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Articolo metodologico

Misurazione della produzione di ossido nitrico nelle colture cellulari epiteliali tracheali del topo differenziate all'interfaccia aria-liquido

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DOI:

10.3791/70311

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3 luglio 2026

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1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per quantificare la produzione di ossido nitrico (NO) nelle colture epiteliali delle vie aeree differenziate all'interfaccia aria-liquido (ALI) misurando il nitrito nelle secrezioni apicali tramite un saggio di chemiluminescenza a base di triioduro.

Abstract

Le colture epiteliali delle vie aeree differenziate all'interfaccia aria-liquido (ALI) forniscono un modello fisiologicamente rilevante per studiare la segnalazione dell'ossido nitrico (NO) nelle cellule ciliate. Qui descriviamo un protocollo per quantificare la produzione di NO midendo il nitrito (NO₂⁻), un prodotto di ossidazione stabile del NO, in campioni raccolti da cellule epiteliali tracheali di topo differenziate da ALI. Vengono raccolti e analizzati lavaggi apicali, mezzi basali e lisati cellulari utilizzando un saggio chemiluminescente a base di triioduro accoppiato a un analizzatore di ossido nitrico (NOA). Al momento dell'iniezione nel recipiente di reazione, il nitrite viene chimicamente ridotto a NO, rilevato dalla chemiluminescenza a base di ozono. L'intensità del segnale viene quantificata e convertita in picomoli di nitriti utilizzando una curva di calibrazione standard, e i valori vengono normalizzati al contenuto proteico cellulare totale. Le prestazioni del saggio vengono validate tramite modulazione farmacologica dei livelli di NO. Dopo il trattamento con il donatore di NO dietilenetriammina NONOato (DETA-NONOato) e l'inibitore di NO sintasi N(ω)-Nitro-L-arginina metilestere (L-NAME) osserviamo differenze significative nei livelli di nitriti tra le condizioni. Il segnale più robusto e riproducibile si osserva nei lavaggi apicali, corrispondenti alla quantità di NO rilasciata dall'epitelio delle vie aeree. Questo metodo rileva in modo affidabile il NO nei campioni di epiteli delle vie aeree differenziate tramite ALI, fornendo una piattaforma in vitro accurata per quantificare la produzione di NO e modellare le malattie associate al metabolismo anomalo del NO.

Introduzione

Un tratto distintivo di diverse malattie delle vie aeree, tra cui asma, broncopatia cronica ostruttiva (BPCO), fibrosi cistica (FC) e discinesia ciliare primaria (PCD), è l'omeostasi alterata dell'ossido nitrico (NO) misurabile come variazioni nei livelli di NO espirati, che possono variare notevolmente in queste malattie, essendo elevati nella BPCO e nell'asma 1,2, mentre drasticamente ridotti nella FC e nellaPCD 3. 4. Queste malattie presentano comunemente anomalie nelle cili mobili epiteliali delle vie aeree, i principali effettori della puliziamucociliare 5. Poiché il NO e le sue vie di segnalazione a valle sono regolatori critici della motilità ciliare, comprendere come la produzione e la segnalazione del NO vengano alterate in questi contesti è essenziale per chiarire i meccanismi della disfunzione mucociliare. Di conseguenza, un metodo che consente la rilevazione precisa della produzione e del rilascio di NO negli epitelli delle vie aeree fornisce uno strumento prezioso per analizzare la regolazione e il ruolo fisiologico di questa molecola di segnalazione. Tali approcci sono particolarmente utili in contesti sperimentali dove la misurazione diretta del NO è difficile a causa della sua breve emivita e della rapida reattività.

Il NO regola la biogenesi e la funzione delle ciglia delle vie aeree influenzando la polarità cellulare ciliata e il battito coordinato delle cigliamobili 6,7,8. Tuttavia, i meccanismi che mantengono l'assenza di omeostasi nelle vie aeree restano incompletamente compresi. Le colture epiteliali delle vie aeree differenziate all'interfaccia aria-liquido (ALI) forniscono un prezioso sistema in vitro per indagare questi meccanismi. Attualmente, questo modello è ampiamente utilizzato per studiare l'impatto degli insulti ambientali sull'epiteliodelle vie aeree 9,10,11 e per chiarire la fisiopatologia delle malattie delle vieaeree 12. Rispetto alle colture sommerseconvenzionali 13,14, gli epiteli differenziati con ALI riproducono più fedelmente l'architettura e la funzione delle vie aeree native, inclusa la polarizzazione epiteliale, la differenziazione mucociliare e lo scambio realistico gas-liquido, rendendoli particolarmente adatti allo studio del rilascio apical di NO, la segnalazione e la funzione ciliare correlata. Questo sistema è quindi particolarmente adatto per esperimenti volti a quantificare i metaboliti derivati dal NO rilasciati nella luce delle vie aeree, in particolare in condizioni di differenziazione epiteliale o manipolazione farmacologica.

