9403B | Visualizzazione del DNA |
| Sistema di imaging a gel | Anlai Co., Ltd., Cina | AlphaImager HP | Documentazione del gel |
| Frigorifero (4 & deg; C) | Haier Biomedical, Cina | BC-165D | Memorizzazione dei campioni |
| Congelatore a Ultra Bassissima Temperatura | Haier Biomedical, Cina | DW-86L388 | Deposito (-80 ° C) |
| Ice Box | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., Cina | FZ-IB-20L | Trasporto del campione |
| Sacchi di stoccaggio criogenici | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., Cina | YL-ULT-50 | Conservazione del campione |
| Pipette di ricerca | Eppendorf AG, Germania | Research Plus | Gestione dei liquidi |
| Reagente di estrazione di RNA (TRIzol) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), USA | 15596026 | Estrazione di RNA |
| Kit di trascrizione inversa | Takara Bio Inc., Giappone | RR037A | Sintesi del cDNA |
| PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Giappone | RR820A | Amplificazione PCR |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., Giappone | 4030 (tipico) | Componente PCR |
| Inibitore RNasi (RNasin) | Promega, USA | N2111 | Protezione dell'RNA |
| Oligo(dT) Primer | Takara Bio Inc., Giappone | 3806 (tipico) | Primer per la sintesi del cDNA |
| Agarose | Sigma-Aldrich, USA | A9539 | Preparazione del gel |
| TAE Buffer (50 volte) | Sigma-Aldrich, USA | TAE50X-1L (tipico) | Buffer di elettroforesi |
| Marcatore del DNA (Scala) | Takara Bio Inc., Giappone | DL2000 (3421A) | Riferimento di dimensione |
| Bromuro di etidio (EtBr) | Bio-Rad, USA | 1610433 | Visualizzazione del DNA |
| PBS Buffer | Gibco (Thermo Fisher Scientific), USA | 10010023 | Tampone di lavaggio |
| Acqua trattata con DEPC | Invitrogen, USA | AM9916 | Protezione dell'RNA |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich, USA | C2432 | Estrazione di RNA |
| Isopropanolo | Merck, Germania | 109634 | Precipitazione dell'RNA |
| Etanolo (assoluto) | Merck, Germania | 100983 | Disidratazione |
| Metanolo | Merck, Germania | 106009 | Blocco della perossidasi |
| Perossido di idrogeno (H2O2) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Blocco della perossidasi endogena |
| Xylene | Sigma-Aldrich, USA | 534056 | Deparaffinizzazione |
| Buffer di recupero dell'antigene del citrato | Abcam, Regno Unito | ab93678 | Recupero di antigeni |
| Diluente anticorpale | Dako, Danimarca | S3022 | Diluizione degli anticorpi |
| Anticorpo primario HMGA1 | Abcam, Regno Unito | ab129153 | Diluizione 1:150 |
| Anticorpo primario HAND1 | Abcam, Regno Unito | ab200040 | Diluizione 1:100 |
| Anticorpi secondari (coniugati con HRP) | Dako, Danimarca | K5007 | Sistema di rilevamento |
| Kit per substrati DAB | Dako, Danimarca | K3468 | Rilevamento cromogenico |
| Tinzione di ematossilina | Sigma-Aldrich, USA | H9627 | Colorazione nucleare |
| Colorazione di eosina | Sigma-Aldrich, USA | E4009 | Colorazione citoplasmatica |
| Mezzo di montaggio per balsamo neutro | Sinopharm Chemical Reagent Co., Cina | 10004160 | Montaggio a carrello |
| Innesco HMGA1 | Sintetizzato personalizzato (ad esempio, IDT/Sangon) | N/A | Amplificazione genica |
| Innesco HAND1 | Sintetizzato personalizzato (ad esempio, IDT/Sangon) | N/A | Amplificazione genica |
| Primer GAPDH (controllo interno) | Sintetizzato personalizzato | N/A | Gene di pulizia |
| APES (Aminopropiltrietossisilano) | Sigma-Aldrich | N/A | Rivestimento a slitta |
| Tubi microcentrifughe senza RNasi | Eppendorf | N/A | Gestione dell'RNA |
| Punte per pipette senza RNasi | Eppendorf | N/A | Gestione dei liquidi |
| Vassoio per colare gel di agarosio e pettine | Generico | N/A | Preparazione del gel |
| Software per la progettazione dei primer | Integrated DNA Technologies, USA | Strumento PrimerQuest | Progettazione del primer |
| Software per l'analisi delle immagini | Media Cybernetics, USA | Image-Pro Plus 6.0 | Quantificazione delle bande |
| Software di Analisi Statistica | IBM Corp., USA | SPSS Versione 13.0 | Analisi statistica |