Articolo metodologico

Mappatura dell'immunità infantile con input minimo: profilazione integrativa a cellula singola e multiomica

DOI:

10.3791/70279

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3 aprile 2026

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1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la raccolta e la conservazione di campioni di sangue da pazienti neonatali e pediatrici e l'applicazione di scRNA-seq, proteomica e citometria a flusso spettrale per caratterizzare le popolazioni di cellule immunitarie provenienti da questi campioni.

Abstract

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Alla nascita, il sistema immunitario neonatale si trova improvvisamente di fronte a un ambiente radicalmente diverso, ricco di stimoli microbici e ambientali. Crescenti evidenze suggeriscono che l'immunità nella prima età non è solo immatura, ma piuttosto adattata in modo unico a soddisfare le esigenze specifiche di questa finestra di sviluppo. Durante questo periodo, il sistema immunitario è altamente dinamico, subendo rapidi cambiamenti per adattarsi al paesaggio esterno in evoluzione. Comprendere questo complesso e in evoluzione del panorama immunitario richiede uno studio diretto nei neonati. Tuttavia, una limitazione importante in tali indagini è il basso volume sanguigno totale nei neonati (~100 mL/kg), che limita la quantità che può essere raccolta in sicurezza per la ricerca, in particolare in gravi gravi (ELBW) o in neonati estremamente prematuri. Nel nostro lavoro recente, affrontiamo questa limitazione dimostrando come il profiling immunitario ad alta dimensione possa essere eseguito utilizzando volumi minimi di sangue neonatale. Introduciamo un insieme di protocolli ottimizzati per il campionamento longitudinale durante la prima vita e applichiamo tecniche avanzate, tra cui citometria a flusso, proteomica e sequenziamento di RNA a singola cellula, per massimizzare le informazioni ottenute con input minimi. Insieme, questi metodi permettono una visione completa delle firme trascricomiche e proteomiche delle cellule immunitarie circolanti nei neonati, offrendo nuove intuizioni sulla traiettoria unica dell'immunità nella prima vita.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è ottimizzato per campioni di sangue da 100 a 250 μL processati entro 12 ore dalla prelieva, sia criopriservati che utilizzati immediatamente. Alla nascita, il sistema immunitario neonatale viene catapultato in un ambiente radicalmente diverso, arricchito da stimoli microbici e ambientali che prima erano assenti nell'ambiente intrauterinoprotetto 1,2. Questo cambiamento richiede che il sistema immunitario si adatti e risponda a una vasta gamma di nuovi antigeni, un processo essenziale per la sopravvivenza ma che presenta anche sfide significative 1,2. Sempre più evidenze suggeriscono che l'immunità nella prima età non è semplicemente immatura o una versione in miniatura del sistema immunitario adulto. Al contrario, è unicamente pensato per soddisfare le esigenze specifiche di questo periodo di sviluppocritico 3,4. Durante questa finestra neonatale, i componenti cellulari del sistema immunitario, inclusi vari tipi di cellule T, B e mieloidi, maturano e sviluppano caratteristiche e funzioni uniche specifiche della prima età 5,6,7,8. Nonostante la sua importanza, l'immunità neonatale rimane difficile da studiare direttamente a causa di vincoli etici e pratici. Un limite importante è il piccolo volume sanguigno nei neonati, con una media di ~100 mL/kg 9,10. Questa difficoltà diventa ancora più evidente quando si preleva sangue da neonati estremamente prematuri (nati prima della 30ª settimana di gestazione) e da neonati ELBW, che possono pesare anche solo 400 g con soli 40 mL di sangue circolante. Ciò limita la quantità di sangue che può essere raccolta in sicurezza, sottolineando la necessità di approcci che massimizzino la raccolta di dati da campioni minimi. Per affrontare questa sfida, il nostro lavoro dimostra protocolli ottimizzati per il profiling immunitario ad alta dimensione utilizzando volumi sanguigni minimi (100-250 μL), come quelli ottenuti dai neonati ELBW.

