Caratterizzazione dell'attassia indotta dal tumore in un modello murino con Schwannoma vestibolare

Sommario

Abbiamo sviluppato un panel di saghi comportamentali per studiare l'attassia indotta dal tumore e per valutare terapie che preservano la funzione neurologica in un modello murino di schwannoma vestibolare.

Abstract

La schwannomatosi correlata a NF2 (NF2-SWN) è una sindrome da predisposizione tumorale autosomica dominante causata da mutazioni germinali nel gene soppressore tumorale NF2. La malattia è caratterizzata dallo sviluppo di schwannomi vestibolari bilaterali (SV), che si ingrandiscono progressivamente e causano perdita dell'udito, squilibri e sintomi di attassia che influenzano profondamente la qualità della vita dei pazienti. Attualmente non sono disponibili trattamenti farmacologici approvati dalla FDA. Tra i deficit neurologici, l'attassia rimane una manifestazione particolarmente debilitante ma poco studiata, principalmente a causa della mancanza di modelli preclinici solidi per la sua valutazione. In questo studio, abbiamo sviluppato una serie di saghi comportamentali per valutare sistematicamente l'atassia indotta dal tumore in un modello topo ortopico di perdita uditiva e atassia associate al VS. Questi test permettono una misurazione quantitativa dei deficit di equilibrio e coordinamento motorio derivanti dal carico tumorale. Questa piattaforma sperimentale consente studi meccanicistici sulla disfunzione cerebellare indotta dal tumore e fornisce uno strumento prezioso per la valutazione preclinica delle strategie terapeutiche. Integrando valutazioni comportamentali con la biologia tumorale e i test dell'udito, questo approccio facilita la caratterizzazione sia degli effetti soppressivi del tumore sia di quelli neuroprotettivi. In definitiva, questi saghi offrono un quadro versatile che può essere applicato anche ad altri disturbi neurologici caratterizzati da atassia, ampliandone l'utilità oltre NF2-SWN.

Introduzione

La schwannomatosi correlata a NF2 (NF2-SWN) è una rara sindrome di predisposizione tumorale ereditaria dominante causata da mutazioni nel gene soppressore tumorale NF2, che codifica per la proteina citoscheletrice^{merlin 1}. La perdita della funzione Merlin interrompe le vie di segnalazione che regolano proliferazione cellulare, aderenza e sopravvivenza, predisponendo gli individui colpiti allo sviluppo di tumori benigni multipli del sistema nervoso. La caratteristica distintiva di NF2-SWN è la formazione di schwannomi vestibolari bilaterali (VS) - tumori non maligni derivati dalle cellule di Schwann che si formano lungo i nervi vestibolococcleri. Questi tumori si ingrandiscono progressivamente, comprimendo le strutture neurali adiacenti e portando a perdita dell'udito neurosensoriale, acufene e disfunzione del nervo^{facciale 2}.

I pazienti con VS bilaterale subiscono frequentemente danni progressivi al nervo vestibolare e all'apparato vestibolare dell'orecchio interno, con conseguente disfunzione vestibolare debilitante manifestata da squilibrio cronico, atassia e instabilità dell'andatura, che compromettono gravemente la mobilità e la qualità della^{vita 3}. Il grado di disfunzione vestibolare spesso è correlato al carico tumorale e al coinvolgimento nervoso. Questi sintomi spesso persistono anche dopo il controllo del tumore o gli sforzi di preservazione dell'udito, suggerendo meccanismi neurobiologici complessi oltre la compressione^{meccanica 4,5}. Sebbene strumenti clinici come inventari per disabilità da vertigini, analisi dell'andatura, test del riflesso vestibolo-oculare (VOR) e posturografia vengano utilizzati per quantificare l'insuffisione vestibolare, i meccanismi sottostanti dell'atassia indotta dal tumore restano poco^compresi. Nonostante i progressi nella comprensione molecolare e l'introduzione di terapie mirate come il bevacizumab, non esiste ancora un trattamento approvato dalla FDA che preservi in modo affidabile sia la funzione uditiva che quella dell'equilibrio nei pazienti con NF2-SWN. La gestione dei sintomi vestibolari rimane in gran parte di supporto, evidenziando un importante bisogno clinico insoddisfatto.

