Bex-plex consente la visualizzazione simultanea di marcatori proteici e trascrizioni di acidi ribonucleici per la profilazione spaziale profonda di tessuti intatti

Summary

Qui presentiamo un protocollo per combinare la colorazione iterativa proteica (IBEX) con la tecnologia di ibridazione in situ RNAscope per il fenotipaggio spaziale profondo di tessuti fissi e congelati intatti per applicazioni di profilazione spaziale ad alta risoluzione.

Abstract

Qui presentiamo un protocollo per consentire la profilazione spaziale simultanea di marcatori di proteine e acidi ribonucleici (RNA) a risoluzione monocellulare in tessuti intatti. Uno dei problemi fondamentali che circondano i tumori solidi è l'incapacità di prevedere la reattività del paziente all'intervento terapeutico. Decifrare queste complessità richiede una misurazione quantitativa dei comportamenti cellulari, delle interazioni e dei fenotipi all'interno dei tessuti intatti. In particolare, proteoma e trascrittoma forniscono informazioni sovrapposte ma non ridondanti che possono essere fondamentali per progettare immunoterapie razionali. Tuttavia, attualmente non esiste un modo semplice ed economico per profilare in profondità sia lo stato trascrizionale che quello funzionale di tutte le cellule nel microambiente tumorale mantenendo al contempo le loro informazioni critiche di localizzazione spaziale. A tal fine, abbiamo combinato con successo la piattaforma IBEX (iterative blaeach extends multiplexity) con HiPlex RNAscope per visualizzare simultaneamente marcatori proteici ad alto plex e trascritti di acido ribonucleico ad alto complesso (RNA) con risoluzione a singola cellula. Questo approccio incorpora un passaggio modificato per il recupero del bersaglio dell'RNA per preservare la morfologia nucleare e consentire un accurato allineamento delle immagini attraverso i cicli. "Bex-Plex" ci consente di eseguire un protocollo IBEX non modificato su tessuti congelati fissi, seguito dal protocollo HiPlex RNAscope, in cui utilizziamo un recupero di bersagli RNA modificato per garantire l'allineamento a livello nucleare con i cicli IBEX. Questo protocollo è ottimizzato per tessuti congelati fissi e consente un'analisi spaziale integrata degli stati cellulari trascrizionali e funzionali. La capacità di profilare a questo livello di singola cellula non solo fornisce un profondo pozzo di informazioni sul tessuto stesso, ma può anche permettere previsioni sulle sfumate interazioni cellulari che guidano la risposta terapeutica, fornendo un quadro per studiare la biologia spaziale nei microambienti tumorali e nei sistemi correlati.

Introduction

Dalla loro introduzione nel 2011, le immunoterapie oncologiche che riducono la soppressione delle cellule T citotoxiche bloccando molecole di checkpoint immunitari inibitori come PDL-1 e CTLA-4 sono emerse come il punto di riferimento per il trattamento dei tumori^{solidi 1}. Tuttavia, nonostante l'uso su larga scala nei pazienti, l'efficacia clinica di questi farmaci varia ampiamente perché molti tumori solidi presentano o generano resistenza a queste^{terapie o alla fine generano resistenza a queste terapie.} In molti casi ciò è dovuto alla natura estremamente eterogenea dei tumori solidi, anche tra lo stesso tipo di cancro³. Una comprensione più approfondita delle relazioni cellulari che si verificano nei tumori solidi è fondamentale per generare modalità di trattamento migliorate. Pertanto, identificare i meccanismi esatti e le interazioni che alimentano e sostengono questa resistenza è al centro della ricerca sul cancro. Qui, puntiamo a sviluppare un metodo che consenta un'analisi spaziale integrata dell'espressione di proteine e RNA all'interno di tessuti intatti per caratterizzare meglio queste complesse interazioni cellulari.

Il microambiente tumorale (TME) è composto dai componenti cellulari e strutturali non cancerosi che modellano la crescita tumorale e la risposta immunitaria, inclusi fibroblasti associati al cancro, cellule immunitarie infiltranti, componenti vascolari e la matrice^{extracellulare 4}. Recentemente è diventato evidente che la composizione e l'organizzazione del TME influenzano fortemente se i tumori sono permissivi o resistenti all'infiltrazione immunitaria, uno dei principali fattori che determinano la risposta^{all'immunoterapia 5}. In molti tumori, un fenotipo di "deserto immunitario", caratterizzato da un basso numero di cellule T e dalla presenza di popolazioni mieloidi altamente immunosoppressive, è correlato con una scarsa risposta alle terapie di blocco^{dei checkpoint 6,7}. La segnalazione chemoquina governa molte di queste dinamiche di reclutamento. Ad esempio, CXCL1 e CCL2 attraggono cellule mieloidi immunosoppressive, mentre l'asse CXCR3-CXCL9/CXCl10 recluta sia cellule T citotossiche che regolatorie nel^{tumore 8}. Di conseguenza, l'ambiente di segnalazione specifico per nicchia può influenzare potentemente il fenotipo e la funzione cellulare. Ad esempio, nei pazienti oncologici al coloretto, l'asse CCL5-CCR5 controlla la funzione soppressiva dei macrofagi associati al tumore (TAM) e bloccare questo segnale orienta la TAM verso un fenotipo anti-tumorigeno e si correla con risposte cliniche^{migliorate 9}. Inoltre, interazioni dirette tra cellule immunitarie, fibroblasti associati al cancro e/o cellule tumorali tramite ICAM e PDL-1 possono indurre esaurimento immunitario e una smussazione dell'immunità^{antitumorale 10}. Insieme, questi risultati sottolineano l'importanza delle analisi risolte spazialmente per comprendere come il TME influenzi l'efficacia terapeutica.