I recenti progressi nella raccolta e nella lavorazione del sangue hanno permesso lo studio delle risposte immunitarie in popolazioni dove l'acquisizione di campioni è tradizionalmente difficile. Dispositivi a microago come i sistemi Tasso e Touch Activated Phleboty sono stati inizialmente sviluppati per una comoda raccolta di sangue domestica negli adulti. Da allora sono stati adattati per l'uso nei neonati, permettendo ai caregiver principali e ai team clinici di raccogliere campioni con il minimo disagio. Inoltre, possono essere utilizzati a casa senza lo stress di visite clinicheripetute, facilitando così la conformità e l'accessibilità. Un microtubo di acido etilendediamina-tetraacetico (EDTA) deve essere utilizzato con il dispositivo e spedito durante la notte al laboratorio rispettando i protocolli di biohazard appropriati. La mattina seguente, quando arrivano i campioni, dovrebbero essere processati utilizzando metodi di lisi dei globuli rossi (RBC) per catturare le cellule immunitariecircolanti 6. Da notare che i tubi EDTA permettono l'isolamento delle celle vive, ma le considerazioni temporali sono importanti. Per i test funzionali con stimolazione, i campioni devono essere processati entro meno di 4 ore e idealmente meno di 2 ore dalla raccolta. Per i saggi fenotipici non funzionali presentati di seguito, i campioni dovrebbero essere processati entro 12 ore per consentire la spedizione notturna garantendo il recupero, poiché la vitalità cellulare diminuisce neltempo 12. Rispetto alla separazione tradizionale a gradiente di densità con Ficoll, la lisi è più veloce, meno laboriosa e garantisce un recupero piùelevato 13. Tuttavia, l'isolamento cellulare mononucleare del sangue periferico tramite lisi può lasciare granulociti contaminanti, riducendo la purezza ma può essere vantaggioso per studi interessati a questi tipicellulari 14. Questi compromessi evidenziano come gli adattamenti metodologici bilancino fattibilità e accuratezza nello studio di campioni clinici rari o sensibili, come quelli dei neonati. Anche la gestione a valle delle celle isolate ha beneficiato di miglioramenti metodologici. La crioconservazione con siero bovino fetale (FBS) e dimetil solfosdo (DMSO) rimane un approccio robusto per le cellule immunitarie, in particolare nel sangue fetale e neonatale, dove la vitalità e il recupero cellulare sono fondamentali. Oltre a ottimizzare il processo di raccolta del sangue, abbiamo adottato anche tecniche a valle che permettono di estrarre la massima quantità di informazioni da piccoli volumi di campioni. Introduciamo un insieme di protocolli ottimizzati che facilitano il campionamento durante la prima fase di vita, consentendo un esame dettagliato delle dinamiche immunitarie nel tempo. Il nostro approccio sfrutta tecniche avanzate come la citometria a flusso spettrale, la proteomica e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, che insieme offrono una visione senza pari delle firme proteomiche e trascrizionali delle cellule immunitarie circolanti nella prima della vita. Inoltre, la citometria a flusso spettrale offre opportunità per ottenere una comprensione funzionale con un input cellulare minimo.

Nel corso degli anni, diverse tecniche, come i conteggiori ematici completi (CBC), sono state utilizzate per analizzare le cellule immunitarie derivate dalsangue 15, mentre altre hanno analizzato i rapporti delle cellule immunitarie in campioni neonatali di sangue intero utilizzando la metilazionedel DNA 16,17. Sebbene queste tecniche siano state utili per apprendere le proporzioni delle cellule immunitarie conosciute, ci sono ancora limiti nella nostra capacità di ottenere approfondimenti sulle cellule senza un sistema multi-omic. I CBC forniscono solo misure ampie dei principali tipi di cellule del sangue, rendendoli utili per stabilire lo stato immunitario complessivo in ambito clinico, ma limitati nella loro capacità di risolvere sottotipi o stati funzionali. Più recentemente, studi hanno iniziato a affrontare questa limitazione impiegando cambiamenti trascrictomici e metabolomici derivati dal plasma nei neonati già dalla prima settimana divita 18. La proteomica basata sulla spettrometria di massa è stata adattata per studiare i profili immunitari in campionineonatali 19. Questo approccio è potente per misurare un'ampia gamma di proteine in modo imparziale e per identificare potenziali biomarcatori. Tuttavia, le limitazioni chiave includono la necessità di un apporto proteico relativamente grande e la mancanza di informazioni dirette sull'identità cellulare, nonostante la cattura sia di proteine solubili che insolubili. Il saggio proteomico multiplex mirato (TMPA) offre alternative per campioni a basso input. Questi metodi utilizzano una rilevazione mirata basata su anticorpi, fornendo profilazione ad alta sensibilità per campioni con materiale limitato. Uno di questi, in particolare, è stato utilizzato per tracciare longitudinalmente le traiettorie dello sviluppo immunitario nei primi annidi vita 20.

