Un flusso di lavoro per visualizzare la dinamica conformazionale delle proteine da mappe crio-EM utilizzando la sintetasi di asparagina umana

Summary

Questo protocollo delinea come eseguire analisi di variabilità 3D (3DVA) in CryoSPARC e raffinamento della variabilità in Phenix per analizzare l'eterogeneità conformazionale nei dati crio-EM. Utilizzando come esempio la sintetasi di asparagina umana, spiega come generare mappe di variabilità, visualizzare i componenti principali e perfezionare i relativi modelli atomici.

Abstract

Questo articolo presenta un flusso di lavoro completo per analizzare l'eterogeneità conformazionale nei dati di crio-microscopia elettronica a particella singola (cryo-EM) utilizzando l'analisi della variabilità 3D (3DVA) in CryoSPARC e la raffinazione della variabilità in Phenix. Il protocollo descrive come calcolare mappe di variabilità lungo le componenti principali derivate da immagini di particelle, visualizzare le modalità principali di variazione strutturale e affinare corrispondenti ensemble di modelli atomici rispetto ai singoli sistemi di variabilità. I risultati risultanti includono una serie di mappe di variabilità 3D, strutture atomiche multi-modello affinate che rappresentano stati conformazionali discreti e file di visualizzazione adatti all'analisi strutturale comparativa e alla generazione di film. Questo flusso di lavoro è ampiamente applicabile alle ricostruzioni crio-EM nell'intervallo di risoluzione (tipicamente ~2,0-6,0 Å), dove l'eterogeneità conformazionale può essere interpretata in modo significativo a livello di backbone e side-chain. È particolarmente adatta per catturare movimenti continui di dominio, movimenti di piegamento delle cerniere e riarrangiamenti locali coordinati che non sono facilmente risolti solo con una classificazione discreta. L'uso combinato di mappe di variabilità e di ensemble di modelli raffinati consente il confronto strutturale diretto degli estremi conformazionali, supporta analisi quantitative come i calcoli della fluttuazione quadratica media (RMSF) e fornisce un quadro per collegare caratteristiche strutturali dinamiche a ipotesi biochimiche o funzionali. L'asparagina sintetasi umana (ASNS) è utilizzata come esempio per dimostrare l'implementazione pratica del flusso di lavoro.

Introduction

Caratterizzare l'eterogeneità conformazionale nelle strutture macromolecolari è un aspetto sempre più importante dell'analisi crio-elettronica a singola particella (crio-EM). L'obiettivo di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro pratico per estrarre, visualizzare e raffinare le modalità dominanti di variabilità strutturale direttamente dai dataset crio-EM, utilizzando l'analisi tridimensionale della variabilità (3DVA) in CryoSPARC¹ combinata con il raffinamento della variabilità in^{Phenix 2}. Questo articolo è pensato per guidare i lettori nel determinare se questo approccio computazionale sia appropriato per i loro dati e nella comprensione dei tipi di output generati dal flusso di lavoro.

Le tecniche sperimentali tradizionali (ad esempio, scambio idrogeno-deuterio, spettroscopia NMR, spettrometria di massa) forniscono informazioni preziose sui moti delle ^{proteine 3,4,5}, ma sono spesso limitate dalla dimensione molecolare, dai requisiti del campione o dalla complessità sperimentale. I progressi nella crio-EM hanno permesso la determinazione della struttura ad alta risoluzione per sistemi grandi ed eterogenei, consentendo l'analisi della variabilità conformazionale all'interno delle popolazioni di particelle. L'analisi della variabilità 3D (3DVA), implementata in CryoSPARC¹, scompone i dataset di particelle crio-EM in componenti principali che descrivono modalità dominanti e continue di variazione strutturale. Quando combinato con la raffinatezza della variabilità in^{Phenix 2}, questo approccio produce modelli atomici corrispondenti a posizioni discrete lungo ciascun componente principale, permettendo la visualizzazione e il confronto di conformazioni alternative derivate da dati sperimentali.