L'imaging immunofluorescente (IF) rimane un approccio fondamentale per visualizzare l'espressione proteica e le interazioni cellula-cellula nei tessuti. Il campo è passato dai tradizionali IF a 3-4 colori a flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto che si basano su colorazione e imaging iterativo. In questi metodi, grandi dataset vengono generati tramite cicli ripetuti di marcatura degli anticorpi, imaging e inattivazione o rimozione dei fluorofori, in modo che ulteriori marcatori possano essere colorati e immagiati¹¹. Iterative Whiteing Extends Multiplexity (IBEX) è stata recentemente introdotta come piattaforma di imaging iterativo facile da usare^{ed economica 12}. Compatibile con l'uso di anticorpi commerciali e microscopi convenzionali, IBEX utilizza boroidrido di litio (_{LiBH 4}) per ridurre la fluorescenza dei coloranti più comunemente usati senza danneggiare gli epitopi tissutali, permettendo l'acquisizione di fino a 75 parametri per un singolo^{tessuto 13}. Le immagini ottenute da questa colorazione ciclica sono allineate utilizzando il software open-source SimpleITK per produrre dataset compositi adatti ad analisi spaziali ad alta dimensione.

Complementari alla fenotipizzazione a livello proteico, i metodi trascrittomici spaziali possono fornire informazioni preziose sullo stato trascrizionale delle cellule nel loro ambiente nativo. In particolare, l'ibridazione in-situ (ISH) è una tecnica popolare per identificare la localizzazione di sequenze di DNA o RNA in uno specifico^{tessuto 11}. RNAscope è un approccio ISH ben consolidato che utilizza sonde con una chimica Z unica per amplificare specificamente i trascritti di RNA a risoluzione di singola molecola ed è compatibile con molti tipi diversi^{di campioni 14}. Come piattaforma ampiamente adottata e disponibile commercialmente tramite Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope offre sonde validate contro una vasta gamma di bersagli, semplificando la progettazione sperimentale per applicazioni diverse.

Si può ottenere una visione più completa dell'identità e delle funzioni cellulari combinando la rilevazione di proteine e RNA all'interno dello stesso tessuto. Le proteine secrete a breve durata, come citochine e chemimochine, tradizionalmente non hanno una colorazione affidabile degli anticorpi da parte dell'IHC, ma informazioni sulla loro espressione possono essere ottenute quantificando i loro trascritti di mRNA. I precedenti tentativi di co-rilevare RNA e proteina, come l'IHC cromogenica convenzionale o la TSA-OPAL, sono stati limitati da amplificazione non lineare del segnale e da protocolli di recupero antigenico, che richiedevano molto^tempo. Rispetto a questi approcci, il metodo Bex-Plex consente la rilevazione simultanea di proteine e RNA ad alto plex preservando il contesto spaziale e la morfologia nucleare per una registrazione accurata delle immagini.

Qui presentiamo "Bex-Plex", un protocollo che integra le piattaforme IBEX e RNAscope per la caratterizzazione simultanea e quantificabile degli stati trascrizionali e traslazionali delle cellule all'interno dei loro tessuti nativi. In Bex-Plex, i tessuti incorporati in OCT fissi subiscono il protocollo standard IBEX seguito da un flusso di lavoro RNAscope HiPlex leggermente modificato, in cui il recupero del bersaglio viene eseguito a 60°C con un tempo di incubazione di 1 ora rispetto all'incubazione originale a 99°C di 5 minuti. Questo preserva l'architettura dei nuclei, permettendo un allineamento accurato dei marcatori fiduciali quando si registrano le immagini separate dai cicli IF e ISH in uno solo. Questo protocollo è più adatto per studi che richiedono un'analisi spaziale simultanea dell'espressione di proteine e RNA in tessuti intatti, in particolare quando la disponibilità tissutale è limitata o quando la conservazione dell'architettura spaziale è critica, come nell'analisi del microambiente tumorale o negli studi di profilazione immunitaria.

Utilizzando reagenti ampiamente disponibili e compatibili con la maggior parte delle piattaforme di imaging, Bex-Plex può essere eseguito da qualsiasi ricercatore tecnicamente formato, familiare con l'imaging fluorescente e con accesso a un microscopio convenzionale. Il protocollo presentato qui è ottimizzato per campioni congelati fissi. Attualmente, il protocollo è stato convalidato su tessuti congelati fissi e potrebbero essere necessarie ulteriori ottimizzazioni per l'applicazione ad altri tipi di campioni come FFPE o campioni clinici umani.

Questo flusso di lavoro sarà prezioso in qualsiasi contesto in cui il tessuto sia limitato o prezioso, come biopsie tissutali o esperimenti su animali con un campione limitato, così come per il fenotipaggio di cellule che potrebbero essere difficili da estrarre con tecniche dissociative. Bex-Plex fornisce informazioni simultanee e quantificabili sui profili trascrizionali e traslazionali delle singole cellule mantenendo il loro contesto spaziale, dati unici e unici per rispondere alle domande sulle relazioni e le interferenze tra cellule nel loro ambiente originale.

Protocol

Le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali dell'Università della California, San Diego (numero di protocollo S24049). Maschi e femmine di 7-12 settimane di età su un background genetico C57BL/6 e ospitati in condizioni specifiche prive di patogeni sono stati utilizzati per questi esperimenti.

1. Preparazione dei tessuti

1. Eutanasia dei topi sperimentali con misure primarie e secondarie approvate (ad esempio eutanasia per CO₂ e lussazione cervicale) e prelieva tessuti di interesse in mezzi integrati.
2. Prepara un nuovo stock di fissativo tissutale diluendo una soluzione al 4% di paraformaldeide (PFA) allo 0,5% o all'1% in 1X PBS. Usare PFA allo 0,5% per tessuti a basso volume come i linfonodi e PFA all'1% per tessuti ad alto volume come i tumori.
   ATTENZIONE: Il paraformaldeide è infiammabile e tossico se ingerito o ingerito. Maneggiare con i DPI appropriati ed evitare il contatto con pelle o occhi.
3. Trasferire i tessuti in una piastra da 24 pozzi con 2 mL di fissativo per pozzo e incubare durante la notte a 4°C.
   Nota: tempi di incubazione superiori a 16 ore possono portare a problemi di sovrafissazione.
4. Riempi i pozzi di una nuova piastra a 24 pozzi con 1X PBS e trasferisci i tessuti dalla piastra fissativa.
   Punto di pausa: Se necessario, i tessuti possono essere conservati in 1X PBS a 4°C per un massimo di 7 giorni.
5. Taglia il grasso o i detriti in eccesso dai tessuti uno alla volta usando un mirino di dissezione e strumenti. Aggiungi un piccolo volume di 1X PBS direttamente sul tessuto per prevenire la disidratazione durante il taglio.
6. Prepara una soluzione di saccarosio al 30% w/v diluendo il brodo di saccarosio in polvere in 1X PBS.
7. Trasferire i tessuti in una piastra da 24 pozzi con 2 mL di saccarosio al 30% per pozzo e incubare durante la notte a 4°C per disidratarsi. I tessuti sono adeguatamente disidratati quando affondano sul fondo dei pozzi.
8. Riempi i criostampi etichettati con OCT e posiziona i fazzoletti uno alla volta negli stampi. L'orientamento dei tessuti dipende dall'origine, ma la nostra raccomandazione standard sarebbe che la superficie più grande sia parallela al fondo del criomoldo. Assicurati che i tessuti siano completamente sommersi nell'OCT.
9. Mettila sul ghiaccio secco per 10 minuti per congelare e conserva a -80°C.