La citometria a flusso consente l'analisi quantitativa delle proteine delle cellule immunitarie a livello di singola cellula, facendo passare cellule marcate fluorescentmente attraverso un fascio laser focalizzato e misurando la dispersione della luce e i segnali di fluorescenza risultanti. In questa tecnica, gli anticorpi marcati con fluorescenza si legano a specifiche proteine di superficie o intracellulari. Ciò consente la rilevazione e quantificazione simultanea di più sottotipi di cellule immunitarie e delle loro caratteristiche distintive basate sui loro profili di fluorescenza. La citometria a flusso spettrale estende questo approccio catturando l'intero spettro di emissione di ciascun fluorocromo, consentendo una precisa dismescolazione spettrale e la rilevazione simultanea di oltre 35 marcatori in un singolo saggio 21,22,23. Questo permette di analizzare molti più marcatori rispetto ai pannelli di citometria a flusso convenzionali, che sono limitati a ~8-12 marcatori. A complemento di queste tecniche citometriche, il sequenziamento a RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha trasformato gli studi immunologici consentendo una profilazione trascritomica ad alta risoluzione e imparziale da materiale inputminimo 24. Nonostante costi più elevati e la dipendenza dalla vitalità cellulare, scRNA-seq offre informazioni senza pari sull'eterogeneità immunitaria della prima vita rispetto al sequenziamento in massa. Collettivamente, questi progressi dimostrano come le innovazioni nella raccolta, conservazione e analisi vengano adattate per superare le sfide uniche dello studio dell'immunità fetale e neonatale.

Questo protocollo è stato ottimizzato per l'analisi delle cellule immunitarie periferiche criopreservate isolate tramite lisi seriale dei globuli rossi. I ricercatori dovrebbero considerare questo protocollo se i loro studi richiedono un profiling immunitario ad alta risoluzione da piccoli volumi di sangue (100-500 μL), specialmente quando l'analisi longitudinale è critica. Il metodo è ampiamente applicabile sia ai neonati a termine che a quelli pretermine ed è compatibile con un'ampia gamma di analisi a valle, rendendolo adatto a diverse questioni di ricerca in immunologia neonatale e pediatrica.

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Protocollo

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Il consenso informato dei genitori e la piena conformità alle normative etiche nazionali pertinenti sono stati garantiti in conformità con l'Institutional Review Board (IRB) della Yale University. Come specificato nel protocollo IRB approvato, i genitori sono stati contattati dal team di ricerca durante la prima settimana dopo la nascita del neonato per ottenere il consenso prima dell'iscrizione. Nessuna procedura di studio che coinvolge materiali di origine umana è iniziata prima dell'approvazione etica documentata.

