Method Article

Un modello di lesione da ipossia-reossigenazione in cardioidi umani autoassemblanti

DOI:

10.3791/70310

⸱

March 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli organoidi cardiaci umani autoassemblanti (hCO) sono un sistema emergente per modellare lo sviluppo e le malattie cardiache umane. Qui viene fornita una metodologia per generare e danneggiare gli hCOs con ipossia-reoxygenazione e dettagli sugli esiti istologici e funzionali attesi dopo l'infortunio.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Senza una rapida rivascolarizzazione, la cardiopatia ischemica porta a una perdita irreversibile di cardiomiociti, formazione di cicatrici e riduzione della funzione cardiaca. La capacità di modellare lesioni da ipossia-reossigenazione e valutare potenziali interventi terapeutici nei tessuti umani è un bisogno insoddisfatto. Gli organoidi cardiaci umani (hCO) sono un sistema modello emergente, ma iniziare a lavorare con gli hCOs può essere difficile a causa delle loro dimensioni ridotte, dei requisiti per la coltura in sospensione e della variabilità nell'efficienza della differenziazione. Questo protocollo offre una guida intuitiva per generare e mantenere hCOs autoassemblanti derivati dall'iPSC umano; metodi per elaborare e analizzare istologicamente gli hCO; e un approccio per danneggiare gli hCOs con ipossia-reossigenazione che imita la fibrosi e l'apoptosi osservate nell'ischemia/reperfusione umana. Questo protocollo fornisce indicazioni per l'uso degli hCOs come complemento ai modelli animali di lesione ischemia-reperfusione e potrebbe essere utilizzato per identificare e testare fattori che potrebbero favorire il recupero miocardico umano.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cardiopatia ischemica è una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale, colpendo almeno 20,5 milioni di persone solo negli StatiUniti 1, 2, 3. Senza un'adeguata perfusione, l'ipossia prolungata provoca la morte dei cardiomiociti (MC) e una disfunzione miocardica. L'ischemia miocardica viene trattata principalmente con la rivascolarizzazione tramite intervento percutaneo, terapia trombolitica o bypass coronarico. Tuttavia, la rivascolarizzazione è un'arma a doppio taglio e può causare ulteriori lesioni tramite il rilascio di specie reattive diossigeno 4,5. Sebbene le strategie di reperfusione siano state estremamente efficaci, gli approcci per limitare la perdita di muco cervicale durante insulti ischemici o dopo la reperfusione sono stati più sfuggenti. Sebbene molti tentativi di recuperare tessuto infartizzato si rivelano efficaci nei modelli animali di ischemia-reperfusione, queste stesse terapie non sono in gran parte riuscite a ottenere benefici significativi negli studi sull'uomo, sollevando la necessità che i modelli umani valutino terapie che risparmiano o rigeneranola CM 6,7,8,9,10,11,12.

Le piattaforme umane utilizzate per modellare la lesione cardiaca includono tessuti primari e sistemi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) 13,14. Poiché i tessuti primari sono vincolati dalla disponibilità di campioni, i sistemi hiPSC sono emersi come la piattaforma umana dominante per la modellizzazione delle malattie cardiache, con i vantaggi distintivi di essere geneticamente trattabili escalabili 15,16,17,18,19. Le colture tradizionali di cardiomiociti derivati da hiPSC (hiPSC-CM) in 2D sono limitate dall'immaturità dei CM risultanti, dall'assenza di un'architettura tissutale complessa e dall'incapacità di riprodurre l'intera diversità cellulare presente nel cuoreumano 15,20. Per affrontare queste carenze, i tessuti cardiaci 3D ingegnerizzati (EHT) sono stati sempre più adottati 20,21,22,23,24,25,26. Gli approcci EHT includono la miscelazione di cellule cardiache pre-differenziate insferoidi 24 o la semina di cellule cardiache differenziate in impalcature ostampi 21,22,27. Sebbene gli EHT possano modellare meglio le interazioni cellulari eterotipiche e abbiano una maturità relativamente maggiore rispetto alle colture 2D, i requisiti per impalcature personalizzate o bioreattori per creare e mantenere EHT attualmente ne limitano la scalabilità 21,27,28.