2. Sezionamento tissutale

Nota: Tutti i reagenti e i materiali di laboratorio utilizzati per questo protocollo devono essere privi di RNasi. Fai attenzione a prevenire contaminazioni quando maneggia i vetri.

1. Rivestire i vetri al microscopio senza RNasi con 15 μL di adesivo allume cromato e incubare per 1 ora a 60°C in forno. Le vetrine rivestite in allume cromata possono essere conservate a temperatura ambiente (RT) fino a un mese prima dell'uso.
2. Estrai i tessuti incorporati in OCT dal congelatore a -80°C e mettili in un criostato/criotoma a -20°C per mantenere l'equilibrio per almeno 20 minuti.
3. Tessuti sezionati su vetrine rivestite in allume cromato con uno spessore di 10–15 μm.
4. Conservare i vetrini con sezioni tagliate a 4°C oppure, se colorare lo stesso giorno, lasciare che i vetrini si equilibrino con RT. I vetri sezionati possono essere conservati a 4°C per un massimo di 5 giorni prima dell'uso.

3. Colorazione proteica

1. In un acquario per immersione, immergi il vetrino da colorare in PBS 1X senza RNase per 5 minuti per rimuovere l'eccesso di OCT dai tessuti.
2. Usa una penna barriera idrofobica per disegnare scatole intorno ai fazzoletti sul vetrino e lascia asciugare per 2 minuti.
3. Prepara una soluzione bloccante di blocco del recettore anti-FC 10 μg·mL⁻¹ in PBS 1X senza RNasi. Aggiungi il buffer di blocco ai campioni sul vetrino, usando abbastanza per creare una bolla che copre completamente il tessuto (100–150 μL·^sezione-1).
   Nota: A volte è necessaria l'aggiunta di FBS o BSA (tipicamente 1–2%) al buffer di blocco per tessuti e/o marcatori difficili.
4. Incubare le vetrine a RT in una scatola di colorazione umida per 1 ora, poi lavarle completamente immerse in un serbatoio di immersione pieno di PBS 1X senza RNase per 5 minuti.
5. Prepara la soluzione primaria di colorazione per anticorpi in PBS 1X priva di RNasi, pianificando 100-200 μL per sezione tissutale. Le diluizioni standard degli anticorpi variano da 1:50 a 1:200, ma si consiglia di effettuare titolazioni a singola colorazione per identificare il miglior fattore di diluizione per un particolare anticorpo e/o tipo di tessuto. Vortice e impulsi fanno ruotare gli anticorpi prima di pipettare per prevenire aggregati fluorescenti.
6. Rimuovi i vetrini dal lavaggio e svuota delicatamente il liquido in eccesso dagli angoli delle scatole dei campioni usando una salvietta assorbente per evitare di diluire la soluzione di anticorpi.
7. Applica la soluzione di anticorpi nello stesso modo della soluzione bloccante, formando una bolla sul tessuto.
8. Posiziona i vetri orizzontalmente in un forno a 37°C e incuba per 1 ora. In alternativa, Incubate porta a RT per 3–4 ore in una scatola umida. Possono essere utilizzati protocolli IF standard già ottimizzati per il tessuto desiderato di interesse. Mantenere i vetri in un ambiente umido durante l'incubazione per prevenire la disidratazione. (ad esempio, usa un tovagliolo di carta bagnato sul fondo della teglia per le tintine).
9. Lava i vetri immergendoli in PBS 1X senza RNase per 2 minuti. Ripeti due volte per un totale di tre lavaggi. Se necessario per il pannello di colorazione, prepara una soluzione secondaria di colorazione per anticorpi in PBS 1X senza RNase durante questo periodo. Le diluizioni standard degli anticorpi variano da 1:500 a 1:1000, ma si consiglia di effettuare titrare singole per identificare il miglior fattore di diluizione per un particolare anticorpo e/o tipo di tessuto.
10. Elimina eventuali eccessi di PBS dalle vetri con una pulizia assorbente e aggiungi 100–200 μL di soluzione secondaria anticorpale per colorare a ogni sezione di tessuto. Metti i vetri orizzontalmente a 37°C in forno e incuba per 30 minuti. In alternativa, i vetrini possono essere colorati a RT per 1–2 ore in una scatola umida.
11. Lava i vetri immergendoli in PBS 1X senza RNase per 2 minuti. Ripeti due volte per un totale di tre lavaggi.
12. Diluire il colorante nucleare DAPI a una concentrazione finale di 0,2 μg·mL⁻¹ in PBS 1X senza RNASI e aggiungere 100–200 μL a ogni sezione tissutale.
13. Incubare i vetrini per 10 minuti a RT in una scatola umida, poi lavare una volta immergendole in un PBS 1X senza RNase e immergendo su e giù brevemente.
14. Svitate il liquido in eccesso dalle vetrine con una strofinetta assorbente e aggiungete 20–30 μL di mezzo di montaggio antifade a base acquosa in ogni sezione. Posiziona con cura un sottoveste sul vetrino, assicurandoti di minimizzare le bolle, e lascia asciugare il mezzo da montaggio per 15–30 minuti.
15. Immagina le diapositive colorate. Per una spiegazione più dettagliata delle considerazioni di progettazione dei pannelli e dell'acquisizione dell'immagine per IBEX, si veda i protocolli IBEX originalmente^{pubblicati 12,13}.
    Punto di pausa: conservare i vetri montati al buio a 4°C per un massimo di 3 giorni, anche se consigliamo di procedere immediatamente per garantire una degradazione minima dell'RNA.