1. Raccolta, elaborazione e conservazione dei campioni (Figura 1)

  1. Prelievo del sangue per pazienti ricoverati
    1. Raccogliere e processare i campioni dei neonati dopo averli ricevuti, conservati a 4 °C e processati entro 12 ore dalla risoluzione.
    2. Raccogliere ~250 μL di sangue intero e conservarli in un tubo anticoagulante EDTA. Inverti il tubo di raccolta del sangue 8 volte per mescolare l'anticoagulante.
    3. Procedere a elaborare il sangue intero tramite lisi del sangue rosso come descritto nella Sezione 1.3 (elaborazione del campione di sangue totale).
    4. Per raccogliere le macchie di sangue secco, usa la lancia sterile per fare una puntura sulla punta/tallone puliti.
      1. In alternativa, si pipetta ~25-30 μL di sangue dal tubo EDTA sulla carta filtrante. Tocca leggermente la carta filtro sulla goccia di sangue.
    5. Riempi almeno un cerchio con sangue che scorre liberamente, una goccia per cerchio. Lascia asciugare la macchia di sangue. Tieni la carta filtrante aperta finché le macchie di sangue non sono completamente asciutte.
    6. Etichettare in modo appropriato con orario di raccolta, data di elaborazione, momento temporale e identificazione del campione.
    7. Metti in una busta di plastica trasparente con cerniera. Conservare le carte a macchie di sangue a −20 °C o −80 °C per una stabilità prolungata fino a quando non sono pronte per l'analisi proteomica.
  2. Prelievo ambulatoriale del sangue
    NOTA: Con l'approvazione dell'Institutional Review Board della Yale University, ai genitori dei partecipanti ambulatoriali è stata data la possibilità di prelevare campioni di sangue a casa utilizzando un dispositivo di auto-raccolta a microaghi. Questo dispositivo ottiene il sangue capillare tramite una lancia applicata sulla pelle. I genitori che hanno scelto questo metodo hanno ricevuto formazione in clinica utilizzando kit dimostrativi e successivamente sono stati forniti dettagliati istruzioni scritte e kit per la raccolta domestica.
    1. Lava le mani e indossa i guanti prima di usarlo. Raccogli tutti gli oggetti necessari, incluso uno specchio se solo un genitore effettua la raccolta del sangue.
    2. Rimuovi il dispositivo dal kit degli attrezzi e streccia il tappo da un tubo compatibile.
    3. Premi il tubo nel dispositivo finché non è ben stretto con le linee di riempimento rivolte verso l'esterno.
    4. Togli il pannolino al neonato e tienilo in piedi.
    5. Segui le istruzioni del pacchetto riscaldante per attivarlo.
      NOTA: Se non è disponibile un pacchetto, usa un altro metodo di riscaldamento, come una mano.
    6. Tieni la borsa termica sul punto (gluteo) per 2-4 minuti per riscaldarla e aumentare il flusso sanguigno.
    7. Pulisci l'area con un assorbente per alcol e lascia asciugare.
    8. Rimuovi la copertura trasparente dal pulsante rosso. Stacca la linguetta dal dispositivo e attacca saldamente la parte più completa dei glutei del neonato tenendolo dritto.
      NOTA: Regolare la loro postura secondo necessità per mantenere il tubo completamente verticale per una corretta raccolta del sangue.
    9. Premi il pulsante fino al fondo una volta e rilascia. Imposta il timer a 5 minuti. Guarda il tubo riempirsi usando lo specchio quando serve.
    10. Il sangue potrebbe non comparire per i primi 1-2 minuti. Rimuovi il dispositivo dopo un massimo di 5 minuti totali o prima se il sangue arriva fino alla linea indicatrice superiore prima dei 5 minuti.
    11. Rimuovi il tubo dal dispositivo con una leggera torsione e tira verso il basso. Fissa rapidamente il tappo completamente nel tubo. Inverti il tubo almeno 10 volte, assicurandoti che il sangue tocchi il tappo ad ogni inversione per evitare coaguli.
    12. Spedire i campioni durante la notte dopo la raccolta.
  3. Elaborazione del campione di sangue totale
    1. Processa i campioni di sangue in un armadietto di sicurezza biologica.
    2. Trasferire con attenzione i 250 μL di sangue in un tubo conico da 50 mL contenente 10 mL di 1x tampone per lisi di globuli rossi. Risciacquare il tubo di raccolta del sangue con 10 mL di tampone per la lisi dei globuli rossi fino a esaurirlo. Lascia che le cellule si lisino a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
    3. Una volta completata la lisi, aggiungi ~30 mL di PBS a RT per lavare e centrifugare a 430 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspira il sovrantantante usando il vuoto, senza disturbare il pellet.
    4. Continuare a trasferire e risciacquare il campione come indicato nel passo 1.3.2 finché il pellet cellulare non appare libero da globuli rossi visibili. Centrifuga a 430 × g per 5 minuti, poi rimuovi con cura il soprantantante senza disturbare il pellet.
    5. Per ogni 250 μL di sangue raccolti, si sospede il pellet cellulare risultante in 2 mL di mezzo congelante (10% DMSO in FBS) e si divide in due cryovial per la conservazione.
    6. Controlla la vitalità cellulare contando le cellule sospese in mezzo feezing con un emocitometro utilizzando l'esclusione blu di tripano.
    7. Trasferisci 1 mL dal passo 1.3.5 a ciascun cryovial. Etichetta in modo appropriato con l'orario di raccolta, la data di elaborazione, il momento e l'identificazione del campione.
    8. Conservare il cryovial intermedio a -80 °C in un contenitore congelante con isopropanolo. Dopo 24 ore, trasferire il/i crioviale/i in azoto liquido fino a essere pronti per l'analisi.

