Articolo metodologico

Campionamento del DNA ambientale da navi per l'osservazione delle balene per il monitoraggio dei cetacei

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DOI:

10.3791/70334

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10 aprile 2026

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro standardizzato per la raccolta di campioni di DNA ambientale dei cetacei (eDNA) da navi per l'osservazione delle balene. La fattibilità per ricercatori e scienziati cittadini formati è prioritaria, mentre le condizioni ambientali, i tempi di filtrazione, la torbidità e la logistica a bordo definiscono i limiti pratici della sua applicazione.

Abstract

Il DNA ambientale (eDNA) offre un approccio non invasivo per il monitoraggio dei cetacei, ma la sua ampia applicazione da piattaforme operative richiede flussi di lavoro di campionamento standardizzati e fattibili. Questo studio descrive un protocollo per la raccolta dell'eDNA dei cetacei da navi per l'osservazione delle balene, progettato per l'implementazione da parte di ricercatori e scienziati cittadini formati in condizioni ambientali e logistiche definite. L'approccio integra la raccolta di acqua di mare mirata tramite impronte fluke, la filtrazione a bordo con filtri autoconservanti e analisi molecolari a valle per supportare la generazione operativa di dati fattibile in condizioni reali. Il protocollo è stato implementato durante campagne coordinate sul campo condotte nel 2024 in tre regioni dell'Atlantico del Nord e del Mar Mediterraneo (Islanda, Portogallo e Italia), comprendendo più taxa di cetacei. Le prestazioni del metodo sono state valutate utilizzando un nuovo saggio quantitativo PCR specifico per specie, che ha colpito il DNA mitocondriale della megattera (Megaptera novaeangliae), dimostrando tassi di rilevamento costanti in condizioni ambientali e logistiche variabili. Fornendo indicazioni pratiche per l'implementazione sul campo e il controllo della contaminazione, questo protocollo supporta il monitoraggio dei cetacei basati su eDNA riproducibile e facilita la comparabilità interregionale negli studi sulla biodiversità marina.

Introduzione

Una gestione efficace della conservazione della megafauna marina, inclusi cetacei e altre specie di ampia diffusione, è fondamentale per la protezione della biodiversità. Come predatori di vertice e ingegneri degli ecosistemi, i cetacei contribuiscono alla regolazione trofica, al ciclo dei nutrienti e alla resilienza ecologica nei bacinioceanici 1. Tuttavia, generare conoscenze ecologiche complete per queste specie altamente mobili rimane una sfida e spesso si basa su programmi di monitoraggio ad alta intensarisorsa. Approcci convenzionali, come il campionamento tramite biopsia, l'identificazione fotografica, il monitoraggio acustico passivo, la telemetria satellitare e i rilievi aerei, hanno fornito informazioni fondamentali sull'ecologia dei cetacei 3,4,5,6,7, tuttavia questi metodi sono spesso costosi, logisticamente impegnativi, spazialmente vincolati o invasivi e soggetti a una rigorosa supervisione eticae normativa 8. Di conseguenza, la frequenza di campionamento, la copertura geografica e le opportunità di partecipazione degli stakeholder sono spesso limitate, specialmente per lo studio di specie a vasta distribuzione o rare.

Il campionamento del DNA ambientale (eDNA, definito come materiale genetico rilasciato dagli organismi nel loro ambiente) è emerso come uno strumento potente e non invasivo per rilevare specie acquatiche da campionid'acqua 9,10. I test PCR quantitativi specifici per specie (qPCR) che mirano a frammenti di DNA mitocondriale permettono una rilevazione altamente sensibile e specifica dei taxa marini, inclusii cetacei 11,12,14. Oltre al rilevamento di presenza/assenza, la potenza relativa del segnale di eDNA e le sequenze di DNA bersaglio forniscono informazioni preziose relative alla prossimità, all'abbondanza relativa e ai modelli genetici a livello dipopolazione 15,16,17,18,19. Inoltre, i campioni ambientali raccolti vicino alle balene contengono frequentemente DNA di taxa coesistenti, inclusi specie di preda, simbionti e parassiti, supportando associazioni ecologiche piùampie 20,21,22. Collettivamente, questi progressi dimostrano il potenziale degli approcci basati sull'eDNA per integrare i metodi tradizionali ed espandere l'ambito della ricerca sui cetacei nei sistemimarini 23,24.