4. Sbiancamento con fluorofori e colorazione iterativa delle proteine

1. Immergi i vetri in un PBS 1X senza RNase finché lo scivolamento del coperchio scivola facilmente senza alcuna applicazione di forza. A seconda di quanto tempo il copertino è montato, questo può richiedere fino a 16 ore.
2. Durante l'ammollo dei vetri, prepara una soluzione di LiBH₄ da 1 mg·mL^⁻1 in DI H₂O senza RNasi, mescolando delicatamente fino a disciolto, e attendi 10 minuti che si attivi. L'attivazione si è verificata quando bolle sono presenti nella soluzione e l'attività dura fino a 4 ore.
   Attenzione: LiBH₄ è reattivo all'acqua, evita l'eccessiva esposizione del materiale in polvere all'umidità e smalti correttamente i rifiuti.
3. Lavare le vetrine una volta per 2 minuti in un PBS 1X senza RNase per rimuovere eventuali residui di mezzo di montaggio, poi pipettare 100–150 μL della soluzione_{LiBH 4} su ciascun tessuto. Incuba in una scatola umida per 15 minuti.
   Nota: A seconda dei fluorofori utilizzati per la colorazione, questo tempo di incubazione potrebbe dover essere allungato (discusso a lungo negli articoli sui metodi IBEX^)12,13.
4. Lava le vetri una volta immergendole in un PBS 1X senza RNase e immergendole su e giù brevemente.
5. Procedi a colorare le vetrine con ulteriori marcatori proteici seguendo i passaggi 3.5-3.15. Non è necessario ricolorare il colorante nucleare perché non si sbianca con_{LiBH 4}. Ripeti la colorazione proteica se necessario.
   Punto di pausa: Le vetri montate possono essere conservate a 4°C durante la notte prima di sbiancare l'ultimo ciclo proteico/IBEX e procedere all'RNA.
6. Procedere immediatamente con l'RNAscope HiPlex dopo aver sbiancato i fluorofori dell'ultimo ciclo. Sebbene siano stati eseguiti fino a sei cicli di IBEX standard senza perdita di tessuto o epitopi, non raccomandiamo di superare tre cicli di colorazione proteica per questo protocollo a causa del potenziale diminuimento della qualità dei trascrizioni di RNA in periodi di tempo più lunghi.

5. Preparazione del vetrino per RNAscope HiPlex

1. Immergi completamente i vetri in PBS 1X senza RNase finché il copriscione scivola facilmente senza alcuna forza. A seconda di quanto tempo il copertino è montato, questo può richiedere fino a 16 ore. Lava una volta per 2 minuti in un PBS 1X senza RNase per rimuovere eventuali residui di mezzo di montaggio.
2. Prepara 200 mL di etanolo al 50%, 200 mL di etanolo al 70% e 400 mL di etanolo al 100%.
3. Accendi un forno ibrido e impostalo a 60°C. Diluire il reagente 10X Target Retrieval in un calcio funzionante 1X in RNase DI_{H 2O}e preriscaldare mettendolo in forno fino al passaggio 5.8.
   Nota: Il mancato riscaldamento pre-riscaldato del reagente di recupero del bersaglio a 60°C influenzerà la registrazione a valle delle immagini dei cicli separati. Il reagente di recupero del bersaglio deve rimanere a 60°C per tutta la durata della fase di recupero.
4. Immergi i vetrini nel 50% di etanolo. Incubo per 5 minuti in tempo di terapia respirata.
5. Sposta i vetrini dal 50% di etanolo e immergili nel 70% etanolo. Incubo per 5 minuti in tempo di terapia respirata.
6. Rimuovi i vetrini dall'etanolo al 70% e immergi nel 100% etanolo. Incubare per 5 minuti alla RT e ripetere con etanolo fresco al 100%.
7. Rimuovi i vetri dall'etanolo al 100% e lascia asciugare a RT per 5 minuti.
8. Aggiungere 100–150 μL del reagente di recupero bersaglio 1X a 60°C in ogni sezione tissutale e posizionare le vetrine nel forno di ibridazione. Incubare a 60°C per 1 ora.
9. Rimuovi i vetri e risciacquo immergendoli in DI H2O senza RNase per 15 secondi. In questo momento, cambia la temperatura impostata sul forno a 40°C.
10. Trasferisci i vetri al 100% etanolo e incuba per 5 minuti, poi asciuga a RT per almeno 5 minuti.
11. Applicare Proteasi III sui vetri, 1–2 gocce per sezione di tessuto. Metti le vetrine nel forno di ibridazione e incuba a 40°C per 30 minuti.
12. Immergi i vetri in DI H_2Osenza RNase e lava immergendoli brevemente su e giù. Ripeti con acqua distillata fresca per un totale di 2 lavaggi.

6. Preparazione del reagente RNAscope e ibridazione con sonda

1. Prepara le scorte di sonda RNAscope HiPlex e il diluente HiPlex riscaldandoli a 40°C per 10 minuti in forno o a bagno d'acqua.
2. Un breve impulso di spin su tutte le scorte 50X Probe. Prepara una miscela funzionante di sonda diluendo ogni sonda bersaglio unica a 1X con il diluente RNAscope Probe. Prevedi di utilizzare 50–100 μL di miscela per sonda per tessuto e di mescolarla bene tramite vortice prima dell'uso. Il protocollo RNAscope HiPlex può accogliere fino a 3 cicli di 4 sonde (12 sonde in totale indicate T1-12). Per indicazioni sulla progettazione della sonda, consultare il protocollo^{RNAscope 14} pubblicato originalmente.
3. Posizionare i reagenti RNAscope HiPlex Amp 1–3 e HiPlex Fluoro T1-T4 a RT per equilibrarli.
4. Prendere le vetri trattate con Proteasi III e pipettare 50–100 μL della miscela della sonda su ciascuna sezione di tessuto. Posizionate orizzontalmente nel forno di ibridazione e incubate per 2 ore a 40°C.
5. Lava le veglie immergendole completamente in un buffer di lavaggio 1X per 2 minuti. Ripeti con un tampone fresco per un totale di 2 lavaggi.
   Punto di pausa: Le vetri possono essere memorizzate in un buffer SSC 5X a RT durante la notte, come descritto nel protocollo RNAscope di ACD. Se viene utilizzato questo punto di pausa, tieni presente che la mattina seguente saranno necessarie due lavaggi da 2 minuti in 1X wash buffer.