Una misurazione accurata della concentrazione di NO è essenziale, poiché sia livelli eccessivi che carenti di NO possono compromettere la funzione ciliare. Attualmente, i metodi basati su sonde fluorescenti (ad esempio, diaminofluoresceine, DAF) disponibili per il rilevamento del NO sono solo semi-quantitativi e sono limitati dalla sensibilità al pH, dalla dipendenza dall'ossigeno e dalla mancanza di specificità, poiché possono reagire con ossidanti e antiossidanti cellulari, portando a misurazioni semi-quantitative15. Inoltre, sensori elettrochimici (ad esempio, elettrodi amperometrici sensibili al NO) permettono il rilevamento in tempo reale delNO 16 ma possono essere difficili da implementare in sistemi biologici complessi a causa dell'ABSENCE di semivita corta, interferenze dovute al bioincastramento della superficie dell'elettrodo tra specie redox attive e alle difficoltà nel mantenere una calibrazionestabile 17. Sono stati descritti anche approcci alternativi basati sulla chemiluminescenza, tra cui la rilevazione diretta del NO in fase gassa e saggi riduttivi rivolti a diverse specie di ossido di azoto, ma la loro applicazione alle colture epiteliali delle vie aeree rimane inesplorata. Queste limitazioni evidenziano la necessità di metodi sensibili e quantitativi in grado di rilevare in modo affidabile bassi livelli di specie derivate dal NO in campioni biologici di piccolo volume. Per superare queste limitazioni, abbiamo stabilito un protocollo per quantificare il NO nelle secrezioni apicali raccolte dagli epitelii delle vie aeree differenziate tramite ALI utilizzando un Nitric Oxide Analyzer (NOA). Il NOA è un rivelatore altamente sensibile basato su chemiluminescenza, tradizionalmente utilizzato per misurare i metaboliti NO nei campioni chimici e più recentemente adattato per l'analisi di campioni biologici, inclusi sangue, omogeneati tissutali e supernatanti in colturacellulare 7,18,19. Il NO è una molecola di segnalazione altamente reattiva che si ossida rapidamente in nitriti nei tessuti in condizioni di normali livelli di ossigeno, con un'emivita eccezionalmente breve. Pertanto, il nitrito come prodotto finale dell'ossidazione del NO funge da indicatore della produzione totale di NO nei sistemibiologici 20,21,22. Questo metodo di chemiluminescenza sensibile e riproducibile permette la rilevazione di nitriti/NO a livellipicomolari 23,24, rendendolo ideale per misurare piccoli cambiamenti in campioni biologici a basso volume come quelli derivati dalle colture MTEC ALI. Tuttavia, questo approccio è più adatto in condizioni in cui l'accumulo di nitriti riflette la recente produzione di NO e può essere influenzato da fattori come la gestione del campione, la contaminazione da nitriti di fondo e lo stato di differenziazione epiteliale. Pertanto, sono necessari controlli adeguati e un disegno sperimentale accurato per garantire un'interpretazione accurata dei risultati.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state esaminate e approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università del Maryland (Protocollo # AUP–00004632).

NOTA: Il protocollo richiede circa 2 giorni per l'isolamento delle cellule epiteliali tracheali dei topi (MTEC), seguiti da 7–10 giorni per l'espansione, 5–6 giorni per la proliferazione negli inserti transwell, 21 giorni per la differenziazione (tempo necessario per acquisire cellule multi-ciliate sufficienti), 24 ore di trattamento farmacologico e un giorno aggiuntivo per la raccolta del campione, calibrazione NOA, iniezioni e acquisizione dati.

1. Preparazione di media e soluzioni

NOTA: Consulta la Tabella 1 per i dettagli sugli ingredienti dei media.

