Articolo metodologico

Una tecnica per stabilizzare le proteine di membrana nei nanodischi

DOI:

10.3791/70283

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30 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio delinea la procedura per ricostituire il canale K+ acido sensibile correlato alla proteina di membrana TWIK (Task2) in nanodischi. Il successo dell'assemblaggio è stato confermato dalla criomicroscopia elettronica a particelle singole, che ha fornito medie di classe bidimensionali ben definite.

Abstract

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Molte proteine di membrana mostrano scarsa stabilità, perdita di attività ed eterogeneità del campione quando estratte in ambienti a base di detergenti, rappresentando notevoli sfide per l'analisi crio-microscopica ad alta risoluzione. La tecnologia dei nanodischi affronta queste limitazioni impiegando proteine impalcature a membrana (MSP) e fosfolipidi per ricostituire le proteine target in un bistrato lipidico simile a quello nativo. In questo studio, il canale potassico umano Task2 è stato espresso, solubilizzato e purificato in presenza di detergenti appropriati prima dell'assemblaggio del nanodisco. Il protocollo risultante stabilisce un flusso di lavoro riproducibile per la ricostituzione dei nanodischi di Task2, come dimostrato dai passaggi chiave di validazione: un chiaro spostamento nei profili di cromatografia a esclusione di dimensione (SEC) che conferma l'ingrandimento delle particelle, co-migrazione di Task2 e MSP su SDS-PAGE, e medie di classi 2D ben definite con caratteristiche strutturali secondarie visibili. Una ricostruzione iniziale in 3D conferma ulteriormente l'integrità della proteina incorporata nel nanodisco. Migliorando la purezza, l'omogeneità e la qualità delle particelle del campione, questo approccio fornisce una solida piattaforma per studi strutturali ad alta risoluzione di Task2 e offre un quadro metodologico applicabile ad altre proteine di membrana.

Introduzione

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Le proteine di membrana svolgono un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale cellulare, nel trasporto dei metaboliti, nel mantenimento dell'integrità strutturale cellulare e nelle risposte immunitarie. La disregolazione delle proteine di membrana è implicata in varie malattie, rendendole bersagli importanti per lo sviluppo di farmaci1. L'avvento della criomicroscopia elettronica (crio-EM) ha permesso studi strutturali su proteine di membrana grandie dinamiche. Una delle principali difficoltà nell'ottenere strutture ad alta risoluzione risiede nell'estrazione di queste proteine dai loro bistrati lipidici nativi, preservando al contempo le loro conformazioni e funzioni biochimiche native. Inoltre, la conformazione altamente dinamica delle proteine di membrana e la complessità dello screening degli anticorpi rappresentano ulteriori ostacoli alla scoperta miratadi farmaci 3,4. I metodi tradizionali per l'estrazione delle proteine a membrana spesso impiegano detersivi per imitare le proprietà del bistrato lipidico idrofobo. Tuttavia, questo approccio spesso altera la stabilità delle proteine di membrana, portando all'aggregazione o allo sviluppoparziale 5. Inoltre, i detersivi possono rimuovere molecole lipidiche essenziali che sono fondamentali per stabilizzare la conformazione proteica, potenzialmente alterando la conformazione proteica o addirittura compromettendo la funzione, limitandone così l'applicazione nello screening degli anticorpi e in altre applicazionia valle 6.

La tecnologia dei nanodischi è stata introdotta per la prima volta da Sligar ecolleghi 7. Questa struttura autoassemblante è tipicamente formata da derivati apolipoproteine A1 (ApoA1), ovvero MSP, insieme a lipidi sintetici o naturali, fornendo un ambiente stabile per le proteine dimembrana 7,8,9. La MSP forma una struttura a disco circondando i bordi idrofobici del bistrato lipidico. Questa struttura presenta una superficie idrofobica che interagisce con le code dei lipidi acillici, stabilizzando la proteina di membrana, e una superficie idrofila rivolta verso l'esterno, permettendo alla proteina di membrana di rimanere solubile in soluzioniacquose 10. I nanodischi fungono da piattaforma versatile per studi sulle proteine di membrana. Conservando le proteine di membrana purificate in un ambiente lipidico quasi nativo, superano i limiti dei metodi tradizionali a base di detersivi e mantengono la conformazione e la funzione biologica delle proteine in vitro. Di conseguenza, questo metodo è diventato uno strumento potente per gli studi strutturali delle proteine di membrana. Rispetto agli ambienti tradizionali di detersivo, il bistrato lipidico nei nanodischi fornisce supporto strutturale alle proteine di membrana, stabilizzando la loro conformazione nativa—una caratteristica cruciale per le proteine soggette all'inattivazione, come i recettori accoppiati a proteine G e i canaliionici 11. Inoltre, la natura altamente uniforme delle particelle nanodisco dopo assemblaggio offre un supporto più solido per ottenere dati crio-EM di alta qualità e dati cinetici affidabili per risonanza plasmonica superficiale/interferometria bio-layer 12.