Gli organoidi cardiaci autoassemblanti (hCO), o cardioidi, sono un nuovo e potente sistema modello umano in vitro 20,25,26,29. Gli hCOs hanno diversi vantaggi. Innanzitutto, possono includere più tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali, fibroblasti ed epicardici, senza la necessità di più protocolli di differenziazionespecializzati 26,29,30. In secondo luogo, la maggior parte della loro differenziazione avviene nella coltura a sospensione 3D, rendendo necessarie le necessità di stampi specializzati o matricetissutale 25,26,29,30. Infine, gli hCOs presentano una morfologia sferica stereotipata con una cavità centrale, che consente analisi morfologiche. Pertanto, gli hCOs hanno una scalabilità simile ai sistemi di coltura 2D mantenendo però parte della complessità tissutale degli EHT. Gli hCOs sono stati utilizzati per test di tossicità da farmaci, modellazione specifica di malattie per pazienti e per modellare aspetti dello sviluppocardiaco 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39 . Pur essendo promettenti, gli hCOs presentano diverse limitazioni rispetto agli EHT, tra cui l'impossibilità di misurare direttamente la forza di emissione. Inoltre, non esiste una popolazione immunitaria autoctona nei modelli descritti di hCO, anche se è possibile popolare gli hCOs con macrofagi. Tuttavia, gli hCOs sono un sistema modello umano emergente e in rapidaevoluzione 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Ad oggi, la modellazione della lesione cardiaca con gli hCOs è stata limitata. È stato descritto un modello di criolesione, ma le lesioni sono altamente variabili e la necessità di ferire individualmente gli hCOs limita lascalabilità 29. Questo manoscritto descrive un protocollo facile da usare per generare e danneggiare hCOs autoassemblanti con lesioni da ipossia-reoxygenazione (H/R). Rispetto ad altri protocolli per la generazione degli hCO, questo protocollo utilizza un mezzo di differenziazione semplificato e incorpora la strategia di differenziazione del mesoderma 2D-3D descritta da Hofbauer et al.29. Il protocollo per la lesione H/R può essere eseguito in qualsiasi momento dopo che gli hCOs iniziano a battere, che tipicamente avviene intorno al giorno di differenziazione 8 (D8) a D11. La durata H/R può essere calibrata tra 6 e 24 ore per raggiungere il livello desiderato di lesione, che va da una perdita minima a quasi totale di muco cervicale. Inoltre, gli hCOs sviluppano stereotipicamente un nucleo collageno con cellule Vimentin+ dopo una lesione H/R, che aumenta in gravità con la durata H/R. Questo modello hCO ad alto rendimento e scalabile delle lesioni H/R potenzialmente risponde alla necessità che i modelli umani sviluppino e testino nuove vie terapeutiche per promuovere il recupero o la rigenerazione della CM dopo l'infortunio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure per la gestione delle linee cellulari umane devono seguire i protocolli locali di biosicurezza. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando la linea cellulare iPSC DU11, derivata da fibroblasti maschili neonati sani presso la struttura centrale iPSC della Duke University.

1. Generazione di hCOs

NOTA: Questa sezione descrive un protocollo standard per generare hCOs dagli iPSC (Figura 1). Tutti i passaggi dettagliati in questo protocollo devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità. Consulta la Tabella 1 per le ricette dei mezzi di differenziazione.

DayConcentrazione di stockConcentrazione operativaFattore di diluizioneBase Media
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000RPMI-1640, 2% di B27 meno insulina
100 mg/mL di acido ascorbico50 μg/mL di acido ascorbico1:2000
10 mg/mL di Activina A60 ng/mL di Activina A1:167
D15 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% di B27 meno insulina
100 mg/mL di acido ascorbico50 μg/mL di acido ascorbico1:2000
D25 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% di B27 meno insulina
100 mg/mL di acido ascorbico50 μg/mL di acido ascorbico1:2000
10 mM Thiazovivin2 μM Tiazovivina1:5000
D35 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% di B27 meno insulina
100 mg/mL di acido ascorbico50 μg/mL di acido ascorbico1:2000
D45mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% di B27 meno insulina
D6+N/AN/ARPMI-1640, 2% di B27 più insulina

Tabella 1: Tabella dei media di differenziazione. Concentrazioni di stock, concentrazioni di lavoro e fattore di diluizione per ciascun fattore di differenziazione fino ai giorni di differenziazione 0-6. Prepara tutte le soluzioni operative fresche al momento dell'alimentazione.