2. TMPA da macchie di sangue secco (DBS) (Figura 2)

  1. Il giorno della lavorazione, porta la carta filtrante in RT. Usando una perforatrice da 3 mm, perfora 2-3 cerchi nella carta filtrante dove è passato il sangue, il più centrale possibile sulla zona del sangue.
  2. Prendi ogni punzone da 3 mm con una pinzetta e aggiungila in un pozzo una piastra a 96 pozzi o un tubo PCR a basso legame contenente 20 μL di tampone di eluzione (1x PBS, 1x Proteasi Inhibitor, 0,05% Tween 20). Assicurati che il punch sia coperto da un buffer di eluzione.
  3. Chiudi i tubi o copri la piastra con una gonna di plastica e posizionali su un Vortice Digitale che ruota a 600 giri/min per 60 minuti in RT.
  4. Al termine dell'incubazione, trasferire con cura l'eluato su un nuovo tubo a basso legame o su una piastra a 96 pozzi. Scartare i tubi o la piastra con le perforazioni del filtro.
  5. Quantifica il contenuto proteico usando il test BCA.
    1. Prendere 2 μL di ciascun campione o standard BSA per ottenere diluizioni seriali di 1:10 e 1:100 in acqua. Prepara campioni e standard in duplicato aggiungendo 15 μL di campioni diluiti o standard a 200 μL di soluzione lavorativa 1x. Incubare i campioni per 30 minuti a 37 °C.
    2. Leggi il segnale a 562 nm su un lettore di placche. Calcola la concentrazione finale di proteine basandosi sullo sfondo standard di pendenza e tampone di eluzione dello standard BSA.
  6. Realizzare aliquote di 30 μL per campioni a 0,5-1 mg/mL in microtubi a vite a basso legame da 1,5 mL. Congelare i campioni a -80 °C per la successiva consegna da processare tramite il servizio TMPA.