Un ostacolo importante al miglioramento della gestione clinica dell'atassia associata al VS è la mancanza di modelli preclinici che riproducano fedelmente i deficit di coordinazione vestibolare e motoria osservati nei pazienti. La maggior parte dei modelli animali esistenti di VS si concentra sulla crescita tumorale o sulla perdita uditiva, senza ripetere i caratteristici disturbi dell'equilibrio e della coordinazione. Inoltre, i saggi comportamentali standardizzati per valutare oggettivamente atassia e disfunzione vestibolare in contesti preclinici non sono ben stabiliti. Questa lacuna ostacola l'indagine meccanicistica e limita la valutazione delle terapie candidate volte a preservare la funzione vestibolare.

Qui riportiamo lo sviluppo di un modello murino VS che mostra fenotipi misurabili di atassia, insieme a un panel di saghi comportamentali specificamente progettati per quantificare l'atassia indotta dal tumore. Questo modello fornisce una piattaforma molto necessaria per indagare i meccanismi alla base della disfunzione vestibolare associata al VS e per valutare l'efficacia degli interventi terapeutici volti a ripristinare l'equilibrio, la coordinazione e la funzione neurologica complessiva nei pazienti con NF2-SWN.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con il protocollo approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali del Massachusetts General Brigham (MGB).

1. Modello animale

1. Inoculare cellule Nf2^-/- (cellule murine Nf2^-/- cellule di Schwann che esprimono il gene segnalatore della luciferasi Gaussia, Gluc) in topi immunocompetenti C57/FVB. Utilizzando un dispositivo di iniezione stereotatattica (Figura 1A), iniettare ogni topo con 1 μL di 2.500 cellule tumorali nella regione CPA dell'emisfero^{destro 4,6}.
2. Utilizzare sia maschi che femmine (rapporto 1:1) di età compresa tra 8 e 12 settimane per garantire una potenza statistica sufficiente e per esaminare eventuali differenze legate al sesso. Topolini domestici in gruppi di 4 per gabbia in un ciclo di 12 ore di luce e buio, con cibo e acqua disponibili ad libitum.
   NOTA: Dato che gli schwannomi si sviluppano nei nervi vestibolari dei pazienti, abbiamo utilizzato il modello dell'angolo cerebelopontino (CPA). Il modello CPA ricapitola il microambiente intracranico delle VS.
3. Gruppo Sham: Per valutare gli effetti della chirurgia sugli animali e dell'impianto di cellule tumorali sull'attassia, includere un gruppo di chirurgia simulata, in cui i topi sono stati sottoposti a chirurgia fittizia e iniezione di soluzione salina nella regione CPA.
4. Includere un gruppo di topi non portanti tumori come controllo.
5. Per monitorare la progressione tumorale, utilizzare cellule ^Nf2-/- che esprimono il gene rapportatore della Gaussia luciferasi (Gluc) e misurare il Gluc plasmatico ogni 3 giorni dopo l'impianto.
6. Per un breve tratto, raccogliere 13 μL di sangue nei tubi EDTA per prevenire la coagulazione. Trasferire il campione di sangue su una piastra a 96 pozzi e misurare l'attività della Gluc come descritto^{in precedenza} 6,7,8,9.