figure-protocol-1
Figura 1: Schema della differenziazione hCO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Manutenzione iPSC
    1. Copri completamente il fondo di ogni pozzo di una piastra a 12 pozzi con matrice a membrana basale in un rapporto 1:100, diluito in mezzo freddo DMEM/F12. Incubare le piastre trattate a 37 °C per 1 ora per permettere la polimerizzazione. Se non viene usata immediatamente, le piastre possono essere sigillate con una pellicola e conservate a 4 °C per fino a 2 settimane e incubate per almeno 60 minuti a 37 °C prima dell'uso.
  2. Giorno di differenziazione -3 (D-3): placcatura degli iPSC per la differenziazione successiva
    1. Preparare le piastre rivestite con matrice della membrana basale come descritto nel passo 1.1.1.
    2. Aspirare il materiale di mantenimento dalla coltura iPSC e aggiungere una soluzione sufficiente di distacco cellulare per coprire completamente le celle (~500 μL per pozzo di una piastra a 12 pozzi o 1 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzi). Incubare a 37 °C per 5 minuti.
    3. Aggiungi un volume uguale di mezzo di manutenzione iPSC in ogni pozzo e tocca delicatamente la piastra per aiutare a staccare le cellule. Inclina la piastra verso te e pipetta delicatamente su e giù sul fondo del pozzo per staccare ulteriormente le cellule aderenti, non più di 3 volte. Usa una pipetta per spostare la sospensione della cella su un tubo conico da 15 mL.
    4. Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente in una centrifuga a secchio oscillante. Aspirare il soprandanante e risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di mezzo di mantenimento iPSC.
    5. Sposta 10 μL della sospensione della cella su un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 10 μL di Trypan Blue e pipetta per mescolare. Aggiungi 10 μL della miscela iPSC/Trypan blu all'emocitometro e conteggi le cellule vive.
    6. Diluire la sospensione cellulare fino a una concentrazione finale di 100.000-200.000 cellule/mL in mezzi di mantenimento iPSC con inibitore ROCK (ROCKi). Aggiungere 1 mL/pozzo della sospensione della cella a ciascun pozzo di una piastra a 12 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale.
      NOTA: La densità di placcatura prima della differenziazione dipende dal tasso di crescita di una determinata linea cellulare. La densità di placcatura potrebbe dover essere regolata per ciascuna linea iPSC. La concentrazione di ROCKi potrebbe dover essere calibrata a seconda della marca/formulazione utilizzata.
  3. Differenziazione D-2: Scambio di media per rimuovere ROCKi
    1. Sostituisci il supporto con 1 mL di nuovo supporto di manutenzione iPSC, senza ROCKi. Le cellule dovrebbero iniziare a formare piccole colonie. Le colonie dovrebbero apparire piatte (Figura 2A). Se le cellule sembrano simili a ciottoli, snelle o allungate, questo è un segno di differenziazione spontanea e l'efficienza della differenziazione può essere influenzata.
  4. Differenziazione D-1: Continuare a incubare le cellule senza trattamento.
  5. Differenziazione D0: Inizio della differenziazione e induzione del mesoderma
    1. Utilizzando un microscopio, si verifica la densità cellulare per garantire una confluenza del 70%-90% (Figura 2B) al momento della differenziazione. Se sub-confluente, alimenta le cellule con un mezzo di manutenzione iPSC e attendi 24 ore. Se le celle sono troppo confluenti, dividere le celle come nel passo 1.2
    2. Preparare 12 mL per ogni piastra a 12 pozzi di mezzo indutivo mesodermico D0 (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL di acido ascorbico, 60 ng/mL di activina A in RPMI-1640 con integratore B27 al 2% meno insulina (RB-)).
    3. Rimuovere il materiale esistente e sostituirlo con 1 mL/pozzo di mezzo di induzione mesodermica D0. Nota il periodo dello scambio mediatico.
  6. Differenziazione D1: Specificazione del mesoderma cardiaco
    1. Esattamente 24 ore dopo l'aggiunta del mezzo di induzione del mesoderma D0, sostituire il mezzo con il mezzo di specificazione del mesoderma cardiaco D1 (5 μM IWP2, 50 μg/mL di acido ascorbico in RB).
  7. Differenziazione D2: formazione hCO
    1. Aggiungere abbastanza reagente di dissociazione cellulare per coprire le cellule e incubare a 37 °C per 5 minuti (Figura 2C). Aggiungi un volume uguale di mezzo mesodermico cardiaco D2 in ciascun pozzo e pipetta delicatamente su e giù per liberare le cellule aderenti. Trasferire la sospensione della cella su un tubo conico da 15 mL.
    2. Cellule pellet centrifugate a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Risospendere in 1 mL di mezzo di specificazione cardiaca D2 (5 μM IWP2, 50 μg/mL di acido ascorbico in RB-).
    3. Prendi 10 μL della sospensione della cella e aggiungi 10 μL di blu di Trypan. Conta le cellule con qualsiasi metodo preferito. Diluire le cellule a una concentrazione di 100.000 cellule/mL in mezzo di specificazione cardiaca D2, con 2 μM di tiazovivina. Usa 10 mL di sospensione a celle per ogni piastra di attacco ultra-bassa a 96 pozzi.
    4. Trasferire la sospensione della cella a un serbatoio di reagente di dimensioni adeguate e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 100 μL a ciascun pozzo di una piastra di 96 pozzi a attacco ultra-basso, per una concentrazione finale di 10.000 celle/pozzo.
    5. Per indurre la formazione di hCO in coltura a sospensione, centrifugare le piastre a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, ci sarà un grande pellet di celle (Figura 2D) - se questo pellet non è circoscritto, si ripeterà la centrifugazione.
      NOTA: Non tutte le cellule si incorporeranno nell'hCO, che apparirà come una pellet cellulare circoscritta, con le singole cellule visibili alla microscopia a campo chiaro. Alcuni detriti di singola cellula nella piastra che circonda l'hCO sono normali.
  8. Differenziazione D3: Aggiunta di supporti per diluire ROCKi
    1. Prepara 10 mL di mezzo D3 (5 μM IWP2, 50 μg/mL di acido ascorbico in RB-) per piastra elettrica. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungi 100 μL di mezzo D3 a ciascun pozzo, senza rimuovere alcun substrato.
      NOTA: A questo punto, gli hCOs si saranno condensati in uno sferoide scuro e ben circonscrito. Le singole cellule non saranno visibili (Figura 2E).
  9. Differenziazione D4: Scambio con media D4
    1. Rimuovere 100 μL di mezzo D3 e sostituire con 100 μL di mezzo D4 (5 μM IWP2 in RB-). Per ridurre il rischio di aspirazione, inclina la piastra verso di te a un angolo di circa 45° e tieni una pipetta multicanale a un angolo di circa 90° rispetto alla parete laterale della placca. Posizionare la pipetta multicanale saldamente sulla parete laterale del pozzo e aspirare lentamente 100 μL di mezzo, controllando intermittentemente le punte della pipetta per la presenza di hCOs aspirati.
      NOTA: gli hCOs sono in coltura a sospensione, e l'aspirazione degli hCOs durante la rimozione del substrato è comune. Per ridurre il rischio di aspirazione, inclina la piastra verso te a un angolo di circa 45° e tieni una pipetta multicanale a circa 90° rispetto alla parete laterale della placca. Posizionare la pipetta multicanale saldamente sulla parete laterale del pozzo e aspirare lentamente 100 μL di mezzo, controllando intermittentemente le punte della pipetta per la presenza di hCOs aspirati.
    2. Sostituisci con 100 μL di mezzo D4.
  10. Differenziazione D6: mezzo di manutenzione hCO
    1. Rimuovere 100 μL del mezzo D4 e sostituirlo con 100 μL di mezzo D6+ (RPMI-1640 con supplemento B27 al 2% (RB+)).
  11. Differenziazione D8
    1. Continuare a scambiare il substrato ogni 2 giorni rimuovendo 100 μL e sostituendolo con 100 μL di mezzo D6+ fresco. Gli hCOs dovrebbero crescere, mantenere i bordi lisci e iniziare a battere intorno a D6-11 se differenziati con successo (Figura 2F). Gli hCOs appariranno comunque come sferidi scuri e ben circonscritti, e le singole cellule non saranno visibili.