  1. I media F–12 di Ham
    1. Prepara la soluzione all'interno di una cappa a flusso laminare sterile. Aggiungi 5 mL di antibiotici 100× Penicillina/Streptomicina e 0,5 mL di Amphoterecin B (Fungizone) a 500 mL di mezzo F12 di Ham in una bottiglia sterile.
    2. Mescola invertendo delicatamente la bottiglia 5–10 volte per assicurare una miscelazione completa. Filtra sterilizza la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 μm in condizioni sterili e conserva a 4 °C.
      ATTENZIONE: Penicillina/streptomicina e anfotericina B sono agenti antimicrobici che possono causare irritazione o reazioni allergiche. Maneggiare utilizzando l'attrezzatura di protezione personale adeguata, inclusi guanti e camice da laboratorio.
  2. Soluzione pronasi
    1. Aggiungi 15 mg di pronasi a 10 mL di mezzo sterile Ham's F12 in un tubo sterile per ottenere una soluzione pronasi allo 0,15%. Mescola invertendo delicatamente o pipettando su e giù finché la pronasi non si dissolve completamente. Prepara fresco subito prima dell'uso.
  3. Soluzione DNase I
    1. Aggiungi 5 mg di DNasi pancreatica grezza I a 9 mL di medium F12 di Ham e 1 mL di soluzione di albumina sirica bovina (BSA) da 10 mg/mL in un tubo sterile per ottenere una soluzione di DNasi I da 0,5 mg/mL.
    2. Mescola delicatamente pipettando su e giù finché la DNasi I non si scioglie completamente, evitando la formazione di bolle. Una volta completamente disciolta, si aliciquota la soluzione in tubi microcentrifughe sterili da 1 mL e si conserva a -20 °C.
  4. Medias F12 di Ham's con siero fetale bovino (FBS)
    1. Prepara la soluzione a temperatura ambiente all'interno di una cappa a flusso laminare sterile. Aggiungere 10 mL di siero bovino fetale (FBS) a 40 mL di substrato F12 di Ham con antibiotici in un tubo conico sterile per ottenere il 20% di FBS nel mezzo F12.
    2. Mescola delicatamente invertendo il tubo 5–10 volte finché la soluzione non diventa omogenea. Filtra sterilizza la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 μm in condizioni sterili e conserva a 4 °C.
  5. Supporti di espansione MTEC
    1. Prepara il mezzo di espansione MTEC a temperatura ambiente all'interno di una cappa a flusso laminare sterile combinando i componenti elencati nella Tabella 1 in una bottiglia sterile.
    2. Mescola accuratamente facendo ruotare o invertendo delicatamente il contenitore finché tutti i componenti non sono completamente combinati. Sterilizza la soluzione con un filtro da 0,22 μm in condizioni sterili.
    3. Aggiungere l'inibitore ROCK Y–27632 (soluzione stock da 5 mM) a una concentrazione finale di 10 μM e l'inibitore Notch γ–secretasi DAPT (soluzione stock da 10 mM) a una concentrazione finale di 5 μM immediatamente prima dell'uso, e mescolare delicatamente per inversione.
  6. Media per la proliferazione MTEC
    1. Preparare il mezzo di proliferazione MTEC a temperatura ambiente all'interno di una cappa a flusso laminare sterile combinando i componenti elencati nella Tabella 1.
    2. Mescola accuratamente con una lieve inversione o vortice finché tutti i componenti non sono completamente uniti. Sterilizza il mezzo tramite un filtro da 0,22 μm in condizioni sterili.
    3. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere l'inibitore ROCK Y–27632 (soluzione stock da 5 mM) a una concentrazione finale di 10 μM e l'acido retinoico (soluzione stock da 5 μM) a una concentrazione finale di 0,05 μM. Mescolare delicatamente per inversione prima dell'uso.
  7. Mezzi di differenziazione MTEC
    1. Prepara il mezzo di differenziazione MTEC a temperatura ambiente all'interno di una cappa a flusso laminare sterile combinando i componenti elencati nella Tabella 1 in un contenitore sterile.
    2. Mescola accuratamente con una lieve inversione o vortice finché tutti i componenti non sono completamente uniti. Sterilizza il mezzo tramite un filtro da 0,22 μm in condizioni sterili.
    3. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere acido retinoico a una concentrazione finale di 0,05 μM e mescolare delicatamente per inversione.