Nell'ultimo decennio, la tecnologia dei nanodischi è diventata uno strumento potente per studiare le proteine di membrana negli ambienti lipidici naturali. Ad esempio, Vilela e i suoicolleghi 13 hanno stabilito un quadro sistematico per l'assemblaggio dei nanodischi ottimizzando le condizioni di ricostituzione e verificando la qualità dei componenti finali. In particolare, hanno combinato la cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) con indicatori quantitativi (inclusi efficienza di assemblaggio e simmetria di picco) per valutare oggettivamente l'omogeneità deicampioni 13. Attualmente, i nanodischi sono diventati una piattaforma versatile. Utilizzando la crio-EM a singola particella per rilevare le proteine assemblate e ricostituite con nanodischi, si possono ottenere strutture ad alta risoluzione delle proteine di membrana, e la loro applicabilità è stata saldamente stabilita. La caratteristica di densità a doppio anello della banda MSP è la prova strutturale decisiva per il successo del legame 10,14,15. Inoltre, i nanodischi rappresentano uno strumento prezioso sia per l'analisi funzionale delle proteine di membrana negli ambienti a bistrato lipidico, sia per la loro applicazione negli studi di risonanza magnetica nucleare insoluzione 16,17.

Questo protocollo descrive un metodo per assemblare la proteina umana della membrana Task2 in nanodischi. Human Task2 è un membro a pH-dipendente della famiglia di canali K+ (K 2P) a due pori18,19. Come altri canali K2P, Task2 è un omodimero scambiato a dominio, con ogni catena protomerica che contiene quattro eliche transmembrana (TM1–TM4), due eliche dei pori reentranti (PH1 e PH2), due filtri di selettività (SF1 e SF2) e due eliche extracellulari formanti cappuccio (CH1 e CH2). La proteina bersaglio era una forma troncata di Task2 priva dei 166 amminoacidi C-terminali — una regione prevista come in gran parte non strutturata — che si è scoperto migliorare l'espressione proteica e la stabilità biochimica. Il peso molecolare di Task2 ricombinato è di circa 72 kDa con un tag GFP. Era stato solubilizzato e purificato con un detersivo in precedenza. È stato combinato con lipidi e MSP con un rapporto stechiometrico calcolato con precisione. Dopo la rimozione del detersivo con Bio-Beads, il campione è stato ulteriormente purificato tramite cromatografia a esclusione di dimensioni (SEC) per ottenere una preparazione adatta alla crio-EM. Sono state quindi generate medie di classe bidimensionali (2D) da dati crio-EM a particella singola per convalidare l'integrità del campione.

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Protocollo

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1. Preparazione del stock lipidico

