Con il crescente interesse per l'immunoterapia intratumorale, è essenziale selezionare modelli tumorali accessibili e pratici. I tumori sottocutanei sono facili da stabilire ma difficili da visualizzare e manipolare. In questo protocollo, descriviamo metodi per generare tumori intradermici che offrono una migliore visibilità e accessibilità.
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Articolo metodologico
Impianto di tumori intradermici come modello robusto per studi di immunoterapia intratumorale sul cancro delle murine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Stabilire modelli riproducibili di tumori murini è essenziale per valutare la biologia del cancro e le strategie di immunoterapia. L'immunoterapia intratumorale tratta i tumori già sviluppati con reagenti immunostimolanti per invertire l'immunosoppressione locale e stimolare l'immunità sistemica antitumorale. La maggior parte degli studi sul cancro nei topi stabilisce i tumori nello spazio sottocutaneo, il che presenta sfide intrinseche per l'immunoterapia intratumorale sperimentale a causa dell'impossibilità di visualizzare le iniezioni intratumorali. L'iniezione intradrimica di cellule tumorali fornisce un approccio affidabile per generare tumori visibili che supportano un'iniezione intratumorale accurata e riproducibile e il monitoraggio della cinetica della crescita e delle risposte terapeutiche. Qui presentiamo una metodologia riproducibile per stabilire e trattare tumori intradermici utilizzando il modello di melanoma murino B16F10 in topi C57BL/6 come esempio. Le sospensioni delle cellule tumorali vengono iniettate intradermicamente e, 7–10 giorni dopo l'impianto tumorale, una volta che i tumori raggiungono ~60 mm3, può essere applicata direttamente un'iniezione intratumorale di agenti immunostimolanti o un trattamento fisico come elettroporazione o riscaldamento. Ciò consente una somministrazione precisa dei trattamenti e la misurazione della crescita tumorale con il calibro ed evita la sfida della variabilità intrinseca di trattamenti multipli di tumori sottocutanei che non possono essere visualizzati. Fornendo approfondimenti su questa tecnica, questo articolo mira a supportare la riproducibilità e a promuovere la ricerca preclinica nell'immunoterapia intratumorale.
Introduzione
I modelli di tumori murini costituiscono uno strumento indispensabile nella ricerca sul cancro. In un modello murino ottimale, sarebbe possibile indurre tumori che imitino da vicino i tumori umani sia a livello genetico chemorfologico. Ciò consente la valutazione e l'efficienza di nuovi approcci terapeutici in diversi settori, inclusa l'immunoterapia intratumorale (ITIT). L'ITIT è un campo emergente nel trattamento del cancro che consiste nell'amministrazione diretta di agenti immunostimolanti nel microambiente tumorale (TME). Questa consegna localizzata può potenziare l'attivazione immunitaria locale, invertire il microambiente immunosoppressore del tumore e scatenare risposte immunitarie sistemiche antitumorali, note come effettoabscopale 2. Tuttavia, l'efficienza, la precisione e la coerenza della somministrazione intratumorale dipendono dalla capacità di visualizzare e controllare i parametri di iniezione nei diversi modelli tumorali.
La maggior parte degli studi preclinici sul cancro utilizza l'impianto di tumori sottocutaneo. Tuttavia, questo approccio presenta limitazioni per le terapie intratumorali perché il tumore non può essere visualizzato direttamente durante l'iniezione a meno che non venga eseguito un intervento chirurgico. Molte strategie di immunoterapia intratumorale richiedono la somministrazione precisa di reagenti in piccoli tumori topini e spesso comportano l'esecuzione di tale compito più volte. Senza conferma visiva, l'accuratezza delle iniezioni e la ritenzione dei reagenti all'interno dei tumori sottocutanei diventano variabili poco controllate. Questo potrebbe portare a interpretazioni errate o variazioni dei datisperimentali 3.