Nonostante questi vantaggi, il monitoraggio basato sull'eDNA della megafauna marina affronta sfide persistenti legate al campionamento rappresentativo, alla copertura spaziale e alla riproducibilità metodologica, in particolare nei sistemi marini aperti dove il DNA si diluiscerapidamente 25,26 e le specie target hanno ampie aree e si trovano a basse densità. Affrontare questi vincoli richiede framework di campionamento scalabili e operativamente fattibili che possano essere applicati su ampie scale spaziali e temporali. Le iniziative di citizen science si sono dimostrate efficaci nell'espandere la raccolta di dati ecologici promuovendo al contempo il coinvolgimento pubblico nella conservazione marina, rendendole così una via promettente per il monitoraggio su larga scala basato sull'eDNA 27,28,29,30. Le navi per l'osservazione delle balene rappresentano una piattaforma poco utilizzata ma altamente adatta per il campionamento di eDNA, offrendo accesso regolare agli habitat dei cetacei attraverso stagioni eregioni 31,32,33. L'industria globale dell'osservazione delle balene supporta ampie retioperative 34, e studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di raccogliere eDNA dei cetacei da altre piattaforme opportuniste, come navi commerciali, traghetti35, e attraverso campionamenti mirati integrati con fotoidentificazione e osservazionicomportamentali 36,37. La rapida espansione della ricerca sull'eDNA ha portato a notevoli innovazioni metodologiche, tuttavia la variabilità biologica tra i sistemi marini e il ritmo dei progressi tecnologici complicano gli sforzi per armonizzare i protocolli e garantire la comparabilità tra gli studi. Metodologie di campo standardizzate ma adattabili sono quindi essenziali, in particolare per le iniziative di monitoraggio multinazionali su largascala.

Il rilevamento dell'eDNA è influenzato dal volume d'acqua filtrato, dalla strategia di filtrazione, dal materiale filtrante e dalla dimensione dei pori. Il filtraggio di volumi maggiori generalmente aumenta la resa di eDNA e la probabilità di rilevamento per i bersagli vertebrati, inclusii cetacei 39,40,41,42. In acque produttive o torbide, tuttavia, l'efficienza di filtrazione può essere limitata da un rapido ostruzione del filtro43,44, rendendo necessari compromessi tra volume raggiungibile e fattibilitàoperativa 45,46. Il campionamento dalle impronte di fluke-ray — il disturbo superficiale creato dal colpo della coda di balena — ha dimostrato costantemente di aumentare la rilevabilità dell'eDNA dei cetacei, poiché il materiale biologico recentemente disperso è concentrato vicino allasuperficie 24,41,42,47,48. L'uso di sistemi di filtrazione chiusi e autoconservanti riduce i passaggi di gestione e i rischi di contaminazione, rendendoli particolarmente adatti per applicazioni di citizenscience 38,42. Inoltre, l'inclusione di repliche biologiche e controlli di routine sul campo minimizza i guasti di rilevamento e migliora l'affidabilità deidati 49,50,51.

Sviluppo e validazione del protocollo
Il progettoeWHALE 52 è un'iniziativa transnazionale che integra ricercatori, operatori di whale-watching e cittadini scienziati in tutta Europa per monitorare la megafauna marina utilizzando eDNA. Gli sforzi di campionamento hanno preso di mira più taxa di cetacei nel Mar Atlantico del Nord e del Mar Mediterraneo, utilizzando un protocollo centrale con adattamenti specifici per regione per tenere conto delle condizioni ambientali e logistiche locali.