  1. Preparazione dei lipidi
    1. Prepara miscele lipidiche utilizzando tre fosfolipidi: 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DOPE), 2-oleoill-1-palmitoilglicero-3-fosfocolina (POPC) e 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilserina (POPS).
    2. Utilizzare soluzioni stock pre-preparate di questi lipidi in cloroformio, ciascuna a una concentrazione di 25 mg/mL.
      NOTA: È necessario equipaggiamento di protezione individuale quando si maneggia il cloroformio e tutte le procedure devono essere eseguite in una cappa a pompa. Conserva il cloroformio in un armadietto chimico dedicato.
    3. A causa della volatilità del cloroformio, quando si misura con una microsiringa, verificare che il volume della soluzione di stocco lipidico corrisponda al volume inizialmente registrato prima di ogni utilizzo. Se avviene l'evaporazione, si riempie la soluzione con cloroformio puro al volume originale e si mescola accuratamente.
      NOTA: Prima di ogni misurazione, risciacqua la microsiringa due volte con cloroformio.
    4. Preparare una miscela lipidica da 100 μL con un rapporto di massa di DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. In base a questo rapporto, si combinano 50 μL diV DOPE, 25 μL di VPOPIC e 25 μL di VPOPS. Misura il volume corrispondente secondo il numero calcolato. Aggiungilo alla provetta di vetro e mescola bene.
    5. Mettere il tubo di prova di vetro in un bagno d'acqua per ridurre la volatilizzazione del cloroformio e mantenere stabile la temperatura ambiente.
  2. Preparazione della pellicola lipidica
    1. Evaporare il cloroformio sotto un delicato flusso di azoto finché tutto il liquido non è stato rimosso e si forma una pellicola trasparente omogenea simile a un gel sul fondo della provetta.
      NOTA: Assicurarsi che sia visibile una pellicola lipidica uniforme e secca sul fondo del tubo di vetro, senza gocce residue di liquido. Evita un flusso eccessivo di azoto, poiché potrebbe causare bolle e impedire la completa secchezza del cloroformio.)
    2. Aggiungi circa 2 mL di n-pentano a goccia a una provetta di vetro. Successivamente evapora il solvente utilizzando il metodo di asciugatura dell'azoto descritto nella 1.2.1 per ottenere una pellicola lipidica secca e trasparente. Il n-pentano viene evaporato in una provetta di vetro a causa della sua inercia chimica e della compatibilità con i solventi organici. Il vetro evita il rischio di lisciviazione o degrado della plastica associato a molti materiali da laboratorio in plastica, preservando così la purezza lipidica durante la formazione del film.
      NOTA: il n-pentano deve essere conservato in un armadietto dedicato ai reagenti e, quando utilizzato, maneggiato con attenzione in una cappa elettrica indossando l'equipaggiamento di protezione individuale appropriato.
    3. Allenta il tappo della provetta e mettila in un essiccatore a vuoto. Evacuare il dissecatore e mantenerlo sotto vuoto per rimuovere eventuali solventi residui. Posiziona gel di silice autoindicativo sul fondo del dessiccatore per assorbire l'umidità.
      NOTA: Evaporare cloroformio residuo e n-pentano fino a renderlo secchi in una cappa a fumi.
  3. Idratazione lipidica e preparazione della soluzione di scorte
    1. Rimuovere la pellicola lipidica dal dissiccante e idratarla aggiungendo 250 μL di tampone a basso contenuto di sale (LSB) senza detersivo (Tabella Supplementare 1). Questo produce una concentrazione finale di lipidi di 10 mg/mL.
      NOTA: È stato selezionato un tampone a base di ioni potassio perché Task2 è un canale ionico potassico
    2. Dopo aver risospeso il lipide, dividere il lipide uniformemente in quattro tubi di vetro e sonicare le sospensioni finché non diventano chiare e trasparenti, indicando la formazione riuscita dei liposomi (circa 1,5 h). Esegui la sonicazione al 60% di ampiezza usando un ciclo di 4 secondi accesi e 6 secondi spento.
    3. Raccogli la soluzione lipidica chiarificata e la quota di 1,5 mL in singoli tubi microcentrifughe. Risciacquo immediatamente lo spazio di ciascun tubo con gas azoto e conserva a -80 °C fino all'uso.