L'impianto tumorale intradermique offre un'alternativa diretta, accessibile, visibile e riproducibile per l'osservazione, la misurazione e l'iniezione intratumorale, migliorando così la coerenza. Inoltre, studi hanno dimostrato che i tumori impiantati intradermicamente, a differenza delle iniezioni sottocutanee, aumentano l'immunogenicità e sopprimono la tumorogenicità delle celluletumorali 4. I tumori iniettati intradermicamente hanno indotto un rapido e forte traffico cellulare dendritico verso i linfonodi, con conseguente attivazione più precoce e robusta delle cellule T citotossiche specifiche pertumori 4. Il presente studio descrive un protocollo dettagliato e riproducibile per stabilire tumori intradermici di melanoma B16F10 nei topi C57BL/6 e per eseguire i successivi trattamenti intratumorali.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state condotte con l'approvazione e in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) 5. Tutte le procedure sugli animali venivano eseguite presso la struttura per animali di Dartmouth. Le femmine C57BL/6 topi, di età compresa tra 6 e 8 settimane, venivano alloggiate in condizioni standard su rastrelliere ventilate con cibo e acqua. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Radere i topi
NOTA: Tutto il personale deve completare una formazione istituzionale sulla gestione di animali vivi e anestesia prima di eseguire queste procedure.
- Prima dell'iniezione intradermica, radere il fianco di ogni topo come descritto di seguito; il fianco destro veniva utilizzato per le iniezioni e le procedure descritte. Rasi i topi il giorno prima di iniettare le cellule tumorali.
- Posiziona il topo su una superficie stabile. Stringi il topo per la pelle della nuca con il pollice e l'indice sinistri, e infila delicatamente il lato sinistro del corpo nel palmo per esporre il lato destro. Usa l'anulare e/o il mignolo per tenere la gamba e la coda sinistre, assicurandoti che il fianco destro sia completamente esposto.
- Rasi il pelo dalla zampa posteriore fino alle costole inferiori per creare un'area libera per l'iniezione.
- Entrambe le fasce possono essere rasate se è necessario spazio aggiuntivo per le prove.
NOTA: I principianti possono anestetizzare i topi mentre imparano a radersi e a curare correttamente la barba.
2. Esercitarsi con le iniezioni con il colorante
NOTA: La pratica può essere eseguita sia su topi dal vivo (anestetizzato) che su topi soppressi, e su entrambi i sessi. I topi maschi hanno tipicamente la pelle più spessa e meno flessibile rispetto alle femmine, rendendo la procedura più tecnicamente impegnativa. Per questo motivo, esercitarsi con uomini è utile per sviluppare la competenza.
- Mescola colorante alimentare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un tubo Eppendorf da 1,5 mL finché la soluzione non appare scura (in questo studio è stato utilizzato colorante alimentare blu).
- Procura topi da allenamento e anestetizzali secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali.
- Posiziona il topo anestetizzato sotto un cono nasale e inclina il corpo per esporre il fianco destro. Conferma un'anestesia adeguata pizzicando delicatamente il cuscinetto e osservando nessuna risposta.
- Carica 30 μL di soluzione di colorante in una siringa di insulina da 0,3 mL con un ago da 29 G, 1/2". Rimuovi tutte le bolle d'aria.
- Usando la mano non dominante, pizzica e allunga delicatamente la gamba/pelle per creare una superficie liscia e tesa (evita di sollevare la pelle verso l'alto). Inserisci l'ago con il bisello verso l'alto nel derma con un angolo parallelo e poco profondo rispetto alla pelle. Tieni l'ago visibile sotto la superficie per confermare la posizione dermica.
NOTA: Durante la pratica, testa diverse posizioni della presa per mantenere una tensione cutanea stabile mantenendo le dita lontane dal percorso dell'ago. Inserisci l'ago ~2 mm nella pelle. Per ridurre il riflusso di riflusso, inserisci l'ago ~3 mm, poi ritira leggermente per creare una "tasca" prima dell'iniezione. Questo aiuta a trattenere il colorante nel sito di iniezione. - Iniettare lentamente tutti i 30 μL della soluzione del colorante finché non si forma una piccola e distinta "bolla" sotto la superficie della pelle
NOTA: L'assenza di bolle visibili suggerisce che l'iniezione sia stata somministrata in modo sottocutaneo piuttosto che intradermico. Mantenere la smussa in posizione rivolta verso l'alto aiuta a garantire una corretta posizione dermica e a prevenire iniezioni eccessivamente profonde. - Continua a praticare finché non formano costantemente bolle intradermi. Possono essere eseguite fino a sei o otto iniezioni per lato.