Qui presentiamo un protocollo standardizzato e completo per la raccolta di eDNA dei cetacei da navi da osservazione delle balene, perfezionato attraverso l'analisi di 308 campioni di eDNA di acqua di mare, inclusi due repliche per campione e 21 controlli sul campo, raccolti durante campagne coordinate sul campo nel 2024 nella Baia di Skjálfandi (Islanda), nelle Azzorre (Portogallo) e nel Mar di Ligure (Italia). Il metodo integra la raccolta di acqua di mare mirata tramite flukeprint, la filtrazione a bordo tramite filtri eDNA autoconservanti e analisi molecolari a valle.

Questo protocollo è progettato per essere implementato in condizioni reali di osservazione delle balene da parte di ricercatori formati e scienziati cittadini, dove la filtrazione a bordo può essere effettuata in condizioni di mare calmo o moderato senza interrompere le attività di osservazione delle balene. La sua implementazione richiede il coordinamento con le organizzazioni partecipanti (ad esempio, operatori di whalewatching, organizzazioni non profit, istituti di ricerca) per definire strategie di campionamento e obiettivi di ricerca. Sebbene i parametri fondamentali debbano rimanere fissi per garantire la riproducibilità e lo studio incrociato della comparabilità, possono essere necessari aggiustamenti allineati al protocollo in siti con alta torbidità, moto del vascello o vincoli di tempo, spazio o personale. Tali adattamenti includono il tipo di filtro, il volume di acqua filtrata raggiungibile e le attrezzature ausiliarie. Devono essere applicati in modo coerente all'interno di ogni campagna di campionamento e riportati in modo trasparente. Linee guida operative dettagliate e considerazioni logistiche sono fornite nei passaggi e nella discussione del Protocollo per supportare la qualità dei dati, la trasparenza e la comparabilità regionale.

Progettazione del saggio qPCR
Per valutare le prestazioni del protocollo, è stato amplificato l'eDNA delle megattere (Megaptera novaeangliae), una specie migratrice ben studiata regolarmente incontrata nella baia di Skjálfandi (Islanda)53 e stagionalmente presente nelleAzzorre 54, da campioni raccolti sul campo. I flussi di lavoro di lisi del DNA, estrazione e qPCR sono stati inizialmente ottimizzati tramite un test ad anello interlaboratorio che ha coinvolto quattro laboratori partecipanti al progetto eWHALE, migliorando così la coerenza e l'applicabilità tra le14 istituzioni.

Per rilevare in modo affidabile la presenza di eDNA della megattera, è stato progettato e validato un saggio qPCR specifico per specie MGB (minor groove binder) rivolto alla regione mitocondriale ND5 seguendo le linee guidastabilite 55 (Tabella 1). Sono stati generati primer oligonucleotidici e una sonda utilizzando software per l'allineamento e l'analisi delle sequenzedel DNA 56, con l'obiettivo di massimizzare la specificità della specie e l'efficienza dell'amplificazione (File Supplementare 1-Figura Supplementare S1). La specificità del saggio è stata valutata in vitro utilizzando taxa bersaglio e non bersaglio (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). Le concentrazioni di DNA utilizzate per generare curve standard qPCR sono state quantificate da uno standard di DNA derivato daltessuto 42,57,58,59,60. Il limite di rilevamento (LOD) del saggio, definito come la concentrazione più bassa che produce amplificazioni positive nel 95% dei replici del campione, èstato determinato 11,61. Le rilevazioni di eDNA della megattera sono state valutate per campioni sul campo stimando la proporzione di reazioni positive e la forza del segnale (cioè Soglia del ciclo, valore di Ct) per ogni replica campione attraverso misurazioni qPCR triplice, per tenere conto della variabilità dell'amplificazione e migliorare l'affidabilità dellarilevazione 57,60,62. Le rilevazioni delle specie sono state poi verificate con il sequenziamento bidirezionale di Sanger, seguito dalla conferma tramite analisiBLAST 63.

I dati qPCR sono presentati come la deviazione media ± standard (SD). La significatività statistica tra i gruppi è stata valutata utilizzando il test U non parametrico di Mann-Whitney e il test t a due campioni di Welch. Le differenze sono state considerate significative a p < 0,05. Tutte le analisi sono state effettuate utilizzando il software di analisistatistica 64.