2. Sovraespressione e purificazione del MSP

  1. Espressione procariota del MSP
    1. Trasformazione del plasmide: Utilizzare il plasmide MSP1D1 che porta un tag 7×His per trasformare le cellule competenti di E. coli BL21 (DE3). Impiattare la miscela di trasformazione su piastre di agar Luria-Bertani (LB) contenenti kanamicina (50 μg/mL) e incubare durante la notte a 37 °C per ottenere colonie singole.
    2. Amplificazione della coltura: Prendi un singolo clone e inoculalo in 5 mL di mezzo contenente kanamicina e incuba durante la notte a 37 °C con agitazione. Inoculare la coltura notturna in un mezzo LB liquido con un rapporto 1:100, poi crescere a 37 °C con scuotimento finché la densità ottica a 600 nm (OD600) raggiunge 2,0–3,0.
    3. Induzione dell'espressione proteica: Indurre l'espressione di MSP aggiungendo isopropilico β-d-1-tiogalattipiranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 0,5–1 mM. Continuare a coltivare le cellule a 16 °C per 16–20 ore con scuotere.
  2. Disturbo cellulare
    1. Raccolta dei pellet: centrifugare la coltura batterica a 4 °C per 10 minuti. Scartare il soprantantante e trattenere la pellet cellulare.
    2. Lisi batterica: Risospendere il pellet derivato da 1 L di coltura in 100–150 mL di tampone di lisi (Tabella supplementare 1). Omogeneizzare accuratamente fino a ottenere una sospensione uniforme senza grumi visibili. Aggiungi PMSF alla sospensione per inibire le proteasi e ridurre la schiuma.
    3. Sonicazione: Usa un disruptor a celle ultrasoniche refrigerate per rompere i batteri. Imposta la potenza al 35% e applica cicli di impulsi di 3 s seguiti da pause di 6 s. Per evitare il surriscaldamento, prevedi un intervallo di riposo di 2 minuti dopo ogni 15 minuti di tempo cumulativo di sonicazione. Continuare finché il lisato non diventa trasparente e di colore marrone chiaro.
    4. Chiarimento: centrifuga il lisato a 30.000 g per 45 minuti a 4 °C e raccogli il soprantantante per i passaggi successivi.
  3. Purificazione MSP
    1. Preparazione della resina Ni-NTA: Prendi 3–5 mL di resina Ni-NTA e imballali in una colonna gravitazionale (dimensioni: 26,4×134,8 mm). Lavare la resina con 3 volumi di colonna (CV) di acqua distillata e bilanciarla con 3 CV di Wash Buffer 1 (Tabella Supplementare 1).
    2. Legame del MSP alla resina: Dopo la centrifugazione del lisato cellulare, miscela il soprantantante con la resina Ni-NTA equilibrata. Aggiungi imidazolo a una concentrazione finale di 5 mM e incuba la miscela a 4 °C per 2 ore con una rotazione dolce al buio.
    3. Lavare per rimuovere impurità: lavare sequenzialmente con gradienti di Wash Buffer 1, Wash Buffer 2 (Tabella Supplementare 1) e Wash Buffer 3 (Tabella Supplementare 1), utilizzando almeno 50 mL di ciascun buffer. Monitorare l'assorbanza UV a 280 nm (A280) del flusso attraverso e continuare a lavare finché il valore di A280 non scende sotto 0,01.
    4. Eluzione: Eludi la proteina bersaglio con Elution Buffer (Tabella Supplementare 1) e raccogli le frazioni eluate. Continuare il processo di eluzione, raccogliendo frazioni finché la A₂₈₀ dell'eluato scende sotto 0,01.
    5. Monitoraggio e analisi del processo: Raccogliere campioni dalle fasi chiave di purificazione—inclusi il surnadante, il precipitato, il flusso attraversante, le frazioni di lavaggio e le frazioni di eluzione. Analizzarli tramite SDS-PAGE per valutare l'efficienza di purificazione (Figura Supplementare 1).
    6. Dialisi per lo scambio di tamponi: trasferire l'eluato accumulato nel tubo di dialisi e dialisalizzare contro il tampone di dialisi (Tabella Supplementare 1) a 4 °C con una lieve mescolare durante la notte.
    7. Ultrafiltrazione e concentrazione: Concentrare la soluzione dializzata utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione fino a una concentrazione finale di MSP di 2–5 mg/mL. Il MSP purificato e concentrato è ora pronto per l'uso nell'assemblaggio di nanodischi di proteine di membrana.

3. Attivazione delle Bio-Sfere

  1. Pesatura
    1. Pesa circa 250 mg di Bio-Beads in un tubo centrifuga da 50 mL utilizzando una bilancia analitica.
  2. Lavaggi al metanolo
    1. Aggiungi 25–30 mL di metanolo al tubo. Ruota accuratamente o vortice la miscela al buio, poi incuba per 20 minuti. Scartare con cura il soprantantante dopo l'incubazione.
    2. Ripeti questo passaggio del lavaggio con metanolo tre volte in totale.
      NOTA: A causa della volatilità del metanolo, questa procedura deve essere eseguita in una cappa con l'attrezzatura di protezione individuale appropriata. Raccogli il metanolo usato e trattalo come liquido di scarto biologico.
  3. Lavaggi acquosi
    1. Aggiungi 25–30 mL ddH2O alle perline. Scuoti o ruota il tubo per mescolarlo e incubare per 20 minuti.
    2. Scartate il soprannatante. Ripeti questo passaggio di lavaggio acquoso tre volte.
  4. Equilibrio con LSB
    1. Aggiungi 25–30 mL di LSB senza detersivo alle perline. Scuoti o ruota il tubo su un tavolo rotante per mescolarlo e incubare per 20 minuti.
    2. Scartate il soprannatante. Ripeti questo passaggio di equilibrio LSB tre volte per condizionare completamente le sfere.
  5. Alineazione e archiviazione
    1. Dividere equamente le Bio-Sfere attivate in tre tubi microcentrifuga da 1,5 mL. Assicurati che le perline rimangano umidite con una piccola quantità di LSB.
    2. Avvolgi i tubi in carta di alluminio per proteggerli dalla luce e conservali sul ghiaccio per un uso immediato.