2. Test dell'attassia

1. Eseguire i quattro saghi comportamentali in una sequenza fissa per minimizzare la variabilità tra gli animali. Eseguire i test nell'ordine seguente: (1) test di chiusura degli arti posteriori, (2) test del bordo di cornicione, (3) valutazione dell'andatura e (4) valutazione della cifosi. Prevedi un intervallo minimo di riposo di 2-5 minuti tra un test e l'altro riportando il topo nella sua gabbia di casa. Monitorare l'animale durante i periodi di riposo e procedere al test successivo solo quando il comportamento esplorativo normale riprende. Interrompere i test se si osservano segni di stress o affaticamento eccessivo. Completare l'intero set di quattro saghi sull'attassia per una coorte di 10 topi entro circa 45-60 minuti, inclusi intervalli di riposo tra un test e l'altro.
2. Test di chiusure dell'arto posteriore
   NOTA: Il test di serratura dell'arto posteriore valuta la coordinazione neuromuscolare, il tono motorio e il controllo posturale nei topi. I topi con ataxi mostrano una ritrazione o una stretta degli arti posteriori verso l'addome, riflettendo una coordinazione motoria compromessa e una regolazione del tono^{muscolare 5}.
   1. Afferra delicatamente il topo per la base della coda, assicurandoti una presa sicura ma leggera per evitare disagio. Sostieni brevemente l'animale sul coperchio della gabbia o sulla mano prima di sollevarlo per ridurre la risposta di spavento.
   2. Solleva lentamente il topo in modo che sia sospeso in aria con il corpo completamente esteso e libero da qualsiasi ostacolo. Tieni il topo almeno 10 cm sopra la gabbia o la superficie di prova.
   3. Mantieni la posizione sospesa per circa 10 secondi e osserva la posizione degli arti posteriori e della coda senza ruotare o oscillare l'animale.
   4. Valuta la postura degli arti posteriori come descritto di seguito.
      1. Identifica una postura normale quando entrambi gli arti posteriori si estendono verso l'esterno e lontano dall'addome.
      2. Identificare una postura anomala quando uno o entrambi gli arti si ritraggono verso l'addome o si incrociano l'uno sull'altro, indicando una stretta degli arti posteriori associata a ataxi o compromissione neurologica.
   5. Registra il comportamento utilizzando un sistema di punteggio predefinito o cattura un breve video per un'analisi post-hoc in cieco.
      NOTA: Limita ogni test a ≤10 s per minimizzare lo stress.
3. Test del bordo
   NOTA: Il test del bordo valuta l'equilibrio, la coordinazione e il controllo motorio fine nei topi. Misura la capacità dell'animale di camminare lungo una sporgenza stretta e scendere in sicurezza fino alla gabbia senza perdere l'equilibrio. I topi con disfunzione cerebellista o ataxi vestibolare tipicamente mostrano scivolate, cadute o postura instabile durante questo^{compito 5}.
   1. Posiziona la gabbia su una superficie stabile e piana all'altezza della panchina (~1 m).
   2. Collega un'estremità della gabbia di prova (Figura 1C) alla custodia (Figura 1D), assicurandosi che non ci siano spazi verticali o ostruzioni tra le gabbie, permettendo al topo di scendere in modo fluido e naturale nella sua gabbia di origine senza saltare o cadere.
   3. Posizionare una videocamera su un treppiede rivolto verso il bordo a un angolo di 30°-45° per catturare sia il movimento laterale che la discesa.
   4. Regola l'illuminazione per minimizzare il riflesso e garantire una chiara visibilità degli arti e della coda del topo.
   5. Solleva delicatamente il topo per la base della coda e sorreggilo con l'altra mano. Posiziona il topo al centro della sporgenza in modo che tutte e quattro le zampe siano in superficie. Rilascia la coda solo quando il mouse appare bilanciato e vigile.