7. Amplificazione della sonda

Nota: Assicurarsi che tutti i reagenti siano bilanciati a RT prima di applicarli ai vetri.

1. Aggiungi 1–2 gocce del reagente HiPlex Amp1 ai vetri e incuba nel forno di ibridazione a 40°C per 30 minuti. Lava i vetri immergendoli completamente in un buffer 1X Wash per 2 minuti. Ripeti per un totale di 2 lavaggi.
2. Aggiungi 1–2 gocce del reagente HiPlex Amp2 ai vetri e incuba nel forno di ibridazione a 40°C per 30 minuti. Lava i vetri immergendoli completamente in un buffer 1X Wash per 2 minuti. Ripeti per un totale di 2 lavaggi.
3. Aggiungi 1–2 gocce del reagente HiPlex Amp3 alle vetrine e incuba nel forno di ibridazione a 40°C per 30 minuti. Lava i vetri immergendoli completamente in un buffer 1X Wash per 2 minuti. Ripeti per un totale di 2 lavaggi.
4. Aggiungi 1–2 gocce del reagente HiPlex Fluoro T1-T4 ai vetri e incuba nel forno di ibridazione a 40°C per 15 minuti. Lava i vetri immergendoli completamente in un buffer 1X Wash per 2 minuti. Ripeti per un totale di 2 lavaggi.
5. Aggiungi 3–4 gocce di reagente HiPlex DAPI in ogni sezione di tessuto e incuba per 1 minuto a RT.
6. Rimuovi il DAPI assorbendo il liquido dalle vetrine con una salvietta assorbente. Aggiungere immediatamente 100 μL di mezzo di montaggio antifade a base acquosa (può essere lo stesso usato durante le fasi di colorazione IBEX) a ogni sezione. Posiziona con cura un copertino sul veglietto, assicurandoti di minimizzare le bolle, e lascia asciugare il mezzo di montaggio per 15–30 minuti.
7. Procedi alle immagini.
   Punto di pausa: Le vetrine montate possono essere conservate al buio a 4°C per un massimo di 3 giorni, anche se consigliamo di procedere rapidamente per garantire una degradazione minima dell'RNA.

8. Taglio dei fluorofori e ibridazione iterativa dell'RNA

1. Per rimuovere gli slitti di copertura dalle slitte, immergi in buffer 4X SSC per almeno 30 minuti a RT. Lava una volta immergendo completamente i slide in un buffer SSC 4X nuovo e immergi su e giù brevemente.
2. Apri una nuova fiacola di soluzione da taglio e crea un calcio funzionante al 10% diluendo con 4X SSC buffer.
3. Metti le vetrine in una scatola umida e aggiungi 3–4 gocce della soluzione di taglio al 10%. Incubare a RT per 15 minuti, poi lavare le vetrine immergendole completamente nello 0,5% di PBST per 2 minuti. Ripeti con PBST fresco per un totale di 2 lavaggi.
4. Per procedere con il ciclo di imaging 2 del pannello RNAscope, bilanciare il reagente HiPlex Fluoro T5-T8 con RT.
5. Accendi il forno di ibridazione e imposta la temperatura a 40°C.
6. Aggiungi il reagente HiPlex Fluoro T5-T8 ai vetri e incuba nel forno di ibridazione a 40°C per 15 minuti. Lava i vetri immergendoli completamente in un buffer 1X Wash per 2 minuti. Ripeti per un totale di 2 lavaggi.
7. Assorbi con attenzione il liquido in eccesso dalle vetrine. Aggiungi immediatamente 100 μL di mezzo di montaggio a ogni sezione e posiziona con cura un slip di copertura sulla carrella. Lascia asciugare il mezzo da montaggio per 15–30 minuti e poi procedi con l'immagini.
8. Ripeti i passaggi 8.1–8.7 con il reagente HiPlex Fluoro T9-T12 per un totale di 3 cicli di RNAscopio, se opportuno. Si noti che, sebbene siano possibili 3 cicli con il protocollo RNAscope HiPlex, il tempo aggiuntivo richiesto per la colorazione proteica con questo protocollo può influire sulla qualità dell'RNA. Pertanto, 3 cicli potrebbero non essere sempre fattibili a seconda dei specifici trascrizioni mirate.

9. Elaborazione delle immagini

1. Elaborare individualmente i file grezzi di ogni round ed eseguire l'elaborazione delle immagini usando parametri coerenti, inclusi impostazioni di sottrazione dello sfondo, filtri di smoothing e tipo di trasformazione di registrazione. I canali dovrebbero essere nominati con un caratteristico separatore coerente (ad esempio Ciclo 1: CD45 AF532, dove ":" fa la distinzione tra ciclo e marcatore/fluoro).
2. Avvia il software SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) e clicca sulle estensioni Imaris > SimpleITK > registrazione affine dello z-stack usando il canale comune.
3. Carica un file immagine da ciascun ciclo multiplex e inserisci il carattere separatore per tutti i canali nominati (ad esempio ":").
4. Seleziona il canale da utilizzare per la registrazione delle immagini e l'immagine fissa a cui tutte le altre immagini saranno allineate. Si raccomanda di utilizzare DAPI come marcatore fiduciale, anche se può essere utilizzato qualsiasi canale comune denominato tra tutti i cicli.
5. Clicca su "Registra" e poi su "Ricampiona e salva immagine combinata".
6. Procedi all'analisi a valle con il software che preferisci. Per ulteriori informazioni sull'elaborazione e registrazione delle immagini, consulta il protocollo IBEX^{originale 12,13}.