- Dopo aver completato le iniezioni di prova, sopportare i topi secondo i protocolli approvati del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) 5.
3. Preparazione delle cellule tumorali per l'iniezione
NOTA: Eseguire tutti i passaggi cellulari in un cappuccio sterile. Tieni presente che le diverse linee tumorali murine crescono in modo differente.
- Scongelare le cellule tumorali (B16F10 usata in questo studio) alcuni giorni prima delle iniezioni intradermiche.
- Coltivare le cellule fino a una confluenza del 70%–80% mantenendo un terreno fresco adeguato
NOTA: Evitare la confluenza al 100%, che blocca la proliferazione e compromette la crescita tumorale. - Prelevare e preparare cellule a 7 x 106 cellule/mL in 1x PBS, RPMI senza siero o altri mezzi utilizzati per la crescita delle cellule.
NOTA: Il modello tumorale B16F10 usato in laboratorio utilizza 2 x 105 cellule a 30 μL. Il volume di iniezione di 30 μL è appropriato, ma il numero di cellule può essere regolato secondo necessità per stabilire il modello tumorale desiderato. Le cellule si depositano e si accumulano sul fondo del tubo, quindi per garantire che la concentrazione delle cellule sia costante, mescola periodicamente delicatamente le cellule per mantenerle sospese. - Tieni le cellule sul ghiaccio dopo la lavorazione e procedi rapidamente con l'iniezione. La conservazione prolungata sul ghiaccio riduce la vitalità cellulare, il che può diminuire il numero di cellule vive somministrate e influire negativamente sull'istituzione deltumore 6.
NOTA: Le cellule vengono prelevate e utilizzate immediatamente in laboratorio. Le iniezioni vengono effettuate entro 20–60 minuti dall'elaborazione delle cellule e dal loro congelamento. Usa un partner quando lavori con grandi coorti per ridurre al minimo il tempo trascorso in pausa.
4. Iniezioni intradermiche
- Anestetizzare topi sperimentali.
NOTA: L'anestesia con gas isoflurano è utilizzata dal laboratorio, ma possono essere usati anestetici iniettabili. - Dopo l'induzione dell'anestesia, posizionare il topo sotto un cono nasale e posizionare il corpo per esporre completamente il fianco destro.
- Inverti delicatamente la sospensione della cella per garantire un mescolamento uniforme.
- Preleva 30 μL di sospensione cellulare in una siringa da 0,3 mL con un ago da 29 G, 1/2". Rimuovi le bolle d'aria.
- Con la mano non dominante, allunga delicatamente la gamba/pelle di lato per renderla liscia e stretta (non sollevarla verso l'alto). Inserisci l'ago con la bisellatura verso l'alto nel derme con un angolo parallelo e poco fondato. L'ago dovrebbe rimanere visibile sotto la pelle, mostrando che non è troppo profondo.
NOTA: La profondità dell'ago dovrebbe essere di ~2 mm nella pelle. Per evitare il riflusso delle cellule, inserisci l'ago a ~3 mm nella pelle, tira leggermente l'ago indietro per creare una "tasca" in cui le cellule verranno iniettate. Questo riduce significativamente il riflusso di riposto. - Iniettare molto lentamente tutti i 30 μL di sospensione cellulare finché non si forma una piccola "bolla" visibile sotto la pelle. Aspetta 5–10 secondi prima di rimuovere l'ago.
NOTA: Rimuovere l'ago troppo rapidamente può far uscire la soluzione dalla pelle a causa della pressione. - Ripeti per ogni mouse. Sostituire le siringhe dopo ogni gabbia (4–5 topi) per evitare che l'ago si smusseggia.
- Monitora tutti i topi finché non si sono completamente ripresi dall'anestesia.
- Monitorare i topi per l'insediamento del tumore.