figure-protocol-2
Figura 2: Cronologia della differenziazione dell'hCO. Cronologia della differenziazione degli organoidi. (A) Colonie di iPSC 1 giorno prima dell'inizio della differenziazione (D-1). Si noti colonie distinte e di aspetto piatto. (B) iPSC al giorno dell'inizio della differenziazione (D0) a ~90% di confluenza. (C) Organoide alla differenziazione D2 immediatamente dopo la formazione dell'organoide in una piastra di attacco ultra-bassa a 96 pozzi. La freccia indica un esempio di cristalli IWP2 a forma di ago. (D) Organoidi alla differenziazione D3. Si noti una significativa compattazione organoide dovuta alla formazione di giunzioni cellula-cellula; Alcuni detriti cellulari non incorporati sono normali a questo stadio. (E) Organoidi alla differenziazione D10. (F) La freccia indica la colonia di iPSC con cellule allungate e snelle con aspetto di ciottoli, indicando una potenziale differenziazione spontanea. Barra di scala = 1000 μm per i pannelli A-E, barra di scala = 400 μm per il pannello F. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Raccolta e fissazione degli hCOs per l'immunocolorazione

  1. Utilizzando una pipetta da 1000 μL con la punta tagliata, trasferisci gli hCOs in un tubo microcentrifuga da 1,7 mL. Una volta trasferiti tutti gli hCO, attendi che gli hCOs scendano sul fondo del tubo e rimuovi delicatamente il substrato in eccesso. Lava gli hCOs 1 volta con PBS, aspetta qualche secondo che gli hCOs scendano sul fondo del tubo e rimuovi delicatamente l'eccesso di PBS.
  2. Fissa gli hCOs con il 4% di PFA per 30 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Alcuni anticorpi potrebbero richiedere la fissazione di acetone o metanolo per prestazioni ottimali. Consulta le linee guida del produttore.

3. Immunocolorazione a montaggio intero

  1. Trasferire il numero desiderato di hCOs fissi su un tubo microcentrifuga da 1,7 mL. Rimuovere la soluzione fissativa e lavare con PBS contenente 0,1% Tween-20 (PBS-T).
    1. Per lavare gli hCO, rimuovi quanta più quantità possibile di fissativo in eccesso. Fai attenzione a non disturbare gli hCOs sul fondo del tubo. Aggiungi ~1 mL di PBS-T e aspetta qualche secondo che gli hCOs scendano sul fondo del tubo prima di passare al passo successivo.
  2. Diluire l'anticorpo primario fino a una concentrazione desiderata nella soluzione di colorazione (10% siero neonatale per vitelli, 1% DMSO nello 0,1% PBS-T). Aggiungi 50-100 μL di soluzione primaria di anticorpi per tubo microcentrifuga (o abbastanza volume da coprire tutti gli hCOs in ogni provetta).
  3. Incubare per 24 ore a 4 °C su uno shaker/rocker. Rimuovere l'eccesso di anticorpi primari e poi eseguire tre lavaggi di 1 ora in PBS-T a temperatura ambiente. Eseguire un lavaggio finale durante la notte in PBS-T a 4 °C per assicurarsi che venga rimosso qualsiasi eccesso di anticorpi.
  4. Diluire l'anticorpo secondario fino a una concentrazione desiderata nella soluzione di colorazione e aggiungere 50-100 μL di soluzione di anticorpi per tubo della microcentrifuga (o un volume sufficiente a coprire tutti gli hCOs in ogni provetta).
  5. Incubare gli hCOs con l'anticorpo secondario per 24 ore a 4 °C su una piattaforma di scuote. Rimuovere l'eccesso di anticorpi secondari e poi eseguire tre lavaggi di 1 ora in PBS-T a temperatura ambiente. Esegui un lavaggio finale durante la notte in PBS-T a 4 °C per assicurarti che tutti gli anticorpi in eccesso vengano rimossi.
  6. Per l'imaging a montaggio completo, trasferire gli hCOs utilizzando una pipetta da 1000 μL con la punta tagliata su una vetrata di vetro caricata positivamente. Rimuovere l'eccesso di PBS-T e aggiungere qualche goccia di supporto per coprire gli hCO. Posiziona con cura un scartuccio per appiattire gli hCO.
    NOTA: Per preservare l'architettura 3D dell'hCO, usa una guarnizione in gomma o un nastro a doppia faccia intorno ai bordi della slitta per aumentare l'altezza dello scorrimento del coperchio. L'uso di un mezzo di montaggio per la pulizia può essere utile per migliorare l'imaging attraverso l'hCO, specialmente se gli hCOs non sono appiattiti.