   6. Permette al topo di camminare liberamente lungo il bordo senza bisogno di richieste esterne. Registra il topo per almeno 10 secondi o finché non scende nella gabbia.
   7. Osserva la sua capacità di mantenere l'equilibrio sul bordo senza scivolare e di camminare lungo il bordo verso la gabbia o la piattaforma.
   8. Esegui tre prove indipendenti per mouse, con un intervallo di riposo di ~2 minuti tra una prova e l'altra. Pulisci la superficie del bordo tra gli animali usando etanolo al 70% per rimuovere i segnali olfattici.
   9. Effettuare tutti i test in un ambiente silenzioso, con illuminazione costante e rumori di fondo o vibrazioni minime. Evita di ripetere il test in modo eccessivo lo stesso giorno, poiché la stanchezza e gli effetti dell'apprendimento possono influenzare le prestazioni.
4. Valutazione dell'andatura
   NOTA: Il test di valutazione dell'andatura valuta la coordinazione locomotoria, il pattern delle falcate e la stabilità posturale nei topi in movimento libero. I topi con attassia spesso mostrano una lunghezza del passo accorciata, movimenti instabili e una posizione irregolare delle zampe, indicando deficit di coordinazione e controllo^{dell'equilibrio 5}.
   1. Costeggia una pista dritta e piatta con carta bianca (8,5 × 11 pollici). Metti la gabbia di casa alla fine del foglio per incoraggiare il topo a camminare sopra il foglio.
   2. Ricoprire leggermente le zampe anteriori e posteriori con due colori contrastanti (ad esempio, blu per le zampe anteriori, rosso per quelle posteriori) usando un tappeto d'inchiostro non tossico (Figura 1E).
   3. Posiziona il topo all'estremità iniziale della pista e lascialo camminare liberamente sulla carta senza interventi esterni.
   4. Osserva e misura i seguenti parametri:
      Lunghezza del passo: la distanza tra le successive posizioni della stessa zampa.
      Larghezza della base: la distanza laterale tra le impronte posteriori sinistra e destra.
   5. Esegui due o tre esecuzioni per mouse, permettendo un riposo tra un test e l'altro.
      NOTA: Usa inchiostro non tossico ad asciugatura rapida e assicurati che solo i cuscinetti delle zampe siano rivestiti con un rivestimento. Sostituisci la carta dopo ogni prova per evitare che si spalmi. Applica l'inchiostro con parsimonia per evitare che le impronte sfocano, poiché un eccesso di inchiostro riduce la precisione delle misurazioni del passo.
5. Valutazione della cifosi
   NOTA: La valutazione della cifosi valuta l'allineamento spinale e le anomalie posturali durante la locomozione naturale. I topi con disfunzione neurologica o muscolare spesso mostrano una curvatura dorsale persistente o curvatura della colonna^vertebrale.
   1. Posiziona il topo su una superficie e lascialo camminare o esplorare liberamente per alcuni secondi. Evita di spaventare l'animale, poiché movimenti improvvisi potrebbero modificare temporaneamente la postura.
   2. Registra un breve video dalla vista laterale per documentare la curvatura del tronco.
   3. Osserva la postura del topo durante la camminata, concentrandoti sull'allineamento della colonna vertebrale e sulla curvatura del tronco come descritto di seguito.
      1. Identifica la postura normale quando il topo mantiene la schiena dritta o leggermente arcuata con movimenti del corpo fluidi.
      2. Identificare una postura anomala quando il topo mostra cifosi, caratterizzata da una colonna vertebrale anormalmente curva o curva, un tronco rigido e una flessibilità ridotta durante l'andatura.