Questo protocollo è più adatto per dataset crio-EM ricostruiti a risoluzione da vicino a quella intermedia (tipicamente ~2-6 Å). A risoluzioni più elevate, il flusso di lavoro può catturare riarrangiamenti della backbone e variabilità limitata della^{side-chain 6}, mentre a risoluzioni più basse è più adatto per identificare movimenti a livello di dominio o di struttura^{secondaria 2,7}. Il metodo è adatto a catturare modalità di moto dominanti e continue ampiamente popolate nel dataset, come i movimenti a cerniera, la respirazione a dominio o le riorganizzazioni coordinate tra domini o subunità. Un numero adeguato di particelle e una copertura angolare sono essenziali, e l'interpretazione può essere limitata in regioni flessibili o debolmente risolte dove le posizioni della catena laterale rimangono ambigue. Rispetto alla classificazione^{focalizzata 8} o alle strategie di sottoclassificazione estesa, il flusso di lavoro di raffinamento della variabilità 3D rappresenta l'eterogeneità conformazionale come traiettorie continue piuttosto che come classi discrete. Questo rende il metodo particolarmente utile per l'analisi esplorativa di enzimi, macchine molecolari e complessi multidominio che si prevede campionino molteplici conformazioni.

L'asparagina sintetasi umana (ASNS) viene utilizzata come esempio illustrativo per dimostrare l'implementazione del protocollo. ASNS è un'amidotransferasi dipendente dalla glutammina composta da due domini funzionali collegati da un tunnel di ammoniaca^{intramolecolare 9,10}. Studi precedenti hanno suggerito che cambiamenti conformazionali che coinvolgono residui come Arg-142 contribuiscono alla modulazione di questo tunnel⁶. In questo articolo, ASNS funge esclusivamente da sistema rappresentativo per dimostrare come la 3DVA e il raffinamento della variabilità generino mappe di variabilità, ensemble di modelli atomici raffinati e visualizzazioni. L'interpretazione meccanicistica dettagliata è rimandata alle sezioni Risultati e Discussione. Sebbene le simulazioni di dinamica molecolare (MD) siano spesso utilizzate come approccio complementare per esplorare i paesaggi^{conformazionali 11,12}, la MD non è richiesta per questo protocollo. I confronti con le simulazioni MD possono essere effettuati come analisi opzionale a valle, ma il flusso di lavoro descritto qui (Figura 1) si concentra esclusivamente sull'estrazione e visualizzazione dell'eterogeneità conformazionale dai dati crio-EM.

Figura 1. Panoramica del flusso di lavoro. Una mappa crio-EM consensuale viene ricostruita da dati a particella singola e sottoposta ad analisi di variabilità tridimensionale (3DVA) per generare mappe di variabilità lungo le componenti principali. La raffinazione della variabilità (Phenix.varref) utilizza il modello atomico di consenso per generare modelli atomici corrispondenti per visualizzazione e confronto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione dei dati