Results

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro Bex-Plex.
I tessuti congelati fissi sezionati su vetrini rivestiti di allume cromato subiscono fino a 3 cicli di IBEX standard seguiti da fino a tre cicli di RNAScope HiPlex, in cui il primo passaggio di recupero del bersaglio viene eseguito a 60°C per 1 ora. Le immagini di cicli separati vengono poi registrate e allineate utilizzando un marcatore fiduciale (ad esempio, DAPI) per creare un dataset multiplex per l'analisi a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Abbiamo utilizzato il protocollo descritto sopra per profilare il microambiente tumorale (TME) di un modello murino di adenocarcinoma dottale pancreas (PDAC ) (Figura 1). Una linea tumorale isolata da Kras^LSL-G12D/+; Trp53^L/+; Pdx1-Cre; I topi^{Rosa26 YFP/YFP} (KPCY), che sviluppano spontaneamente un cancro al pancreas e riproducono molte delle caratteristiche chiave del PDAC umano, sono stati iniettati sottocutaneamente nel fianco dei topi C57BL/6⁷. I topi tumorali sono stati poi trattati con immunoterapia combinata composta da ^anti-PD-1 (ovvero 200 μg•^topo-1, RMP1-14) e anti-CTLA-4 (i.p., 200 μg•^mouse-1, 9H10) somministrata al giorno 10 dopo l'impianto e proseguita ogni 3 giorni fino al termine dell'esperimento. L'anti-CD40 agonistico (pari esempio, 100 μg•^mouse-1, FGK45) è stato somministrato come dose singola al tredicesimo giorno dopo l'impianto. Insieme, ci riferiamo a questo come "FPC", come già pubblicato7,16. Tre tumori per gruppo sperimentale sono stati raccolti a 16 giorni dall'impianto e le sezioni congelate fisse sono state montate su vetrine rivestite di allume cromato per Bex-Plex.

Figura 2: Risultati rappresentativi IBEX + RNAscope (Bex-Plex).
(A) La colorazione combinata IBEX e RNAscope nelle sezioni tumorali di adenocarcinoma del pancreas (PDAC ) dimostra la co-rilevazione di bersagli proteici e RNA e l'allineamento dei canali di fluorescenza. Barra di scala, 10 μm. (B) Quantificazione dei compartimenti immunitari delle cellule T (CD3+ CD11b-), macrofagi (CD11b+ CD68+) e mieloidi (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) basata sull'intensità dei canali dei marcatori proteici. I grafici mostrano la densità cellulare media per ogni tipo cellulare per gruppo di trattamento, n=3 tumori. (C) Quantificazione delle cellule che esprimono il transscritto di Pdl1 e Il10 nei compartimenti immunitari precedentemente identificati dalla proteina. I grafici mostrano la densità cellulare media per gruppo di trattamento, n=3 tumori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un ciclo di colorazione proteica è stato eseguito su tre tumori trattati con FPC e tre tumori trattati con isotipo per valutare gli effetti sulle cellule della linea mieloide tra i gruppi di trattamento. Sono stati acquisiti sette parametri, ma qui ci concentriamo su tre marcatori di interesse: CD11b, Ly6G e CD68 (Figura 2A). Dopo l'acquisizione dell'immagine, i fluorofori derivanti dalla colorazione proteica sono stati sbiancati e un ciclo di RNAscopio è stato eseguito utilizzando sonde contro Il10 e Pdl1 (Figura 2A). Le immagini separate sono state poi allineate usando DAPI come fiduciario (Figura 2A). L'intensità media quantitativa di fluorescenza di CD11b, CD68, Ly6G e CD3 ha rivelato una tendenza a meno macrofagi e cellule mieloidi nei tumori trattati con FPC rispetto ai controlli (Figura 2B). Sono stati effettuati confronti quantitativi su tutti i campioni e i dati sono presentati come valori medi. Inoltre, il numero di cellule che esprimono Pdl1, Il10 o una combinazione di entrambi i trascrizioni sia nei compartimenti macrofagi che mieloidi ha mostrato una tendenza al ribasso con il trattamento FPC rispetto ai controlli (Figura 2C). Questi risultati indicano una possibile riduzione delle popolazioni cellulari immunosoppressive dopo il trattamento, coerente con le risposte biologiche attese.

Figura 3: Ottimizzazione delle condizioni di recupero del bersaglio per la conservazione nucleare.
(A) Immagine rappresentativa di un tessuto dopo il prelievo del bersaglio RT che mostra gonfiore nucleare e morfologia indistinta. Gli esempi di dimensioni nucleari sono indicati da contorni gialli. Barra di scala, 40 μm. (B) Immagine rappresentativa di un tessuto dopo il recupero modificato del bersaglio che mostra un miglioramento della morfologia nucleare con condizioni di temperatura regolabili. Esempi di dimensione nucleare indicati da contorni gialli. Barra di scala, 40 μm. (C) Volume nucleare medio determinato da segmentazione basata su DAPI su tessuti che hanno subito recupero del bersaglio RT (non preriscaldato), recupero del bersaglio preriscaldato a 60°C, o in condizioni standard di FI senza recupero del bersaglio. Le barre del grafico indicano la media e le barre di errore mostrano la deviazione standard. P < 0,0001 per ANOVA unidirezionale ordinaria (gli asterischi indicano la soglia di significatività statistica); n= 1639 celle per condizione. (D) Heatmap che rappresentano i punteggi di correlazione tra tre immagini prima e dopo l'allineamento dell'immagine. I punteggi di correlazione sono mostrati per una registrazione riuscita e una registrazione che non si è allineata a causa di differenze a livello nucleare.