4. Sezionamento e incassamento

  1. Dopo la fissazione, coprire gli hCOs con il 30% di saccarosio durante la notte a 4 °C per la crioprotezione. Utilizzando una pipetta da 1000 μL con la punta tagliata, trasferisci il numero desiderato di hCOs in uno stampo di plastica da 12 mm x 12 mm. Rimuovere con attenzione l'eccesso di soluzione di saccarosio, facendo attenzione a non aspirare gli hCO.
    NOTA: È utile pipettare il 30% di saccarosio su e giù nella punta prima di trasferire per evitare che gli hCOs si attacchino ai lati della punta.
  2. Aggiungi una piccola goccia di OCT, giusto il necessario per coprire gli hCO. Usando una pinzetta fine o una punta di pipetta, riposiziona delicatamente gli hCOs in OCT in modo che gli hCOs non si raggruppino e nessun hCO sia vicino ai bordi dello stampo. Assicurati che tutti gli hCOs siano il più possibile vicino al fondo dello stampo con l'obiettivo di massimizzare il numero di hCOs presenti in una singola criosezione.
  3. Congela questo primo strato di OCT mettendo lo stampo in un frigorifero in polistirolo con uno strato di ghiaccio secco sul fondo. Aspetta qualche minuto che l'OCT si indurisca e poi sposta la muffa dal ghiaccio secco al piano di lavoro. Aggiungi ulteriore OCT finché lo stampo non è riempito. Aspetta che il primo strato di OCT si scioglia completamente prima di tornare al ghiaccio secco.
  4. Conserva gli hCOs congelati e incorporati a -80 °C fino a quando non sono pronti per la criosezione.
  5. Quando sei pronto per la sezione, allinea il blocco hCO al meglio possibile e inizia a rifilare il blocco. Posizionare periodicamente una sezione su una slide carica e ispezionare visivamente ogni sezione per gli hCO. Quando si visualizzano gli hCO, si passa a sezioni da 6 μm.
    NOTA: Il tasso di attrito degli hCOs durante l'incorporamento e la sezionamento è di almeno il 10%. Pianifica di conseguenza.

5. Sezioni TUNEL e immunocolorazione dei tessuti

  1. Usa una penna pap per disegnare un bordo idrofobo intorno alle sezioni di tessuto che devono essere colorate. Il lavaggio si scorre una volta in PBS 0,1% Tween (PBS-T) per dissolvere l'OCT.
  2. Aggiungi il tampone bloccante (10% siero neonatale per vitelli, 1% DMSO, in PBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente.
  3. Prepara la soluzione primaria degli anticorpi. Si inizia con la concentrazione raccomandata dal produttore per l'immunofluorescenza, ma la concentrazione potrebbe dover essere titolata empiricamente.
    NOTA: In alternativa, la colorazione TUNEL può essere eseguita in questo momento seguendo il protocollo del produttore.
  4. Rimuovi il buffer bloccante dalla slitta. Aggiungi abbastanza soluzione primaria per anticorpi per coprire le sezioni di hCO. Incubare l'anticorpo primario durante la notte a 4 °C o 3 ore a 37 °C. Lavare le vetri 3 volte per 5 minuti ciascuna in un barattolo Coplin riempito di PBS-T a temperatura ambiente.
  5. Prepara una soluzione secondaria di colorazione per anticorpi in un tampone bloccante, incluso DAPI o un altro marcatore pan-nucleare. Aggiungi abbastanza soluzione secondaria per colorare gli anticorpi per coprire le sezioni di hCO. Incubare protetto dalla luce per 1 ora a temperatura ambiente.
  6. Lava i vetri 3 volte per 5 minuti in un barattolo Coplin pieno di PBS-T a temperatura ambiente. Montare con un sottile coperto con il supporto desiderato.

6. Quantificazione della localizzazione nucleare con CardioCount

NOTA: CardioCount è un metodo basato sul deep learning per valutare i nuclei del CM da immaginimicroscopiche 40. Originariamente sviluppato per valutare il ciclo del CM, CardioCount si comporta bene per più colorazioni nucleari, incluso TUNEL40.