3. Analisi del test dell'attassia

NOTA: Eseguire tutta la valutazione comportamentale da parte di un osservatore accecato, accecato, all'assegnazione di gruppo sperimentale per minimizzare il bias dell'osservatore.

1. Punteggio dei test sul bordo
   1. Assegna un punteggio di 3 se il topo cammina dolcemente lungo la sporgenza, mantiene l'equilibrio e scende nella gabbia senza scivolare.
   2. Assegna un punteggio di 2 se il topo mostra lievi disabilità, come esitazione o un piccolo scivolamento della zampa, ma si riprende e scende in sicurezza.
   3. Assegna un punteggio di 1 se il topo mostra un comportamento moderato, inclusi frequenti scivolate, postura accovacciata, uso eccessivo della coda per mantenere l'equilibrio o una discesa ritardata.
   4. Assegna un punteggio di 0 se il topo mostra gravi discapacità, non riesce a mantenere l'equilibrio, cade dal bordo o si rifiuta di muoversi.
2. Punteggio del test di chiusura dell'arto posteriore
   1. Assegna un punteggio di 3 se il mouse mostra costantemente gli arti posteriori aperti verso l'esterno senza segni di agganciamento.
   2. Assegnare un punteggio di 2 se il topo mostra un lieve deficit, come una retrazione intermittente di un arto posteriore.
   3. Assegnare un punteggio di 1 se il topo mostra un compromisso moderato, caratterizzato da una retrazione parziale di entrambi gli arti posteriori mantenuti vicino all'addome.
   4. Assegnare un punteggio di 0 se il topo mostra gravi compromettimenti, con entrambi gli arti posteriori strettamente serrati contro l'addome per la maggior parte del periodo di osservazione.
3. Punteggio del passo
   1. Assegna un punteggio di 3 se il topo cammina con un'andatura costante e coordinata e si muove in linea retta.
   2. Assegna un punteggio di 2 se il topo mostra una lieve menocrazia, come camminare lentamente con lieve instabilità o deviazione laterale, zoppicare da un lato o percorrere percorsi ampi e circolari.
   3. Assegna un punteggio di 1 se il topo mostra un comportamento moderato, inclusi chiari disturbi dell'andatura, camminare con solo due o tre zampe, trascinare parte del corpo o muoversi in cerchi stretti.
   4. Assegnare un punteggio di 0 se il topo mostra gravi disabilità, non riesce a camminare efficacemente, rimane fermo o mostra movimenti incontrollati di rotolamento laterale.
4. Punteggio per la cifosi
   1. Assegna un punteggio di 3 se il mouse rimane piatto, dritto e schienale sia durante il riposo che durante la camminata.
   2. Assegna un punteggio di 2 se il topo mostra lieve deterioramento, con una leggera curvatura della schiena a riposo che si raddrizza durante il movimento.
   3. Assegnare un punteggio di 1 se il topo mostra un comportamento moderato di deterioramento, con la schiena moderatamente curva a riposo che rimane curva durante la camminata.
   4. Assegnare un punteggio di 0 se il topo mostra gravi disabilità, con una schiena fortemente curva durante tutto il periodo di osservazione che limita il movimento normale.

4. Valutazione dell'affidabilità tra valutatori

1. Allenare gli osservatori utilizzando video rappresentativi di esempio prima della valutazione formale per standardizzare l'interpretazione dei criteri di punteggio.
2. Per minimizzare il bias dell'osservatore, valuta tutti i test comportamentali indipendentemente da due osservatori addestrati ciechi al gruppo di trattamento e al punto temporale sperimentale.
3. Quantificare l'affidabilità inter-valutatori per ogni saggio comportamentale utilizzando il coefficiente kappa di Cohen. Interpretare i valori dei kappa come segue: <0,40, scarso accordo; 0,40-0,60, accordo moderato; 0,60-0,80, accordo sostanziale; e >0,80, quasi perfetto accordo.
4. Risolvere eventuali discrepanze di punteggio tramite una revisione congiunta dei video registrati e raggiungere un punteggio^{consensuale di 5}.

Risultati

La crescita tumorale CPA causa atassia nel modello murino VS

Per valutare l'attassia indotta dal tumore, abbiamo stabilito due coorti sperimentali. Per prima cosa, per valutare gli effetti della chirurgia animale e dell'impianto di cellule tumorali sull'atassia, i topi sono stati sottoposti a chirurgia fittizia e iniezione di soluzione salina nella regione CPA. I sintomi di attassia nei topi del gruppo sham sono stati confrontati con quelli nei topi di controllo non operati. N...

Discussione

I saggi comportamentali descritti qui forniscono un quadro solido e quantitativo per valutare attassia e deficit di coordinazione motoria nei modelli murini di SV e disturbi vestibolari correlati. Adattati da protocolli consolidati per modelli di malattie neurodegenerative, come la malattia di Huntington e l'attassi spinocerebelare¹⁰, questi test sono particolarmente adatti per caratterizzare la disfunzione vestibolare indotta dal ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siero bovino fetale	ThermoFisher	A5670701
Luminometro a micropiastre GloMax 96	Promega	GM3000
Sottopad blu della procedura McKesson	McKesson	75402
Integratore di crescita delle cellule di Schwann	ScienCell	1752