2. Isolamento delle cellule epiteliali tracheali del muro (MTEC)

  1. Eutanasiare tre topi adulti (8–20 settimane) tramite inalazione di anidride carbonica (CO2) in una camera di eutanasia approvata secondo le linee guida istituzionali IACUC. Confermare la morte prima della raccolta dei tessuti.
  2. Posiziona l'animale dorsalmente (petto rivolto verso l'alto) su una superficie asettica. Usando pinze pulite, solleva delicatamente la pelle e tagliala con forbici chirurgiche dal labbro inferiore all'addome per esporre la trachea.
  3. Sposta le ghiandole salivari e rimuovi il tessuto connettivo e il muscolo tracheale per esporre gli anelli cartilaginesi. Disseziona tutta la lunghezza della trachea e mettila in una piastra di Petri contenente il mezzo sterile di Ham's F12. Unisci tre trachee in un unico piatto.
  4. Trasferisci la ciotola in una cappa a flusso laminare e posiziona la trachea su un altro piatto con il medium fresco del prosciutto F12. Rimuovere qualsiasi tessuto extratracheale e tagliare la trachea longitudinalmente attraverso il lume.
  5. Trasferire tutte le trachee in un tubo conico a vite da 50 mL contenente una soluzione sterile di 10 mL allo 0,15% di pronasi. Incubare a 4 °C per 16–18 ore.

3. Isolamento della cella ed espansione iniziale

  1. Il giorno successivo inverti il tubo contenente i tessuti 10–15 volte per spostare le cellule epiteliali e incubare a 4 °C per 45 minuti. Fermare la reazione pronase aggiungendo 10 mL di substrato di Hams contenente il 20% di FBS e mescolare invertendo 10–15 volte.
  2. Aggiungi 10 mL di medium F12 di Ham con FBS a tre tubi da 15 mL. Con una pipetta Pasteur trasferisci il tessuto tracheale sequencialmente dal tubo da 50 mL al primo, secondo e terzo tubo da 15 mL e inverti 10–15 volte in ciascun tubo per spostare le cellule epiteliali tracheali. Scartare il tessuto dopo il trasferimento finale.
  3. Combina tutto il mezzo dei tre tubi conici da 15 mL con il mezzo nel tubo da 50 mL. Centrifugare a 360 × g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere con attenzione il sovrandante e aggiungere 0,5 mL di soluzione DNasi I da 0,5 mg/mL. Incubare sul ghiaccio per 5 minuti.
  4. Centrifugare a 360 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare con cura il sovrandanante e risospendere la pellet cellulare in 7–10 mL di mezzo di espansione MTEC.

4. Espansione e differenziazione del MTEC

  1. Prepara una fiaschetta di coltura di cellule T75 rivestita di collagene utilizzando 10 mL di collagene I (coda di ratto) a 50 μg/mL e incuba a 37 °C per 16–18 ore. Aspirare la soluzione di collagene dalla fiaschetta T75 e lavare la fiaschetta tre volte con PBS (1×). Lascia asciugare completamente la fiaschetta.
  2. Semina la sospensione cellulare composta da 7–10 mL di mezzo di espansione MTEC contenente le cellule nella fiaschetta rivestita di collagene. Posizionare la fiaschetta in un incubatore a 37 °C e 5% diCO2. Sostituisci il mezzo di espansione ogni 2 o 3 giorni e monitora il numero delle celle fino al 70% di confluenza.
  3. Al 70% di confluenza, aggiungere 1 mL di soluzione di Accutasi e incubare per 10–15 minuti a 37 °C per staccare il monostrato cellulare. Risospendere le cellule in 10 mL di mezzo di proliferazione MTEC. Centrifuga a 1057 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Scartare il soprantantante, risospendere le cellule nel mezzo di proliferazione e contare le cellule.
  5. Seme 2 × 105 cellule con un volume di 0,5 mL per inserto di transwell (diametro membrana di 12 mm, dimensione poro della membrana di 0,4 μm) pre-rivestito con collagene. Aggiungere 1,5 mL di mezzo alla camera basale di ogni inserto e posizionare il transwell nell'incubatrice a 37 °C.
  6. Cambia il mezzo sia nella camera apicale che in quella basale al terzo giorno e permette alle cellule di raggiungere il 100% di confluenza, di solito entro il quinto o sesto giorno. Includere un inserto senza celle come controllo.
  7. Una volta confluente, lavare le cellule apicicamente con 0,5 mL di mezzo di differenziazione MTEC. Avviare l'interfaccia aria-liquido (ALI) aggiungendo 0,75 mL di mezzo di differenziazione solo alla camera basale, lasciando le cellule nella camera apicale esposte all'aria.
  8. Ogni 2–3 giorni, si lava le cellule della superficie apicale con un mezzo di differenziazione e si sostituisce il mezzo basale. Lascia che le cellule si differenzino all'ALI per 21 giorni.