5. Iniezioni intratumorali
NOTA: I tumori sono tipicamente pronti per il trattamento 7–10 giorni dopo l'impianto, una volta raggiunta la dimensione appropriata. La dimensione appropriata utilizzata in laboratorio è ~50mm 3 o superiore usando la formula: Volume = (Lunghezza/2) * (Larghezza*Larghezza)7,8.
- Preparare tutte le soluzioni terapeutiche in anticipo (ad esempio, in questo studio è stato usato 1 PBS). Conserva le soluzioni sul ghiaccio o a temperatura ambiente secondo il trattamento specifico.
- Indurre l'anestesia secondo le linee guida istituzionali.
- Posiziona il topo sotto un cono nasale per mantenere l'anestesia e posizionalo in modo che il tumore sia esposto.
- Preleva il volume richiesto (ad esempio, 30 μL usati qui) in una siringa di insulina da 0,3 mL con un ago da 29 G, 1/2". Rimuovi le bolle d'aria.
NOTA: Il volume varierà in base al trattamento della scelta e delle condizioni ottimizzate. - Inserisci l'ago orizzontalmente nel tumore e avanza verso il centro della massa tumorale.
NOTA: Evita di inserire dall'alto o con un angolo ripido, poiché ciò potrebbe portare all'iniezione a essere eseguita troppo in profondità o nel tessuto circostante. Il trattamento descritto è stato somministrato con un'unica iniezione. Le dosi e la frequenza dipendono tutte dal trattamento scelto e dalle condizioni ottimizzate. Con tumori piccoli, una singola dose è sufficiente per distribuire il trattamento, ma con tumori più grandi possono essere necessarie più iniezioni per distribuire equamente il trattamento attraverso la massa tumorale. - Iniettare il trattamento lentamente e costantemente. Pausa per 10 secondi prima di ritirare lentamente l'ago per minimizzare il riflusso o la perdita. Alcuni tumori hanno una pressione interna elevata, e bisogna fare attenzione a garantire che l'iniezione non fuoriesca attraverso il foro dell'ago.
- Ripeti la procedura per ogni mouse. Sostituire le siringhe dopo ogni gabbia di 4–5 topi e durante il cambio di gruppo di trattamento per prevenire la contaminazione incrociata.
- Monitorare i topi dopo l'anestesia finché non riacquistano mobilità e respirazione normale. Continuare a monitorare quotidianamente la risposta al trattamento e la salute generale.
NOTA: Attenzione che linee cellulari diverse possono causare ulcerazioni nei tumori in momenti differenti. Ogni esperimento e ogni protocollo IACUC hanno obiettivi finali e criteri di esclusione chiaramente indicati. In laboratorio, i parametri finali per gli esperimenti con topi sono 1500mm 3 e le ulcere che si verificano sono accettate e non escluse dallo studio.
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Risultati
Durante la pratica delle iniezioni con colorante, la riuscita somministrazione intradermica può essere verificata senza eutanasia del topo osservando la formazione di una "bolla" visibile nel sito di iniezione. Un'iniezione intradermica eseguita correttamente produce una grande "bolla" ben definita e rialzata (Figura 1A–F). Bolle piccole o piatte suggeriscono che l'iniezione possa essere parzialmente sottocutanea. Se non si forma alcuna "bol...
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Discussione
Il successo di questo protocollo (Figura 4) dipende dal mantenimento di una profondità di iniezione intradermica costante e dal posizionamento preciso dell'ago per garantire l'erogazione nel derme piuttosto che nello strato sottocutaneo. Se l'angolo dell'ago è troppo ripido o la pressione di iniezione troppo alta, il colorante o le cellule tumorali possono essere depositati attraverso la pelle nello spazio sottocutaneo. Dopo l'iniezione, una breve pausa prim...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
AS riconosce il Buffet di Formazione in Immunologia, T32 AI007363. KSK ringrazia con gratitudine la Schlumberger Foundation per averla sostenuta durante il programma Faculty for the Future.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | isoflurano |
| Food Coloring | Durkee | per la pratica | |
| Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | forbici per radere i topi |
| PBS, 1X w/o calcium & magnesium | Corning | 06325002 | pH 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | macchina per l'anestesia |
Riferimenti
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
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Ristampe e permessi