1. Generazione di una mappa EM di consenso
   1. Utilizzare la criomicroscopia elettronica a particella singola (crio-EM) per determinare la struttura 3D consensuale del complesso macromolecolare.
   2. Vetrificare i campioni su griglie criogeniche e immaginere utilizzando un microscopio elettronico ad alta tensione dotato di un rivelatore di elettroni diretti.
   3. Elaborare i filmati raccolti per correggere il movimento indotto dal fascio, stimare i parametri di imaging e selezionare le immagini delle particelle.
   4. Eseguire una classificazione iterativa e un perfezionamento delle particelle per generare una mappa EM di consenso.
   5. Esegui l'elaborazione dei dati utilizzando CryoSPARC (v4 o superiore⁾¹³, poiché verrà implementata l'analisi di variabilità 3D (3DVA).
2. Generare un modello di consenso
   1. Costruisci un modello atomico e affinalo rispetto alla mappa di consenso. Validare la qualità raffinata del modello utilizzando criteri standard
      NOTA: Per gli ASN, la struttura è stata determinata utilizzando una strategia di selezione di particelle basata su template. Un modello derivato dalla struttura a raggi X dell'ASNS umano modificato con DON (PDB 6GQ3)⁹è stato utilizzato per selezionare efficacemente particelle di alta qualità in CryoSPARC¹³. Queste particelle hanno subito cicli iterativi di classificazione 2D, ricostruzione Ab initio e raffinamento eterogeneo e non uniforme con l'imposta della simmetria C2, ottenendo una mappa di consenso di 3,5 Å. Il modello atomico è stato generato utilizzando la struttura^{cristallina 9} nella mappa EM, seguito da raffinamento nello spazio reale in Phenix^14,15 e aggiustamento manuale in Coot¹⁶, che ha prodotto la struttura ASNS consenso finale come^{descritto 6}.

2. Esecuzione di analisi di variabilità 3D (3DVA)

1. Usa la pila di particelle e la maschera (non una mappa finale perfezionata) per un raffinamento finale
   NOTA: Spesso, i risultati di un lavoro di raffinamento non uniforme vengono utilizzati per il 3DVA.
2. Crea un lavoro di variabilità 3D in CryoSPARC. Input particle stack e mask dal lavoro di raffinamento non uniforme.
3. Imposta il numero di modalità da risolvere: numero di componenti principali (PC) a 5.
   NOTA: Poiché le strutture macromolecolari esistono nello spazio tridimensionale, generalmente sono necessari almeno tre PC per descrivere i loro principali modi di movimento spaziale. Per garantire che variazioni conformazionali aggiuntive, potenzialmente minori ma funzionalmente rilevanti, non venissero trascurate, furono inclusi altri due PC.
4. Imposta la risoluzione del filtro a 4,0 Å e la risoluzione highpass a 20. Lascia tutti gli altri parametri come predefiniti. Inizia il lavoro.
   NOTA: La "risoluzione del filtro" di 4,0 Å è stata impostata per corrispondere alla qualità complessiva del dataset evitando l'overfitting al rumore ad alta frequenza. Poiché la mappa di consenso finale è stata determinata a una risoluzione di 3,5 Å, applicando una risoluzione del filtro leggermente inferiore (4,0 Å) si è assicurata che l'analisi di variabilità si concentrasse su movimenti strutturali reali piuttosto che su rumore vicino al limite di risoluzione.
5. Ottenere un insieme di volumi di variabilità come output (Figura 2A)

3. Esecuzione della visualizzazione 3D della variabilità

1. Crea un lavoro di visualizzazione della variabilità 3D in CryoSPARC per visualizzare i cambiamenti conformazionali continui identificati dal 3DVA.
2. Inserisci lo stack di particelle e i volumi di variabilità generati dal lavoro 3DVA.
3. Seleziona Semplice come modalità di uscita (vedi sotto).
4. Imposta la risoluzione del filtro a 4.0 e la risoluzione highpass a 20. Lascia tutti gli altri parametri ai valori predefiniti. Inizia il lavoro.
5. Ottieni 20 mappe di variabilità come risultato (frame da 0 a 19) corrispondenti a 5 componenti principali (PC) da 0 a 4 (Figura 2B)
   NOTA: La "modalità semplice" nel programma 3D Variability Display fornisce una visualizzazione diretta dei cambiamenti conformazionali lungo ogni componente principale. Questa modalità genera traiettorie lineari tra gli stati estremi identificati dalla 3DVA, consentendo un'interpretazione chiara e diretta dei movimenti all'interno della popolazione di particelle.