3. Citometria a flusso spettrale del sangue lisato con globuli rossi (Figura 3)

  1. Il giorno dell'esperimento, si scongela rapidamente una fiala di cellule lisate con globuli rossi in un bagno d'acqua a 37 °C finché non rimane una piccola goccia di ghiaccio.
  2. Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di RPMI completo preriscaldato (37 °C) (preparato utilizzando 500 mL di RPMI 1640, 50 mL di FBS, 5,6 mL di Penicillina-Streptomicina e 5,6 mL di integratore di glutamina). Centrifuga a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere e scartare con attenzione il soprantagente.
  3. Sospendi delicatamente il pellet con 3 mL di RPMI completo e determina il conteggio cellulare utilizzando un metodo appropriato.
  4. Fai girare le celle risospese a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspira e scarta il soprantantante.
  5. Regola la concentrazione delle cellule a 1 × 106 cellule/mL in RPMI completo. Erogare 100 μL per pozzo (0,1 × celle 10⁶) in una piastra a V a 96 pozzi. Centrifugare a 764 × g per 2 minuti a 4 °C e rimuovere il soprandante.
  6. Aggiungere 100 μL di colorante vivo/morto in PBS a diluizione 1:2.000 con blocco Fc e blocco monocitario (diluizione 1:100) a tutti i campioni, tranne il controllo non colorato. Incubare per 15 minuti a 4 °C.
  7. Lavare con 100 μL di PBS e centrifugare a 764 × g per 2 minuti a 4 °C. Scartate con cura il soprandanante.
    NOTA: È imperativo utilizzare il blocco Fc e il blocco monocitario per prevenire qualsiasi legame non specifico degli anticorpi.
  8. Aggiungere 100 μL del cocktail superficiale diluito (diluizione 1:200) in tampone FACS (500 mL di PBS, 2,5 g di albumina sierica bovina (BSA), 2 mM EDTA, pH 8,5) a tutti i campioni, tranne il controllo non colorato. Incubare per 30 minuti a 4 °C.
  9. Lavare con 100 μL di tampone FACS e centrifugare a 764 × g per 2 minuti a 4 °C. Scartate con cura il soprandanante.
  10. Fissare le cellule aggiungendo 100 μL di paraformaldeide al 4% a ciascun campione. Incubare per 15 minuti a RT al buio.
  11. Lavare con 100 μL di tampone FACS, centrifugare a 764 × g per 2 minuti a 4°C e risospendere in 200 μL di tampone FACS.
  12. Prepara perle ultra-comp come controlli monocolore. Tingere le sfere di controllo monocolore seguendo lo stesso protocollo dei campioni, inclusa la fissazione se i campioni erano fissi.
  13. Preparare i controlli Fluorescent Minus One (FMO) utilizzando la stessa procedura dei campioni.
    NOTA: È importante trattare i controlli monocolore e i FMO allo stesso modo dei campioni. Ad esempio, se i campioni sono fissi dopo la colorazione, anche i FMO e i controlli monocolore dovrebbero essere fissati.
  14. Esegui i campioni, i controlli a colore singolo, i controlli non colorati e i controlli FMO su un citometro a flusso convenzionale/spettrale. Analizza i dati tramite un software.
  15. Imposta porte in base ai controlli appropriati di isotipo e FMO. Innanzitutto, le celle gate selezionano la popolazione leucocitaria utilizzando il grafico scatter forward (FSC) rispetto al side scatter (SSC), che aiuta a escludere detriti e selezionare le celle in base a dimensioni e granularità.
  16. Dopo la selezione dei leucociti, si escludono i doppietti per le celle di gate utilizzando un grafico dell'area di scatter forward (FSC-A) rispetto all'altezza di scatter forward (FSC-H).
    NOTA: Questo garantisce la selezione di singole cellule (singolini), con quelle che cadono lungo la diagonale considerate singoletti, mentre doppietti e gruppi sono esclusi.
  17. Cellule gate per la vitalità utilizzando un colorante di vitalità per escludere cellule morte, assicurando che l'analisi successiva includa solo cellule vive.
  18. Dopo questi primi passaggi di gate, si blocca ulteriormente le singole cellule vive per specifici marcatori di linea per sottocategorizzare le diverse popolazioni di cellule immunitarie. Dividere le singole cellule vive in cellule mieloidi CD33+ e linfociti CD33 in base all'espressione di CD33.
  19. All'interno della popolazione CD33+ , differenziare i monociti CD14+ e identificare le cellule dendritiche CD11c+ (DC) come cellule che esprimono CD11c ma non CD14.
  20. All'interno della popolazione di linfociti CD33, si trovano le cellule T CD3+ e il sotto-gate per identificare i sottoinsiemi di cellule T CD4+ e CD8+ .
  21. Inoltre, identificare le cellule natural killer (NK) CD56+ tramite l'espressione di CD56 e le cellule B CD19+ tramite l'espressione di CD19.

4. scRNA-seq del sangue lisato per globuli rossi (Figura 4)

  1. Scongelare una fiala di cellule lisate con globuli rossi criopreservati in un bagno d'acqua a 37 °C. Aggiungere il campione a 10 mL di mezzo per cellule T in un tubo conico da 15 mL. Centrifugare a 430 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante.
  2. Aggiungi altri 10 mL di 1x PBS al campione. Centrifuga a 430 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante.
  3. Contare le cellule e valutare la vitalità con il blu di tripano. Se la vitalità è inferiore al 70%, procedi alla rimozione delle cellule morte con il kit di rimozione delle cellule morte.
    1. Rimozione delle celle morte
      1. Diluire il Binding Buffer Stock 20x usando acqua sterile e doppia distillazione per ottenere una soluzione funzionante 1x.
      2. Sospendere il pellet cellulare in 100 μL di Microsfere per la rimozione delle cellule morte ogni 1 × 107 cellule totali. Mescola bene e incuba per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
      3. Inserire la colonna di separazione magnetica nel supporto magnetico appropriato. Risciacquo la colonna con 500 μL di 1x Binding Buffer per bilanciare prima dell'uso.
      4. Porta il volume della cella a 500 μL con un buffer di legame 1x. Applicare la sospensione a celle alla colonna e raccogliere il flusso in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,7 mL.
      5. Lava 2 volte con 500 μL di buffer di legaggio. Raccogli il flusso nello stesso tubo della microcentrifuga.
      6. Centrifuga l'eluato a 300 × g per 10 minuti. Scartate il soprannatante.
    2. Conta le cellule e valuta la loro vitalità con il blu di tripano.
    3. Risospendere 20.000 celle vitali in 40 μL di PBS con 0,04% di BSA in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,7 mL.
    4. Mandate immediatamente le cellule in congelazione a una struttura genomica per la generazione e il sequenziamento delle biblioteche. Raccogli i risultati di sequenziamento nel formato degli output di Cell Ranger.