  1. Per usare CardioCount, scarica il pacchetto CardioCount da GitHub o importalo su Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount Versione 1 funziona su un ambiente Python 3.
  2. Esportare immagini per quantificazione come singoli file .tif 512 x 512 pixel con canali rossi, blu e verdi uniti, dove il canale rosso è un marcatore nucleare CM, il blu un marcatore nucleare generale e il verde un marcatore nucleare ciclico (ad esempio Ki67) o un marcatore apoptotico (ad esempio, TUNEL). Crea una cartella genitore su Google Drive per questo esperimento e carica i tiff uniti come sottocartella.
    NOTA: CardioCount è stato allenato su colorazioni nucleari che riempiono il nucleo. I marker ciclistici più puntiati, come Aurora B o PH3, potrebbero non essere compatibili con CardioCount.
  3. Apri il taccuino CardioCount su Google CoLab. Esegui Cell 1.1 per verificare l'accesso all'unità di elaborazione grafica (GPU). Esegui Cell 1.2 per collegare CoLab Notebook a Google Drive.
  4. Esegui Cell 1.3 per caricare CardioCount e Dipendenze su Google Colab. Modifica kfile per leggere il nome del percorso dove la cartella PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries è stata salvata al momento del download.
  5. Nella Cell 2.0, modifica base_folder per leggere il nome del percorso della cartella genitore che contiene la sottocartella delle immagini da analizzare. Esegui Cell 2.0 per collegare questa cartella a CoLab.
  6. Nella Cella 2.1.1, modifica orig_image_folder per farlo corrispondere al nome della cartella contenente immagini per l'analisi. Modifica channel_to_remove per leggere il verde e modifica new_image_folder per nominare la sottocartella sotto base_folder dove tutte le immagini con il canale verde rimosso (rosso/blu) verranno salvate. Ripeti questo passaggio per rimuovere il canale rosso, assicurandoti di modificare new_image_folder per distinguere la sottocartella che contiene immagini con il canale rosso rimosso (verde/blu).
  7. Nella cella 2.1.2, ritaglia le immagini a 512 x 512 per le immagini rosse/blu. Assicurati che il uncropped_image_folder corrisponda al nome new_image_folder creato nel passo 6.6. Per immagini rosse/blu. Nomina destination_image_folder per designare la sottocartella dove verranno salvate le immagini ritagliate, rosso/blu. Ripeti questo passaggio per ritagliare le immagini verdi/blu. Infine, ripeti questo passaggio per ritagliare i tiff originali a 3 canali fusi alloggiati in base_folder.
  8. Esegui la Cella 2.2 per generare mappe di probabilità. Il nome data_specific_folder il nome delle immagini rosse/blu e verde/blu generate in destination_image_folder dalla Cella 2.1.2. Per model_dir, inserisci il percorso del file verso una cartella che contiene modelli di segmentazione. Per segmentare i nuclei rossi, usa il modello erg_rb_opt e inserisci 200 per l'epoca. Rinomina probmap_directory_name per designare la cartella dove verranno salvate le mappe di probabilità rosse/blu. Ripeti questo passaggio per le immagini verde/blu. Per segmentare i nuclei verdi, usa il modello edu_mouse_bg_opt e inserisci 100 per l'epoca.
  9. Nella Cella 2.3.1, le mappe degli oggetti saranno create sulla base delle mappe di probabilità generate nel passo 6.8. Il input_folder prenderà il nome dalla destination_image_folder della Cella 2.1.2 che contiene immagini della mappa di probabilità rossa/blu generate nella Cella 2.1.2. Nomina le output_folder dove verranno memorizzate le immagini rosse/blu con soglia limitate. Stabilire la soglia per il livello di fiducia per la segmentazione nucleare (intervallo 0,0-1,0). Run Cell 2.3.1. Ripeti questo passaggio per le immagini verde/blu.
    NOTA: Le soglie per il livello di fiducia nei nuclei dipendono dal dataset. Inizia con una soglia di 0,9 e aggiusta più in alto se troppo permissiva e più in basso se troppo severa, basandosi sull'ispezione casuale delle mappe di probabilità.
  10. Nella Cell 2.3.2, il numero di celle nelle object map generate nel passo 6.10 verrà conteggiato ed esportato in un file .csv. Il count_folder prenderà il nome dalla output_folder della Cella 2.3.1, dove vengono salvate le immagini rosse/blu con soglia limitate. Per escludere oggetti che toccano il bordo di un'immagine, assicurati che ignore_border_cells legga Vero. Rinomina csv_path con il nome del percorso del base_folder dove sono memorizzate tutte le sottocartelle. Modifica il nome del csv per riflettere i conteggi degli oggetti rossi/blu. Ripeti questo passaggio per immagini blu/verde.
  11. Nella Cellula 2.4, verranno conteggiati i nuclei doppi positivi verdi/rossi. Rinomina img_folder con il nome della sottocartella generata nel passo 6.8 che contiene immagini ritagliate a 3 canali. Rinomina childcell_folder alla output_folder dalla Cella 2.3.1, dove vengono salvate le immagini rosso/blu con soglia limitate. Rinomina parentcell_folder in output_folder dalla Cella 2.3.1, dove vengono salvate le immagini verdi/blu con soglia limitate. Rinomina dest_folder per designare la cartella dove verranno salvate le doppie mappe di oggetti positivi. Rinomina csv_path per designare il nome del percorso e il nome del file nel base_folder dove sono memorizzati tutti i sottocartelli e modifica il nome csv per riflettere i conteggi degli oggetti doppi positivi.
  12. Verifica la segmentazione accurata confrontando i conteggi rossi, verdi e doppi positivi generati per immagine con l'immagine grezza.
    1. Se CardioCount sovrastima costantemente il numero di nuclei in un'immagine rispetto a ciò che un revisore cieco conterebbe, ripeti il passo 6.9 con una soglia di fiducia più alta e ripeti i passaggi 6.10-6.11. Se CardioCount sottostima il numero di nuclei in un'immagine rispetto a ciò che un revisore accecato, ripeti lo step 6.9 con una soglia di confidenza più bassa e ripeti i passaggi 6.10-6.11.
  13. Sommare tutti i conteggi per ogni hCO per nuclei rossi, verdi e nuclei doppiamente positivi. Calcola la percentuale di nuclei ciclici come (nuclei doppiamente positivi / nuclei rossi totali di CM) x 100 per ogni organoide.