Protocollo

Etica e conformità normativa
Tutti gli sforzi di osservazione dei cetacei e i successivi campionamenti d'acqua devono essere condotti in conformità con le normative nazionali e regionali sulla fauna selvatica. Effettuare campionamenti esclusivamente da navi autorizzate che operano con permessi validi di osservazione o ricerca delle balene. Mantenere le distanze minime di avvicinamento dalla specie target come definite dalle normative locali ed evitare qualsiasi manovra destinata esclusivamente a scopi di campionamento. I campioni di tessuto di balena utilizzati per la validazione dei sami sono stati raccolti con i rispettivi permessi regionali e condivisi tra i partner del progetto eWHALE in conformità con le normative nazionali e istituzionali.

NOTA: Esaminare i seguenti documenti prima di qualsiasi attività di campionamento e raccogliere le attrezzature necessarie: Tabella dei Materiali, Kit di Campionamento eDNA (File Supplementare 1-Figura Supplementare S2), materiali utilizzati per raccogliere campioni di DNA ambientale (Figura 1) e una panoramica dei passaggi di campionamento e del flusso di lavoro di filtrazione a bordo (Figura 2).

1. Preparazione del campionamento di eDNA

  1. Prepara i materiali di documentazione sul campo, inclusi schede dati sul campo e protocollo di campo laminato (File Supplementare 2 e File Supplementare 3).
  2. Prepara guanti di riserva, filtri di riserva (un filtro per ogni replica campione), un marcatore impermeabile e un contenitore dedicato ai rifiuti (Figura 1A).
    NOTA: Utilizzare filtri eDNA autoconservanti chiusi (dimensione dei pori di 1,2 μm) per minimizzare i rischi di manipolazione econtaminazione 65,66.
  3. Prepara uno o più secchi rigidi, adatti al tipo di imbarcazione e alla configurazione a bordo (File Supplementare 1-Figura Supplementare S3).
    1. Segna i secchi a 10 L usando un pennarello permanente. Prepara più secchi più piccoli se maneggiare 10 L non è pratico.
    2. Fissa una corda saldamente al secchio se la portata in mare è limitata.
      NOTA: Utilizzare secchi con coperchio per minimizzare le fuoriuscite quando il movimento del recipiente è eccessivo (Figura 1B).
    3. Prepara un contenitore secondario per eDNA per combinare volumi più piccoli e una scatola di trasporto aggiuntiva per garantire il trasporto privo di contaminazioni dei secchi, se necessario (Figura 1C).
  4. Preparare una pompa d'acqua peristaltica o a vuoto portatile (Figura 1D). Carica completamente la pompa prima dell'imbarco e disconnetti la corrente immediatamente prima dell'uso.
  5. Assegnare ruoli di campionamento, filtrazione e registrazione dati prima della partenza.
    ATTENZIONE: Indossa i guanti durante la manovra di tutte le attrezzature e cambia i guanti tra un compito e l'altro.

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Figura 1: Materiali di lavoro sul campo utilizzati per raccogliere campioni di DNA ambientale. (A) Kit degli attrezzi con filtri eDNA autoconservanti, contenitore per rifiuti, bottiglia di spremibilità con candeggina domestica diluita (1:10), guanti, scheda tecnica sul campo e penna impermeabile; (B) esempi di tipi di secchio per il campionamento di eDNA; (C) esempi di contenitori aggiuntivi per eDNA per il trasporto e il filtraggio di grandi volumi e contenitore per il trasporto dei secchi a bordo; (D) esempi di pompe portatili per la filtrazione dell'acqua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Diagramma concettuale del campionamento ambientale del DNA a bordo delle barche per l'osservazione delle balene. L'illustrazione descrive passaggi guidati, inclusi la raccolta di campioni d'acqua e la filtrazione a bordo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Pulizia delle attrezzature

  1. Indossa i guanti usa e getta prima di pulire.
  2. Prepara una soluzione di candeggina diluendo la candeggina domestica (5-6% di ipoclorito di sodio) 1:10 con acqua purificata (~50 mL per trip).
  3. Applica la soluzione schizzando uniformemente su tutte le superfici su secchi, coperchi, contenitori e tubi della pompa. Mantieni un tempo minimo di contatto con la candeggina di 2-5 minuti su tutte le superfici.
  4. Risciacqua accuratamente con acqua del rubinetto 3 volte (Figura 3).
  5. Asciugare i materiali all'aria in un luogo sicuro e conservarli in un luogo sicuro e pulito prima dell'imbarco.