È importante notare che, quando Bex-Plex è stato eseguito senza il recupero modificato del bersaglio descritto, i nuclei apparivano ingranditi con bordi indistinti rispetto ai nuclei di un tessuto in cui il prelievo modificato del bersaglio è stato eseguito correttamente (Figure 3A e B). L'uso del regente per il recupero del bersaglio a temperatura ambiente ha portato a un aumento del 33% del volume nucleare medio basato sulla colorazione DAPI rispetto al recupero del bersaglio effettuato con un reagente preriscaldato a 60°C (Figura 3°C). Le misurazioni del volume nucleare sono state ottenute da campi rappresentativi tra campioni utilizzando segmentazione basata su DAPI. Inoltre, quando questo passaggio è stato eseguito a 60°C utilizzando un reagente di prelievo preriscaldato, il volume medio nucleare non differiva significativamente dal volume medio dopo la colorazione standard con IF (Figura 3C). Poiché DAPI è il parametro più efficace da utilizzare come riferimento per l'allineamento dell'immagine, questo confronto (Figura 3) evidenzia l'importanza critica dei parametri di recupero modificati per preservare la morfologia nucleare. La corretta registrazione dell'immagine è indicata da un punteggio di correlazione di allineamento vicino a 1, indicando la somiglianza tra immagini di cicli diversi (Figura 3D, prima vs successo).

L'implementazione di successo del protocollo è indicata dalla morfologia nucleare preservata, dal segnale forte e specifico dell'RNA e dall'allineamento accurato dei canali proteici e RNA. Al contrario, esiti subottimali possono includere distorsione nucleare, segnale di RNA debole o diffuso e disallineamento tra cicli di imaging (Figura 3D, prima vs fallito). Come mostrato nella Figura 3C, la morfologia nucleare dovrebbe essere mantenuta per tutto il protocollo e sarà sia qualitativamente che quantitativamente evidente. Prima dell'implementazione di Bex-Plex, gli utenti dovrebbero accertare la verità fondamentale dei tessuti di interesse tramite colorazione separata di proteine e RNA. Questo non solo garantisce una colorazione ottimizzata di proteine e RNA per i tessuti target, ma fornisce anche schemi spaziali rilevanti che dovrebbero essere mantenuti quando combinati per il Bex-Plex. Ad esempio, CD11b colocalizza sia con CD68 che con Ly6G e mostra colorazione localizzata nella membrana cellulare (Figura 2A). Ciò è prevedibile, poiché CD11b è un marcatore delle cellule panmieloidi e CD68 e Ly6G sono marcatori per i sottogruppi macrofagi e mieloidi neutrofili. La rilevazione efficace dell'RNA è caratterizzata da segnali puntati distinti localizzati alle singole cellule, mentre risultati subottimali possono manifestarsi come colorazione debole o diffusa. Il segnale della sonda RNA dovrebbe mostrare localizzazione dentro e intorno al nucleo, a seconda della funzione del trascritto. Marcatori proteici strutturali come la vimentina potrebbero essere inclusi per migliorare la risoluzione cellulare della localizzazione dei trascrizioni rivelando membrane cellulari nei tessuti complessi. Si prevede che i campioni negativi o di controllo mostrino una colorazione di fondo minima e nessun segnale aspecifico della sonda, confermando la specificità sia della rilevazione di proteine che di RNA.

Discussion

Il flusso di lavoro Bex-Plex integra la piattaforma iterativa di colorazione proteica, IBEX, con l'ibridazione in situ di RNAscope per consentire la rilevazione simultanea di proteine e trascritti di RNA a risoluzione cellulare singola. L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire un metodo riproducibile per l'analisi spaziale integrata dell'espressione di proteine e RNA all'interno di tessuti intatti. La capacità di misurare sia l'espressione di proteine che di RNA nello stesso tessuto ha precedentemente presentato sfide tecniche: costi elevati, fasi complesse per il recupero dell'antigene, capacità multiplex limitata, limitazioni di risoluzione (non singola cellula), amplificazione non lineare del segnale e estese pipeline bioinformatiche per il processamento a ^{valle 17,18,19}. Rispetto ad approcci esistenti come l'immunofluorescenza multiplex, la colorazione OPAL/TSA e le piattaforme di trascrittomica spaziale, Bex-Plex consente una rilevazione simultanea riproducibile, quantitativa e ad alto plex preservando il contesto spaziale e la morfologia nucleare per un allineamento accurato dell'immagine. Inoltre, Bex-Plex può essere eseguito in un ambiente di laboratorio standard e genera dati a una risoluzione di singola cella che è semplice da elaborare. Sfruttare questo protocollo per acquisire una comprensione completa delle interazioni cellulare-cellula in diversi contesti tissutori, come nel microambiente tumorale, sarà essenziale per sviluppare immunoterapie più efficaci e migliorare gli esiti per i pazienti in diversi stati patologici.

Il nostro metodo viene eseguito su tessuti fissi incorporati in OCT e segue il flusso di lavoro standard IBEX senza modifiche, seguito da un protocollo RNAscope HiPlex leggermente modificato. Una differenza chiave è la fase di recupero del bersaglio all'inizio del flusso di lavoro di ibridazione dell'RNA: invece dei 99°C previsti dal produttore per 5 minuti, il prelievo viene eseguito a 60°C per 1 ora. Questa regolazione preserva l'architettura nucleare, fondamentale per un accurato allineamento delle immagini tra cicli di proteine e RNA. I passaggi critici di questo protocollo includono il mantenimento di una temperatura costante per il recupero del bersaglio, uno sbiancamento efficiente con fluorofori tramite LiBH₄ e la minimizzazione della degradazione dell'RNA tramite un rapido processo e l'uso di reagenti senza RNasi. È fondamentale garantire l'uso di reagenti di recupero del bersaglio preriscaldati a 60°C; Il mancato fatto può causare gonfiore nucleare anche con la fase di incubazione modificata.