7. Lesione da ipossia-reossigenazione

  1. Prepara media per l'ipossia (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1,2 mMNaH 2PO4, 1,3 mMMgSO 4, 0,5 mMMgCl 2, 0,9 mMCaCl 2, 20 mM lattato di sodio e 5 mM HEPES, pH = 6,4)5.
  2. A una fiaschetta di coltura cellulare, trasferire 5 mL di mezzo per ipossia per piastra di hCO a 96 pozzi. Posiziona la fiaschetta di coltura cellulare all'interno della camera dell'ipossia e risciacqua con gas ossico (5% CO2, 95%N2) per 3 minuti. Incubare a 37 °C per almeno 1 ora prima di iniziare l'ipossia.
  3. Rimuovere tutti i materiali dagli hCO. Inizia rimuovendo ~150 μL con una pipetta multicanale da tutti i pozzi. Poi, si utilizza una pipetta da 200 μL per rimuovere con cura il materiale residuo dai singoli pozzi, senza disturbare gli hCO.
    NOTA: La rimozione di tutti i mezzi da tutti i pozzi è fondamentale per ottenere danni riproducibili.
  4. Aggiungi 50 μL di mezzo ipossico in ciascun pozzo. Posiziona la piastra hCO nella camera dell'ipossia e risciacqua con gas anosico (5% CO2, 95%N 2) per 3 minuti. Posizionare la camera dell'ipossia nell'incubatrice a 37 °C per 6 ore.
  5. Per avviare la riossigenazione, rimuovere gli hCOs dalla camera di ipossia e nutrire con 150 μL di mezzo RB+ preriscaldato. Lascia almeno 3 ore di reossigenazione a 37 °C prima di eseguire i test a valle.

8. Saggio di rilascio del lattato deidrogenasi

  1. Raccogliere 20 μL di substrato da pozzi di hCOs danneggiati e non danneggiati nel momento desiderato dopo aver avviato la reperfusione. Diluire 1:10 in 180 μL di buffer di stoccaggio LDH (200 mM Tris-HCl (pH 7,3), 10% glicerolo, 1% BSA). Conserva a -20 °C fino a quando non è pronto per eseguire il saggio. Pipetta su e giù più volte per mixare i media prima della raccolta
  2. Scongelamento del materiale congelato. Aggiungere 45 μL di buffer di stoccaggio LDH a un pozzo di una piastra nera a parete trasparente da 96 pozzi per ogni campione di mezzo da analizzare. Aggiungere 5 μL di mezzo diluito 1:10 a ciascun pozzo per una diluizione finale di 1:100. Prepara il reagente di rilevamento LDH mescolando 50 μL di miscela enzimatica per la rilevazione LDH e 0,25 μL di substrato di reduttasi per ogni campione da analizzare.
  3. Aggiungere 50 μL di reagente di rilevamento LDH a ogni pozzo contenente un mezzo diluito 1:100. Incubare a temperatura ambiente, protetto dalla luce, per 60 minuti. Prova per segnale bioluminescente su un lettore di piastre compatibile.

9. Imaging del calcio

  1. Prepara una soluzione di colorazione con colorante calcio con RPMI-1640 senza fenolo rosso, 0,04% pluronico e 5 μM Cal520-AM. Proteggi i campioni dalla luce.
  2. Rimuovere 100 μL di substrato da ciascun pozzo destinato all'imaging del calcio. Aggiungi 100 μL di soluzione di colorante di calcio e incuba a 37 °C, protetto dalla luce, per 30 minuti.
  3. Rimuovere 100 μL di substrato da ogni pozzo con colorante di calcio e sostituire con 100 μL di RPMI-1640 senza fenolo rosso. Incubare per 30 minuti - 1 ora a 37 °C per permettere il lavaggio del colorante.
  4. Utilizzando un microscopio con capacità di imaging continuo/streaming, posiziona la piastra di attacco ultra-bassa a 96 pozzi in posizione di lavoro. Con un obiettivo 10x, identifica la base di un hCO e osserva i transitori Cal520.
  5. Cattura registrazioni di 30 s di transitori di calcio a temperatura ambiente. Se si utilizza un microscopio confocale, non sarà possibile visualizzare attraverso l'intero hCO. Seleziona un piano focale vicino alla base dell'hCO, dove i contorni cellulari siano visibili durante i transitori del calcio.