5. Immunomarcatura e imaging delle cellule epiteliali ciliate

  1. Ai giorni 7, 14 e 21 di ALI, fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 4%.
  2. Eseguire immunomarcatura di cellule con anticorpo anti-FoxJ1 per rilevare FoxJ1, un fattore di trascrizione essenziale per la ciliogenesimobile 25,26, e anticorpo anti-acetilato α–tubulina per rilevare la α–tubulina acetilata, un marcatore strutturale delle ciglia mobili secondo i protocollipubblicati 27,28,29.
    ATTENZIONE: Il PFA è una sostanza chimica pericolosa, quindi indossa i DPI appropriati (guanti in nitrile e camice da laboratorio) quando si fissano le cellule.
  3. Acquisire immagini delle cellule immunomarcate tramite microscopia confocale utilizzando un obiettivo del 40× o 60×. Raccogliere pile Z che coprono una profondità di 10 μm con ogni passo di 0,5 μm.
  4. Imposta potenza laser, guadagno del rilevatore e impostazioni di esposizione per evitare la saturazione del segnale e mantenere parametri di acquisizione comparabili tra i campioni.
  5. Quantificare le cellule FoxJ1–positive o acetilate a tubulina-positiva come percentuale di cellule totali (DAPI–positive) per ogni regione di interesse (ROI) utilizzando il plugin contatore cellulare nel software di imaging FIJI.
  6. Nel software GraphPad Prism (v. 10.0) genera grafici ed esegui analisi statistiche usando un test t di Student a due code dopo aver valutato la distribuzione dei dati per la normalità usando il test di Shapiro-Wilk.

6. Trattamento farmacologico dell'epitelio differenziato delle vie aeree

  1. Al giorno 21 dell'ALI preparare un mezzo di differenziazione (3 mL per le cellule in tre inserti) in un tubo sterile a temperatura ambiente.
  2. Aggiungere 7,5 μL di triammina–NONOato o DETA/NO da una soluzione stock da 100 mM (preparata in 10 mM NaOH) al mezzo di differenziazione per ottenere la concentrazione finale di 250 μM in 3 mL. Mescola delicatamente per inversione e usa subito.
  3. Aggiungere 750 μL della soluzione finale a ciascuna delle tre camere basale delle cellule differenziate e incubare per 24 ore a 37 °C.
  4. Preparare 1 mM di Nω-Nitro-L-Arginina Metilica (L–NAME) aggiungendo 30 μL dalla soluzione di origine L-NAME da 100 mM (preparata in DMSO) al mezzo di differenziazione MTEC per un volume totale di 3 mL.
  5. Aggiungere 750 μL della soluzione finale in ciascuna delle tre camere basale e incubare per 24 ore a 37 °C.
  6. Aggiungere 30 μL di dimetilsolfosido (DMSO) solo (gruppo non trattato) a 3 mL di substrato basale (1% v/v).
  7. Aggiungere 750 μL della soluzione finale nella camera basale di tre inserti (non trattata).

7. Raccolta di campioni

NOTA: Per l'analisi NOA è necessario raccogliere i campioni di media, lavaggio apicale e lisato cellulare da tre inserti.