4. Preparazione dei dati per i film e raffinamento delle variabili 3D Phenix

1. Scarica mappe di variabilità 3DVA: scarica i file zip contenenti mappe di variabilità per PC 0-4 (cinque zip in totale) da CryoSPARC.
2. Organizza le directory: Crea una cartella genitore (ad esempio, 3DVA/). All'interno, crea una sottocartella per ogni componente principale (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
3. Sposta ogni zip nella cartella corrispondente e sblocca il contenuto.
4. Conferma che ogni cartella contenga 20 mappe di variabilità (frame 0-19) e ripeti per comp1-comp4.
   NOTA: Mantenere cartelle separate per ogni componente principale per evitare di mescolare i frame tra i PC.

5. Prepara film rapidi in UCSF Chimera (Opzionale) ¹⁷

1. Apri lo strumento Serie di Volumi: Avvia Chimera, poi naviga su Strumenti → Dati di Volume → Serie di Volumi. Si aprirà una nuova finestra della Serie di Volumi .
2. Carica le mappe: Clicca su Apri e seleziona le 20 mappe corrispondenti a un componente principale (ad esempio, comp0).
3. Regola i parametri di visualizzazione: apri il Volume Viewer, imposta la soglia di densità appropriata e assegna un colore alla mappa.
   NOTA: In questo esempio è stato usato il blu cielo (Figura 3).
4. Movimento di anteprima: nella finestra della Serie di Volumi , imposta la direzione di riproduzione su Oscilla, poi clicca su Riproduzione per visualizzare una transizione continua dal frame 0 → 19 → 0.
5. Ripeti per componenti aggiuntivi: ripeti i passaggi 5.2-5.4 per gli altri componenti principali secondo necessità.
6. Genera un file video usando input da riga di comando: esporta un filmato aprendo la riga di comando Chimera ed eseguendo il Supplementary Coding File 1.
   NOTA: La serie mrc per componente a 20 frame (ad esempio, compX_frame000-019.mrc) sono gli input per il raffinamento delle variabili 3D Phenix. Tieni separate le cartelle component (comp0-comp4) per evitare di mescolare i frame tra i PC.

6. Generazione di modelli tramite raffinamento della variabilità in phenix

NOTA: Phenix.varref può essere eseguito da qualsiasi directory purché siano specificati i percorsi completi verso le mappe di input e il modello. Tuttavia, per chiarezza organizzativa, si raccomanda di eseguire il perfezionamento in una sottodirectory dedicata per ogni PC.

1. Copia il file finale del modello consenso raffinato nella sottodirectory corrispondente a ciascun PC.
2. Da ogni sottodirectory, esegui Phenix.varref dalla riga di comando usando la seguente sintassi:
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc risoluzione=4 nproc=20 models_per_map=50
3. Imposta la risoluzione a 4.0 Å per corrispondere alla risoluzione effettiva delle mappe 3DVA
4. Imposta nproc al numero di processori disponibili (20 in questo esempio, ma questo può variare a seconda delle risorse computazionali disponibili)
5. Imposta models_per_map a 50 modelli (di default).
   NOTA: Per ogni mappa vengono generati 50 modelli con vincoli regolati in base alla risoluzione dei dati 3DVA. Il modello più adatto per ogni mappa viene automaticamente mantenuto. Il file di output risultante contiene 20 modelli raffinati corrispondenti alle 20 mappe di variabilità. L'output consiste in un bundle PDB contenente 20 modelli raffinati, insieme a singoli file mappa.
6. Non applicare ulteriori affilazioni della mappa durante il raffinamento della variabilità. Usa le mappe di variabilità generate da CryoSPARC (filtrate a 4,0 Å) direttamente come input per phenix.varref.

7. Visualizzazione

1. Apri il bundle PDB in ChimeraX¹⁸ per caricare contemporaneamente tutti e 20 i modelli raffinati.
2. Usa il pannello Modelli per visualizzare selettivamente singoli fotogrammi o modelli specifici di interesse per confronto e analisi (Figura 4). In alternativa, ogni modello raffinato può essere aperto singolarmente anche in ChimeraX o Chimera.