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Figura 3: Passaggi per la pulizia delle attrezzature. (A) Applicare la soluzione di candeggina domestica diluita (1:10); (B) distribuire uniformemente usando guanti senza DNA; (C) risciacquare accuratamente tre volte con acqua del rubinetto; e (D) ripetere il processo per materiali aggiuntivi se applicabile (ad esempio, contenitori di eDNA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Raccolta di campioni d'acqua

NOTA: Rispettare tutte le normative di sicurezza a bordo di ciascuna nave o piattaforma, incluso l'uso di giubbotti di salvataggio o tute di galleggiamento quando necessario.

  1. Porta tutto il materiale a bordo prima dell'arrivo dei passeggeri e conservalo in un'area designata e pulita.
  2. Coordinare il tempismo del campionamento e il posizionamento dell'imbarcazione con l'equipaggio della nave.
  3. Osservare i modelli di emergenza per anticipare le immersioni delle balene (Figura 4). Metti i guanti nuovi prima di campionare.
  4. Raccogliere 20 L di acqua di mare il prima possibile (non più di 10 minuti in timelapse) dall'impronta dopo le immersioni della balena, per generare due repliche di campioni da 10 L.
  5. Trasportare l'acqua raccolta a una stazione di filtrazione designata a bordo, utilizzando coperchi o un contenitore sterilizzato aggiuntivo per evitare fuoriuscite (se necessario).
  6. Registra l'identità della specie, le coordinate GPS, l'ora e l'ID della replica del campione nel foglio dati.
  7. Cambia i guanti subito dopo aver fatto rapporto.

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Figura 4: Sequenza della megattera che emerge. (A) Soffio di balena; (B) inarca la schiena e solleva la coda prima di tuffarsi; (C) motivo di impronta di flukee in superficie dopo l'immersione della balena. Attribuzione dell'immagine: Ocean Missions (A,B,C, 2024). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Filtrazione dell'eDNA

  1. Apri il sacchetto del filtro e maneggia il filtro solo vicino alla presa (File Supplementare 1-Figura Supplementare S4).
  2. Inserisci l'ingresso nello snorkel e collega il tubo della pompa all'uscita (Figura 5A,B).
  3. Immergi lo snorkel nel campione d'acqua senza immergere la carcassa del filtro (Figura 5C).
  4. Imposta la pompa (vedi Tabella dei materiali per i tipi di pompa) su una portata alta e costante.
  5. Filtra 10 L continuamente monitorando la stabilità del flusso (controlla bolle d'aria, strappi, strappi o guasti di tenuta).
    NOTA: Terminare la filtrazione a una durata massima di 45 minuti.
  6. Inverti il filtro e fai funzionare la pompa per 30-60 secondi per rimuovere l'acqua residua. Conferma che non rimanga umidità visibile nell'alloggiamento del filtro.
  7. Spegni la pompa e scollega il tubo.
  8. Getta lo snorkel nel contenitore dei rifiuti, metti il filtro nella sua busta originale e etichettalo immediatamente.
  9. Conserva i filtri a bordo in un contenitore rigido chiuso o in una scatola di raffreddamento (se la temperatura ambiente > 20 °C), lontano dalla luce solare diretta e dalle aree passeggeri.
  10. Cambia guanti e ripeti la filtrazione per la seconda replica.

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Figura 5: Passaggi per configurare il sistema di filtrazione a bordo. (A) collegare l'ingresso del filtro (parte bianca) allo snorkel (tubo); (B) collegare il tubo della pompa all'uscita del filtro (parte gialla); e (C) immergere parte dello snorkel nel campione d'acqua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Controlli negativi sul campo e segnalazione dei dati

  1. Filtra un controllo negativo di campo ogni cinque campioni di impronta fluke.
  2. Utilizzare l'acqua senza DNA del bersaglio subito dopo il ritorno a riva e prima della pulizia delle attrezzature.
  3. Trasferire tutti i dati nel foglio di calcolo digitale per il campionamento dell'eDNA dopo ogni viaggio (File Supplementare 4).