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Risultati

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Abbiamo raccolto le schede DBS da 10 neonati estremamente prematuri in tre momenti: 1 settimana (n = 12), 1 mese (n = 7) e 2 mesi (n = 3) per l'analisi proteomica delTMPA 6 (Figura 2A). Questi campioni sono stati analizzati insieme al sangue del cordone infantile a termine (TCB; n = 4) e al sangue adulto sano (AB; n = 5). L'espressione proteica normalizzata (NPX) di 92 proteine immunocorrelate è stata quantificata utilizzando la piatt...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ottenere dati immunologici di alta qualità da volumi minimi di sangue neonatale e infantile richiede adattamenti metodologici su più fasi. In questo protocollo, descriviamo quattro strategie complementari: (i) raccolta del sangue ottimizzata e crioconservazione per preservare cellule vitali da usare a valle, (ii) applicazione della citometria di flusso spettrale per l'immunofenotipizzazione multiparametrica, (iii) scRNA-seq per risolvere l'eterogeneità immunitaria ad alta risoluzione, e ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo le seguenti strutture principali presso Yale: nucleo di Citometria di Flusso di Yale; Centro Yale per l'Analisi del Genoma. Ringraziamo il Yale Center for Clinical Investigation, l'Ufficio di Yale per lo Sviluppo dei Medici-Scienziati e degli Scienziati e il Programma di Sviluppo dei Scienziati Pediatrici e Trauma Scientist/NICHD. Gli studi di respirometria sono stati condotti dal Chemical Metabolism Core presso la Yale University. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni a: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Cystic Fibrosis Foundation (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), Hartwell Award (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Yale School of Medicine, Dipartimento di Pediatria (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). Il contenuto è esclusivamente di responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health. La Figura 1 è stata creata in BioRender. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific 15575-038 
1x Buffer di Lisi RBC  Invitrogen 3177165 
Kit per il test proteico BCA & nbsp;Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific 22-253-270
Bel-Art Crio-Safe -1° C Freeze Controller Millipore Sigma 41122800 
Albumina Sirica Bovina (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Umano CD3 Thermo Fisher Scientific 364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 anti-umano CD11c BD BioScienze  612968 
Brilliant Vil750 Anti-Umano CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Umano CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, cocktail inibitore della proteasi senza EDTAMillipore Sigma 11836170001 
Kit per la rimozione delle cellule morte  Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimetil Solfosido (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS), senza calcio, senza magnesio & nbsp;Thermo Fisher Scientific 14190144 
Siero fetale bovino (FBS) e nbsp;Gibco & nbsp;A5256801 
Mixer digitale Vortice Fisherbrand & nbsp;Thermo Fisher Scientific 02215418 
Buffer di fissazione BioLegend 420801 
Integratore GlutaMAXGibco & nbsp;35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
Colonne MS Miltenyi Biotec 130-042-201 
NomeAziendaNumero di catalogo
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 
Pacific Blue Anti-Human CD4 BioLegend 344619 
Penicillina-Sreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific 15140-122 
RB780 Anti-Umano CD33 BD in Bioscienze  755606 
Rierdge 3mm Metal Puncher Rierdge SDD231031pc-01 
RPMI 1640 MediumGibco & nbsp;11875-093 
Spark UV 387 Anti-Umano CD19 BioLegend 302289 
Kit della Collezione TassoTasso N/A
Microtubi a tappo a vite Thermo ScientificThermo Fisher Scientific 14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva & nbsp;41111700 
Kit di Riparabilità Riparabile Zombie NIR  BioLegend 423105 
Software e pacchetti
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prism9.4.0
NomeVersione
Scanpy1.9.1
Srublet0.2.3
Saggi commerciali
Cromo Singola 5' Equipaggiamento10X GenomicsPN-1000263
Olink  Rivela o mira il pannello infiammatorio 96Olinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Riferimenti

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