Sebbene sia stato dimostrato che 15 minuti di incubazione con LiBH₄ siano sufficienti a inattivare molti fluorofori comunemente usati, si raccomanda verificare individualmente questo processo per ogni ciclo proteico prima di eseguire l'intero protocollo Bex-Plex. Nelle prime pubblicazioni IBEX è ben caratterizzato che non tutti i fluorofori compatibili con IBEX sono ugualmente^{sbiancabili 12}. Inoltre, il nostro laboratorio ha osservato che alcuni marcatori strutturali ad alta abbondanza come la vimentina possono richiedere un tempo di sbiancamento più lungo. Confermare che le combinazioni di fluoroferano e marcatori utilizzate sbiancano adeguatamente dovrebbe prevenire la fuoriuscita di segnali residui nei successivi cicli di proteine e RNA. La pagina della Comunità IBEX offre ottime risorse per la progettazione di pannelli compatibili con IBEX ed è specificamente pensata per ridurre il carico per i nuovi utenti indicando l'efficacia degli anticorpi e lo sbiancamento con fluorofori^{moltiplicati per 20}. Inoltre, la colorazione iterativa e lo sbiancamento non dovrebbero influire sulla qualità dei trascrizioni di RNA, tuttavia è importante completare i cicli proteici il più rapidamente possibile e utilizzare reagenti senza RNAsi per minimizzare eventuali degradazioni dell'RNA che possano verificarsi nel tempo. Il mancato fatto influenzerà l'ibridazione della sonda e porterà a una diminuzione del segnale per qualsiasi ciclo di RNAscopio eseguito, in particolare per i trascritti a bassa abbondanza. I problemi comuni riscontrati durante il protocollo includono segnale RNA debole, sbiancamento incompleto del fluoroforo e disallineamento tra i cicli di imaging, che possono essere mitigati ottimizzando le condizioni di colorazione e i parametri di imaging.

È fondamentale limitare il tempo trascorso tra la colorazione proteica e l'ibridazione con sonda a RNA a meno di 5 giorni. Quando si esegue Bex-Plex su più vetrine, è fortemente consigliato elaborare una vetrina alla volta per ridurre la variabilità nella degradazione dell'RNA. Allo stesso modo, limita il tempo tra l'ibridazione della sonda e l'imaging (imagining). Anche se abbiamo ripreso con successo fino a 3 giorni dopo l'amplificazione, non è consigliato una conservazione più lunga. Se il segnale si riduce dopo più cicli di colorazione o ibridazione, può essere necessario aumentare la velocità durante tutto il protocollo. Idealmente, consigliamo di lavorare il più rapidamente possibile, poiché i ritardi riducono l'integrità dell'RNA e possono diminuire l'amplificazione. Altri approcci includono la riduzione del numero di cicli proteici eseguiti per adattarli più facilmente ai vincoli temporali del protocollo o la modifica del design del pannello di sonda RNA per includere obiettivi di abbondanza più elevati. Prima di combinare IBEX e RNAscope, validare separatamente i pannelli di anticorpi e di sonda per ogni ciclo per determinare la qualità del segnale attesa per ciascun ciclo. In caso di gonfiore nucleare dopo il recupero del bersaglio, è possibile che il reagente di recupero del bersaglio non sia stato preriscaldato correttamente. Assicurarsi che il reagente di prelievo non si raffreddi una volta diluito e preriscaldato a 60^°C e che la temperatura rimanga costante durante l'incubazione sull'allevamento di 1 ora. Infine, se la registrazione e l'allineamento dell'immagine falliscono in assenza di gonfiore nucleare, significa che c'è stata una discrepanza nei parametri di acquisizione dell'immagine come la profondità del bit, la dimensione del voxel o la posizione Z tra i cicli. In caso di tali errori, potrebbe essere necessario ripetere il protocollo con modifiche a queste impostazioni affinché siano coerenti. Queste strategie di risoluzione dei problemi sono essenziali per garantire riproducibilità e coerenza tra gli esperimenti.

I dati generati da Bex-Plex permettono una visione approfondita del paesaggio spaziale dei tessuti a un livello precedentemente irraggiungibile. Tuttavia, una delle principali limitazioni di questo protocollo è il fatto che il numero totale di cicli iterativi proteici possibili è inferiore rispetto a IBEX da solo, a causa della graduale degradazione dell'RNA nel tempo. Sebbene siano stati eseguiti fino a 6 cicli di IBEX standard, non raccomandiamo di superare i 3 cicli di colorazione proteica per Bex-Plex. Tuttavia, il protocollo consente il massimo numero di cicli RNAscope e questo livello di profondità multiplex è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni.

Ulteriori limitazioni includono la variabilità tra i tipi di tessuto e la potenziale autofluorescenza o artefatti di colorazione che possono influenzare l'interpretazione del segnale. I tessuti più fragili possono sostenere meno cicli e diversi tipi di tessuto possono avere caratteristiche uniche che influenzano la colorazione. Queste limitazioni possono essere valutate tramite colorazioni a ciclo singolo di proteine o RNA e affrontate prima dell'esecuzione di Bex-Plex. La sezionazione su vetrini rivestiti di allume cromato migliora notevolmente l'adesione dei tessuti e l'integrità strutturale, ma l'autofluorescenza è una considerazione per tutte le tecniche basate sull'immunofluorescenza. Inoltre, attualmente il protocollo non è stato validato in FFPE o campioni clinici umani e richiederà ulteriori ottimizzazioni per tali applicazioni. Tuttavia, dato che IBEX e RNAscope vengono eseguiti prevalentemente su tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE), è fattibile che Bex-Plex possa espandersi a questi tipi di campioni. Un'implementazione di successo richiederà ulteriori ottimizzazioni del recupero dell'antigene e, potenzialmente, dei passaggi di prelievo bersaglio per preservare la qualità dell'RNA.

Nel complesso, Bex-Plex offre un metodo diretto, economico e ampiamente accessibile per analisi spaziali ad alto complesso. Questo metodo è particolarmente adatto per applicazioni come l'analisi del microambiente tumorale, il profiling delle cellule immunitarie e la mappatura spaziale delle interazioni di segnalazione. Questa visione integrata potenzia la capacità di interrogare i meccanismi di regolazione immunitaria, eterogeneità tumorale e reattività terapeutica in una vasta gamma di modelli sperimentali. Bex-Plex sarà preziosissimo nei contesti in cui è necessario studiare la diafonia che si verifica tra cellule in tessuti intatti, come nel microambiente tumorale o in altri tessuti durante l'infiammazione e l'omeostasi. In particolare, la capacità di risolvere la dinamica spaziale della segnalazione delle citochine sondando i trascriverti di molecole di breve durata insieme a marcatori fenotipici delle proteine fornirà una comprensione più profonda delle interazioni cellulari tra stati patologici. I miglioramenti futuri potrebbero includere l'aumento della capacità multiplex, l'integrazione con pipeline di analisi automatica delle immagini e l'adattamento per i campioni di biopsia clinica ampliando il flusso di lavoro per includere i tessuti FFPE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023