10. Analisi dei transitori di calcio (Figura 3)

  1. L'analisi dei transitori di calcio può essere eseguita utilizzando una varietà di software di analisi dei picchi. Di seguito sono riportate le istruzioni per l'analisi utilizzando il plugin SpikyImageJ 41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Aggiungi cinque regioni di interesse (ROI) da 2 x 2 pixel al ROI Manager tra celle visibili in ogni hCO. Fai attenzione a non sovrapporre i ROI ai nuclei o ai confini cellulari, poiché il movimento dell'hCO può influenzare l'analisi dei transitori.
  3. Sotto Analizza > imposta le misure, seleziona Intensità Grigia Media. Nel ROI Manager, seleziona Multi-Measure per catturare l'Intensità Grigia Media a tutti i ROI e a tutti i frame della registrazione.
  4. Salva un file .csv contenente l'intensità grigia media per tutti i ROI. Salva tutte le posizioni di ROI per ogni immagine per riferimento successivo.
  5. In un nuovo foglio di calcolo, aggiungi una colonna per i Tempo/i. Calcola il tempo in ogni frame dividendo i 30 s per il numero totale di frame, poi moltiplicando per il numero di frame. Salva questo come .csv modificata.
  6. Apri il file .csv modificato a Fiji e apri il plugin Spike. Sotto Opzioni di analisi, seleziona i parametri di analisi desiderati.
  7. Tempo/i di traccia sull'asse X, e Intensità Grigia Media per il ROI #1 sull'asse Y. Seleziona Analizza i picchi e conferma la corretta annotazione della linea di base, dell'inizio/fine del picco e dell'ampiezza del picco. Se viene identificato il numero sbagliato di picchi, modificare i parametri nelle Opzioni di Analisi, inclusa l'ampiezza minima del picco dalla linea di base, e iniziare la soglia di picco fino a quando l'identificazione del picco non avrà successo.
  8. Salva tutti i file intermedi. I battiti per minuto (bpm) possono essere calcolati dividendo 60 per la media dell'intervallo picco a picco per ogni ROI.
  9. Ripeti l'analisi sopra per tutti i ROI per hCO.

figure-protocol-3
Figura 3: Analisi dei transitori di calcio. (A) La casella rossa indica il pulsante che apre il menu a tendina per scegliere i parametri di analisi. (B) La casella rossa indica il pulsante per tracciare il Tempo (s) rispetto all'Intensità Grigia Media da un ROI all'interno di un hCO rappresentativo non lesionato. (C) La casella rossa indica il pulsante per selezionare l'analisi dei picchi. (D) Analisi rappresentativa delle tracce e dei picchi dei transitori di calcio da un hCO non danneggiato. I triangoli rossi indicano il massimo del picco, i quadrati rosa rappresentano la pendenza massima per il picco di salita e discesa, il riquadro verde indica l'inizio del picco e il riquadro blu indica la linea di base. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguendo il protocollo sopra indicato, si dovrebbero produrre hCOs ben formati che iniziano a battere tra i giorni di differenziazione 7-12 (D7-12). Quando gli hCOs maturano oltre il giorno 25, è possibile che le contrazioni spontanee non siano più visibili senza il stimolo elettrico. L'infortunio H/R può essere eseguito in qualsiasi momento dopo che gli hCOs iniziano a battere - di solito eseguiamo infortuni su hCOs di 15 giorni (D15) o successivi.

Co...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui è presentato un protocollo passo dopo passo per generare e danneggiare gli hCOs autoassemblanti con H/R. Le malattie cardiache ischemiche sono caratterizzate da rimodellamento fisiopatologico, tra cui la morte dei cardiomiociti, la rimodellazione fibrotica, la disfunzione elettrica e il declino funzionale. Queste perturbazioni sono osservate nel sistema modello hCO, tra cui un aumento dei CM di TUNEL+ , un aumento del rilascio di LDH, un aumento dell'area tissutale di

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è supportato da R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) e dal programma di formazione per scienziati medici della Duke University T32 5T32GM145449-03 (LP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soluzione AccutaseSigma-AldrichA6964-500ML
Anticorpo anti-cardiaco troponina TAbcamEPR20266
Integratore di B-27 (50X), senza sieroGibco17504044
Integratore B-27, senza insulinaGibcoA1895602
Lettore di placche BioTek Synergy Neo2BioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra LabPMID: 38984052
Linea cellulare (Homo sapiens, maschio) - Linea iPSC DU11Nucleo delle Cellule Staminali della Duke University
Lame di microscopio caricate, vetro biancoVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRTecnologie STEMCELL5888
Micropiastre di attacco Corning 96-Well Clear Ultra Low AttachmentFisher7007
Serbatoi di pipettolamento usa e gettaVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
Microscopio fluorescente EVOSEVOS
Matrice basale-membrana con fattore di crescita ridotto Geltrex, senza LDEV, qualificata per cellule staminaliGibcoA1413302
Activina umana: una proteina ricombinantePEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2Tecnologie STEMCELL72124
L-Ascorbico Acido (Cristallino/ACS Certificato)Fisher ScientificA61-100
Anti-Vimentina per topiDSHBAMF-17b
mTeSR PlusTecnologie STEMCELL100-0276
Piastre di coltura cellulare multipozzo – 12 wellVWR10062-894
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
ReLeSRTecnologie STEMCELL100-0483
RPMI 1640 MediumGibco11875119
RPMI 1640 Medium, senza rosso fenolicoGibco11835-030
ThiazovivinaTecnologie STEMCELL72254
Composto Tissue-Tek O.C.T.SAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Microscopio confocale a disco rotante ZeissZeiss

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Related Articles