  1. Al giorno 22 dell'ALI, si prelevano campioni dall'epitelio delle vie aeree differenzianti a partire da 750 μL di mezzo basale da ciascuno dei tre inserti per gruppo sperimentale.
  2. Raccogliere mezzi basali incubati in inserti senza cellule per fungere da controllo a vuoto, tenendo conto di una possibile contaminazione da nitriti esterni.
  3. Raccogliere il substrato basale di tre inserti e conservare immediatamente a -20 °C fino all'iniezione nel NOA.
  4. Per raccogliere il nitrito/NO presente nel muco apicale dell'epitelio, aggiungere 50 μL di PBS (1×) tampone preriscaldato (sterile, alquotato e congelato) sopra le cellule di ogni inserto e incubare per 30 minuti a 37 °C.
    NOTA: Durante i 30 minuti di incubazione delle cellule con PBS per raccogliere il lavaggio apicale, il PBS può essere aggiunto anche nella camera basale per mantenere l'idratazione su entrambi i lati delle cellule.
  5. Raccogli il PBS contenente il muco che sovrasta l'epitelio.
  6. Raccogliere i lavaggi PBS da tre inserti per ottenere circa 150 μL di muco apicale/PBS da ogni condizione sperimentale, sufficiente per due iniezioni di NOA.
  7. Conservare i campioni di lavaggio apicale a -20 °C fino a un ulteriore utilizzo.
  8. Conserva anche il buffer di lavaggio PBS per usarlo come controllo in vuoto durante le iniezioni di NOA.
  9. Lavare due volte i lati apicale e basale delle cellule in tre inserti con 500 μL di PBS preriscaldato.
  10. Aggiungere 500 μL di soluzione di Accutasi in modo apicole e incubare per 15–20 minuti finché le cellule non si staccano completamente dalle membrane.
  11. Una volta completamente staccata, aggiungere substrato RPMI-1640 senza siero alle celle (con un rapporto di mezzo 3:1 per Accutasi).
  12. Raccogli le celle staccate dai tre inserti in un unico tubo.
  13. Fai girare le celle a 3000 × g per 5 minuti a 4 °C.
  14. Risospendere il pellet cellulare in 50 μL di soluzione di lisi (buffer RIPA + cocktail inibitori di proteasi Halt 1×) e incubare sul ghiaccio per 45 minuti.
  15. Centrifuga il lisato a 14.800 × g per 20 minuti a 4 °C e raccogli il soprandante.
  16. Utilizzare 3 μL di lisato a cellula intera per determinare la concentrazione proteica tramite il saggio sull'Acido Bicincininico (BCA).
  17. Diluire la soluzione residua di lisato 1:1 nel tampone RIPA per ottenere volume sufficiente per due iniezioni di NOA da 50 μL.
  18. Conservare i lisati a -80 °C fino all'iniezione nel NOA a -20 °C.
  19. Conservare il buffer RIPA utilizzato per risospendere il pellet cellulare a -20 °C da utilizzare come blank e controllo della contaminazione per i campioni di lisseto.