8. Preparazione dei dati per l'analisi

NOTA: Eseguire la sintassi sopra genera un bundle PDB contenente 20 modelli variabili e ogni mappa individuale. Per la maggior parte delle analisi, sono necessari solo due modelli - corrispondenti al frame 0 e al frame 19, poiché rappresentano i due stati conformazionali estremi lungo la componente principale (PC) selezionata.

1. Apri il bundle PDB in ChimeraX, seleziona il modello 1.1 (frame 0) e il modello 1.20 (frame 19) e salva ogni modello come file PDB separato (Figura 4).
2. Modifica i file PDB risultanti per isolare i residui di interesse. Questo può essere fatto manualmente o usando Phenix.pdb.tools.
3. Confronta i due file PDB modificati per identificare i cambiamenti conformazionali nella backbone o nelle side chain.
4. Per confrontare i due modelli PDB, sovrappongiamo le strutture modificate usando la funzione MatchMaker in Chimera.
   NOTA: Per un allineamento affidabile, MatchMaker richiede tipicamente almeno 10-15 residui sovrapposti. Nel nostro caso, sono stati analizzati solo 6 residui; tuttavia, la sovrapposizione di successo fu ottenuta sfruttando la natura omodimerica dell'ASNS: mentre solo 6 residui rimanevano nella catena A, la catena B era intatta e serviva come riferimento per l'allineamento.

Results

Questa sezione presenta output rappresentativi generati dall'analisi della variabilità 3D (3DVA) e dal flusso di lavoro di raffinamento della variabilità e fornisce indicazioni sulla loro interpretazione. La sintetasi di asparagina umana (ASNS) viene utilizzata come dataset illustrativo per dimostrare risultati positivi, artefatti comuni e analisi comparative rese possibili dal protocollo. L'insieme completo di mappe di variabilità derivate da 3DVA e i relativi modelli raffinati generati dai dataset ASNS sono stati depos...

Discussion

Fasi critiche del protocollo e punti decisionali
L'uso efficace di questo protocollo dipende da diversi passaggi chiave del flusso di lavoro. La qualità dello stack di particelle e della maschera usata per il raffinamento crio-EM finale è fondamentale, poiché l'analisi di variabilità 3D (3DVA) opera direttamente su questi ingressi invece che su una mappa post-elaborata. La selezione del numero di componenti principali (PC) dovrebbe riflettere la dimensione del dataset...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Struttura Biotechnology	https://cryosparc.com	Software per l'elaborazione crio-EM
Phenix v1.24+	Consorzio Phenix	https://phenix-online.org	Software per il raffinamento della variabilità
UCSF Chimera	Risorsa per Biocomputing, Visualizzazione e Informatica, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	Software per la visualizzazione molecolare
UCSF ChimeraX	Risorsa per Biocomputing, Visualizzazione e Informatica, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software per la visualizzazione molecolare
CPPTRAJ	Suite software per la dinamica molecolare AMBER	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	Strumenti Python per il calcolo RMSF
Linux Workstation (sistema basato su GPU assemblato internamente)
Custodia per workstation	Supermicro	https://www.supermicro.com	Custodia workstation: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassis
CPU	Intel	https://www.intel.com	CPU: XEON E5-2690V3 x2
Scheda madre	Supermicro	https://www.supermicro.com	Scheda madre: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Scheda madre X10DAI-O
Memoria	Cruciale	https://www.crucial.com	Memoria: Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC registrato. Memoria server a 288 pin CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Hard disk	Western Digital	https://www.westerndigital.com	HDD: WD RE 4TB Hard Drive Aziendale
RAID CONTROLLER	LSI Logica	https://www.broadcom.com	CONTROLLER RAID: Kit lsi logic MegaRAID SAS 9271-8i
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Scheda Quadro M6000 con 24 GB di memoria GDDR5