4. Assemblaggio del nanodisco

  1. Preparazione di lipidi e MSP
    1. Chiarificazione sul stock lipidico: Recupera un'aliquota del brodo lipidico pre-preparato e scongelalo. Centrifugare immediatamente il tubo a 7.000 x g per 5 secondi a 4 °C per raccogliere il contenuto sul fondo.
    2. Ultrasuoni in un bagno d'acqua e monitora la chiarezza e la temperatura ogni 5–10 minuti per evitare il surriscaldamento. Esegui la sonicazione al 60% di ampiezza. Ultrasuoni il materiale lipidico finché non diventa chiaro e trasparente.
    3. Scongelamento MSP: Scongelare 1 aliquota della soluzione MSP preparata in un bagno d'acqua ghiacciata.
  2. Prepara il tampone secondo il rapporto stechiometrico.
    1. Quantificare la proteina di membrana: Isolare la proteina di membrana purificata (Task2), solubilizzata in 0,025% DDM/0,005% CHS, tramite cromatografia di esclusione di dimensione (SEC). Iniettare un volume di campione di 500 μL a una portata di 0,5 mL/min su una colonna di aumento Superose 6 (Cytiva). Raccogli il picco di eluzione a 14,8 mL e concentralo (Figura 1). Determina la concentrazione proteica usando un NanoDrop.
    2. Calcola la quantità molare proteica: Calcola la quantità molare (n) della proteina di membrana bersaglio usando la formula: n = C × V, dove C è la concentrazione molare e V il volume.
    3. Determinare i volumi MSP e lipidici: Calcolare i volumi richiesti di MSP e soluzioni di stock lipidica basandosi su un rapporto stechiometrico molare della proteina bersaglio: MSP : lipidi = 1 : 5 : 250.
    4. Prepara il mix master: basandosi sui risultati del calcolo, combina i volumi corrispondenti di lipidi e MSP per preparare un mix master da 300 μL.
      NOTA: Assicurarsi che il detersivo sia incluso in questa miscela per mantenere una concentrazione coerente con quella presente nella soluzione proteica, prevenendo così un'aggregazione prematura.
  3. Rimozione del detersivo e assemblaggio dei nanodischi
    1. Incubazione iniziale con Mix di Ricostituzione: Incubare il tampone preparato (Tabella Supplementare 1) su ghiaccio per 10 minuti. Poi, aggiungi lentamente 50 μL della miscela alla soluzione proteica concentrata, mescolando delicatamente tramite pipettaggio per garantire l'omogeneità.
    2. Bilanciamento della miscela proteina-lipidica: Mettere la miscela combinata sul ghiaccio per 1 ora. Inverti delicatamente il tubo ogni 15 minuti per mescolarlo bene.
    3. Prima incubazione con Bio-Sfere: Centrifugare brevemente la miscela a 7.000 x g per 5 secondi a 4 °C per raccogliere la soluzione proteica sul fondo del tubo. Prendere un'aliquota delle Bio-Sfere preattivate, aspirare il residuo di LSB, aggiungere la soluzione proteica alle sfere e incubare con rotazione al buio per 1 ora per prevenire la degradazione indotta dalla luce della proteina bersaglio.
    4. Seconda incubazione con Bio-Sfere: centrifugare la miscela a 7.000 x g per 5 secondi a 4 °C e trasferire con cura il soprannatante in un secondo aliquota di Bio-Sfere (da cui è stato aspirato anche il LSB) e mescolare bene con una dolce inversione al buio per 4–8 ore o per tutta la notte.
    5. Incubazione finale con Bio-Sfere: Recuperare la soluzione proteica dopo un'incubazione notturna, centrifugarla brevemente e trasferire il sovrandante alla terza e ultima porzione di Bio-Sfere preattivate. Incubare con rotazione a 4 °C al buio per 1 ora.
    6. Dopo una breve centrifugazione, trasferire il surnante in un tubo pulito per microcentrifuga e centrifugare a 17.000 x g a 4 °C per 10 minuti per rimuovere eventuali aggregati.
      NOTA: Smaltire le Bio-Perle esaurite come rifiuti biologici.
    7. Purificazione dei nanodischi: Purificare i complessi nanodisco-Task2 tramite cromatografia a esclusione di dimensione (SEC): iniettare un volume campione di 500 μL a una portata di 0,5 mL/min su una colonna di aumento Superose 6 e raccogliere il picco eluzionato a 15 mL (Figura 2).
    8. Concentrazione del Prodotto Finale: Aggregare le frazioni di picco dell'eluzione SEC e concentrarle fino a una concentrazione finale nanodisc-Task2 di 1,2–1,5 mg/mL, adatta per la preparazione del campione crio-EM.