8. Calibrazione NOA e iniezioni di campioni

  1. Prepara il reagente triioduro dissolvendo 400 mg di iodio di potassio e 250 mg di iodio in 28 mL di acido acetico glaciale e 8 mL di acqua ultrapura.
  2. Esegui la preparazione del reagente triioduro in una cappa chimica utilizzando l'attrezzatura di protezione personale appropriata (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi).
    ATTENZIONE: Lo iodio e l'acido acetico glaciale sono pericolosi e possono causare irritazione e corrosione alla pelle e agli occhi.
  3. Conserva a temperatura ambiente e usa entro 2 settimane dalla preparazione.
  4. Prepara 1 mM di soluzione di nitrito di sodio in acqua priva di nitriti.
  5. Conserva la soluzione di serie a -20 °C fino all'uso.
  6. Preparare nuovi standard di lavoro (0,125–4,0 μM) in PBS immediatamente prima delle iniezioni.
    NOTA: Per la calibrazione del NOA, utilizzare PBS sterile e strettamente tappato per minimizzare la contaminazione da nitriti.
  7. Attiva il gas portatore di azoto (N2) e avvia il flusso di gas attraverso il sistema.
  8. Assemblare il contenitore di purga in vetro e aggiungere 4 mL di reagente triioduro nel recipiente con 20 μL di antischiuma diluita 1:10.
  9. Coprila saldamente con un setto fissato dal tappo a vite per garantire una tenuta ermetica.
  10. Versa 10 mL di idrossido di sodio (NaOH) nel filtro NaOH.
  11. Sullo schermo dello strumento NOA (nCLD 88) seleziona Misura, seleziona Gas e Tiro.
  12. Imposta lo strumento su MR2:50.00, corrispondente a un intervallo di misura tra 0 e 50 parti per miliardo di NO, e seleziona Veloce per l'impostazione del filtro.
  13. Regolare la pressione del gas azoto finché la pressione del reattore non si stabilizza tra 27–29 psi (186–200 kPa).
  14. Apri il software grafico eDAQ sul computer collegato al NOA.
  15. Imposta l'intervallo di acquisizione a 10/s e la tensione a 10 V.
  16. Naviga su Impostazione > canale, seleziona Canale 1.
  17. Imposta la scala di visualizzazione su 2:1 sul software NOA.
  18. Avvia l'acquisizione dati sullo strumento NOA e nel software.
  19. Monitora la base finché non si stabilizza.
  20. Iniettare 10 μL di PBS attraverso il setto nel recipiente di purga utilizzando una siringa Hamilton per confermare la stabilità di base.
  21. Registra il segnale chemiluminescente per ogni iniezione.
  22. Iniettare 10 μL dello standard nitritico 0,125 μM nel recipiente di purga.
  23. Ripeti due volte per ogni standard di nitriti, per ottenere misurazioni duplicate che verranno poi mediate.
  24. Annota ogni iniezione nella scheda Commenti (ad esempio, 10 μL 0,5 μM nitriti).
  25. Passa la siringa su un fazzoletto privo di pelucchi e risciacqua 3–4 volte con acqua sterile senza nitriti per rimuovere l'eccesso di triioduro.
  26. Ripeti questo passaggio di pulizia dopo ogni iniezione.
  27. Permettere al segnale di tornare alla linea di base tra le iniezioni (20–30 s).
  28. Apri la finestra di Analisi del Flusso .
  29. Rivedere i valori di altezza e tempo di picco per ogni iniezione nella tabella di analisi.
  30. Evidenzia ogni picco e regola la selezione per calcolare l'area sotto la curva (AUC).
  31. Sposta il display da S a C per abilitare la modalità di calibrazione.
  32. Inserisce le quantità note di nitriti per ogni standard nella colonna Quantità .
  33. Clicca sul pulsante Curva di calibrazione per generare la curva standard.
  34. Verifica che la curva di calibrazione soddisfi i criteri di accettazione (R2 ≥ 0,99).
  35. Scongelare campioni biologici precedentemente raccolti da colture ALI su ghiaccio.
  36. Iniettare 50 μL di mezzo senza cellule in bianco nel recipiente di purga.
  37. Iniettare 50 μL di ciascun campione di mezzo basale nel recipiente di purga.
  38. Registra il segnale di chemiluminescenza per ogni iniezione.
  39. Eseguire iniezioni duplicate (50 μL ciascuna) per ogni campione.
    NOTA: Le iniezioni da 50 μL provocano la formazione frequente di bolle. Per limitare questo problema, sostituisci regolarmente il reagente triioduro con antischiuma nel recipiente di purga.
  40. Annota ogni campione nella scheda Commenti prima dell'iniezione.
  41. Iniettare 50 μL di PBS senza cellule (blank apicale) nel recipiente di purga.
  42. Iniettare campioni di lavaggio apicale (due iniezioni da 50 μL per campione) e registrare i relativi picchi di segnale.
  43. Iniettare due volte il buffer RIPA, seguito da campioni di lisato (due iniezioni da 50 μL per campione) e registrare i relativi picchi di segnale.
    NOTA: Lascia sempre che la traccia chemiluminescente torni fino alla linea di base e si stabilizzi. Aspettare 20–30 secondi, poi iniettare il campione successivo.
  44. Al termine delle iniezioni di campioni, apri la finestra di Analisi del Flusso .
  45. Evidenzia ogni picco campione per calcolare l'area sotto la curva (AUC).
  46. Determina le concentrazioni di nitriti per ogni campione utilizzando la curva di calibrazione generata dalle soluzioni standard.