5. Verificare che l'assemblaggio del nanodisco sia riuscito

  1. Analisi SDS-PAGE: campioni di aliquota dalle frazioni purificate con SEC.
    1. Analizza i campioni utilizzando SDS-PAGE al 12% per confermare la presenza di componenti chiave (ad esempio, MSP e proteina di membrana bersaglio), il che indica il successo dell'assemblaggio del nanodisco (Figura 3).
  2. Preparazione e analisi dei campioni crio-EM.
    1. Concentrare il campione assemblato con successo a una concentrazione finale di 1,2–1,5 mg/mL per la preparazione del campione crio-EM.
    2. Inizia centrifugando il campione a 17.000 x g e 4 °C per 10 minuti. Deposa una goccia di 3 μL su griglie d'oro Quantifoil R1.2/1.3 appena scaricate con glow (300 mesh, carbonio con fori).
    3. Incubare a 4 °C al 100% di umidità per 5 secondi. Applica la griglia per 4 secondi in un Vitrobot Mark IV e immergi in congelamento in etano liquido mantenuto a temperatura di azoto liquido.
    4. Raccogliere stack di film a super-risoluzione utilizzando software EPU su un Titan Krios G4 crio-EM che opera a 300 kV e equipaggiato con un rivelatore di elettroni diretti Falcon G4i.
    5. Imposta il tempo di esposizione a 2,78 s, corrispondente a una dimensione di pixel di 0,73 Å (165k ×) e una dose totale accumulata di circa 50 e⁻/Å 2 per ogni stack di film EER.

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Risultati

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La preparazione riuscita del materiale lipidico era indicata dalla formazione di una soluzione trasparente e trasparente dopo la sonicazione. Per il MSP, la cromatografia a affinità al nichel ha prodotto un prodotto ad alta purezza di circa 3 mg/mL. L'assemblaggio dei nanodischi è stato confermato dalla SEC, che ha mostrato un profilo eluzionale caratteristico (Figura 2). Rispetto al profilo SEC Task2 ottenuto prima dell'assemblaggio del nanodisco (Figura 1)...

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Discussione

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Il metodo è presentato per ricostituire proteine di membrana solubilizzate in detergente in nanodischi tramite la rimozione del detergente, fornendo così un ambiente più nativo a bistrato lipidico. Il successo di questo processo di assemblaggio dipende da diversi fattori chiave. La più importante tra queste è il preciso rapporto stechiometrico tra la proteina di membrana, il MSP e i lipidi. Rapporti stechiometrici impropri possono portare all'aggregazione proteica o all'assemblaggio fall...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano lo staff del Centro di crio-elettromagnetismo dell'Università di Henan, così come il Professor Wei Wang, per il loro supporto esperto. Il finanziamento è stato fornito dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 32371261 a B.L. e 32301011 a R.Z.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bio-perleBio-rad1523920
Colesteril emisuccinatoAnatraceCH210
CloroformioSinoreagenteUso in una cappa
FANTASTICOAvanti850725P
MetanoloSinoreagente
n-Dodecyl-beta-D-maltosideAnatraceD310
N-pentaneAdamasUso in una cappa
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-radSegui il protocollo del produttore per un uso corretto
Tubi per dialisi SnakeSkinThermo68011
Superose  6 Aumento10/300 GLCytiva29091596
Colonne di spin a ultrafiltrazione Amicon Ultra-15MilliporeUFC905008

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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