9. Raccolta, normalizzazione e analisi dei dati

  1. Esporta i dati, inclusi l'altezza di picco (V), l'area sotto la curva (V.s) e l'area media sotto la curva, dalla funzione Analisi del Flusso nel software eDAQ in un file Excel. Il file esportato tabularà l'altezza (V) rispetto al tempo (s) delle tracce del segnale per l'intero esperimento NOA.
  2. Determinare i picomoli (pmol) di nitrite iniettati nel NOA moltiplicando la concentrazione di nitrite (μM) per il volume di iniezione (μL).
  3. Fai la media dei picomoli (pmol) di nitriti misurati nei controlli (mezzo cellulare, PBS wash buffer o RIPA buffer).
  4. Sottrai i corrispondenti valori di controllo dal pmol misurato in ogni iniezione di campione da 50 μL.
  5. Determinare il totale di picomoli (pmol) di nitrite in ciascun campione moltiplicando il pmol misurato nella porzione iniettata del campione per il volume totale esatto del campione raccolto. Usare 750 μL per il substrato, 150 μL per il lavaggio apicale e circa 90–100 μL per il lisato.
  6. Inoltre, solo per i lisati, moltiplicare il pmol totale di nitrite per 2 per tenere conto del fattore di diluizione.
  7. Normalizzare il pmol di nitrito ottenuto per ciascun campione dividendo questi valori per la quantità totale di proteine (μg) presente nel lisato del campione corrispondente, ottenuto precedentemente tramite il test BCA.
  8. Fai la media dei livelli di nitriti (pmol/μg) da doppie iniezioni per ciascun campione.
  9. Traccia i livelli normalizzati di nitriti (pmol/μg di proteina totale) per ogni campione utilizzando il software GraphPad Prism.
  10. Valutare la distribuzione dei dati per la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk.
  11. Esegui un'analisi statistica utilizzando un test Students t a due code.

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Risultati

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i livelli di ossido nitrico (NO) nelle colture di cellule epiteliali tracheali del muro (MTEC) differenziate all'interfaccia aria-liquido (ALI). Le cellule primarie vengono isolate e differenziate secondo i protocollistabiliti 27,28. Nel corso di 21 giorni all'ALI, le cellule vengono differenziate in un epitelio delle vie aeree pseudostratificato contenente cellule

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Discussione

Le cellule multi-ciliate all'interno dell'epitelio delle vie aeree sono fondamentali per la sintesi e la segnalazione del NO, che a loro volta sono essenziali per regolare il battito ciliare, la pulizia mucociliare e l'omeostasidelle vie aeree 6,7,8. Il NO è una molecola altamente reattiva e anche piccoli cambiamenti nei livelli di NO sono associati a malattie delle vieaeree

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo il dottor Mark T. Gladwin (Preside e Professore della University of Maryland School of Medicine) per le indicazioni sulla progettazione degli studi. Ringraziamo inoltre il Confocal Microscopy Core della University of Maryland School of Medicine (Baltimore, MD) per l'accesso alle risorse di microscopia confocale. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 5R01HL168775 dei National Institutes of Health (NIH) alla Dott.ssa Paola Corti.

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Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248diluito 1:2000 per immunocolorazione
50 mL Centrifuge tube filter (0.22 µm)CellTreat229710Per preparazione di soluzioni sterili
500 mL Filter unitsThermoFisher Scientific566-0020Per preparazione di media sterili
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
Bovine Pituitary ExtractThermoFisher Scientific13028014
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
Cholera toxinSigmaC8052
Collagen IThermoFisher ScientificA1048301
Confocal MicroscopeNikonW1 Spinning disk Ti2 inverted microscope with Hamamatsu sCMOS camera
Corning Transwell insertsSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 mediaThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
Fetal Bovine SerumSigmaF4135
Halt 1X Protease inhibitor cocktailThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765054
Insulin solutionSigmaI0516
Isoproterenol hydrochlorideSigmaI6504
Keratinocyte Serum-free mediaThermoFisher Scientific17005042
Murine Epidermal growth factorSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Phosphate buffer saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
PronaseSigma10165921001
Retinoic acidSigmaR2625
Rho kinase inhibitor (Y-27632 hydrochloride)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA bufferSigmaR0278
RPMI-1640 mediaThermoFisher Scientific11875093
Sodium nitrite SigmaS2252
TransferrinSigmaT8158
α-Acetylated tubulin antibody (mouse)SigmaT6793diluito 1:200 per immunocolorazione
α-FoxJ1 antibody (mouse)ThermoFisher Scientific14-9965-80diluito 1:200 per immunocolorazione
α-mouseCy3 secondary antibodyThermoFisher ScientificA10521diluito 1:1000 per immunocolorazione
γ-secretase inhibitor IX (DAPT)SigmaD5942
```

Riferimenti

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Misurazione della produzione di ossido nitrico nelle colture cellulari epiteliali tracheali del topo differenziate all'interfaccia aria-liquido
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