6. Filtrazione e spedizione

  1. Conserva filtri eDNA autoconservanti in un contenitore sicuro e asciutto in una stanza ombreggiata a temperatura ambiente—o in frigorifero se la temperatura ambiente supera i 20 °C—per non più di 3 mesi prima della spedizione.
  2. Ispeziona visivamente i sacchi filtranti per l'umidità prima della spedizione.
  3. Etichettare e spedire i filtri in contenitori isolati con impacchi di ghiaccio al laboratorio designato.

7. Analisi di laboratorio

NOTA: Eseguire tutte le procedure di laboratorio in stanze dedicate sterilizzate UV con ventilazione adeguata e banchi da lavoro separati per le PCR, utilizzando guanti e indumenti protettivi senza DNA 55,67,68.

  1. Lisi del DNA
    1. Etichetta un tubo di reazione da 2 mL per ogni filtro.
    2. Inserire il filtro in una fiaschetta Erlenmeyer da 200 mL e scartare il coperchio in gomma (Figura 6A).
    3. Utilizzando pinze prive di DNA, piega la membrana (File Supplementare 1-Figura Supplementare S5) in un triangolo e trasferiscila nel tubo di reazione da 2 mL, con la punta orientata verso il basso (Figura 6B-D).
    4. Aggiungi 380 μL di tampone TES e 20 μL di proteinasi K (vedi la Tabella dei Materiali) a ogni tubo di reazione, ottenendo 400 μL di tampone per la lisi (Figura 6E).
    5. Vortice brevemente e incubare a 56 °C per ≥3 ore con agitazione (Figura 6F).
    6. Tubi centrifughe a 18.626 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Un lisato da chiaro a leggermente colorato indica una digestione efficace.
      NOTA: Il protocollo può essere temporaneamente interrotto in questa fase se i lisati sono conservati a -20 °C.
  2. Estrazione del DNA
    1. Incubare i lisati a 56 °C per 10 minuti prima dell'estrazione.
    2. Reagenti di estrazione delle pipete nelle piastre di lavaggio e nelle piastre di eluzione, tenendo conto dei controlli negativi e degli errori dipipetazione 69 (vedi File Supplementare 1-Tabella Supplementare S1).
    3. Includere un blank di estrazione per piastra usando il buffer TES.
    4. Trasferire 300 μL di lisato in ciascun pozzo della piastra di legamento. Aggiungi 300 μL di AL tampone e 300 μL di alcol isopropilico in ciascun pozzo. Utilizzare più piastre di legame se il volume totale di lisato supera i 300 μL. Vortice e aggiungere 30 μL di particelle magnetiche per il legame degli acidi nucleici per pozzo alla prima piastra di legame (Tabella dei materiali).
    5. Copri la piastra di legatura con una copertura per le aste.
    6. Esegui il programma preliminare di assorbimento del DNA per due piastre di legame (totale di 400 μL lisato; vedi la Tabella dei Materiali e la Figura 7) e il protocollo di estrazione automatica su un robot da laboratorio basato su perle magnetiche.
    7. Smaltire i prodotti chimici di estrazione in contenitori designati per i rifiuti.
    8. Trasferire il DNA eluzionato in tubi di reazione marcati da 1,5 mL e conservare a −20 °C.
      NOTA: Il protocollo può essere temporaneamente sospeso in questa fase. A questo punto possono essere effettuati passaggi aggiuntivi di rimozione degli inibitori.
  3. qPCR
    1. Preparare e quantificare gli standard del DNA delle specie target utilizzando estratti di tessuto e un test di dsDNA ad alta sensibilità basato su fluorescenza, secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei Materiali). Generare una curva standard a otto punti tramite diluizione seriale (1:10) a partire da 10 ng/μL 11,55. Standard aliquoti prima della qPCR per minimizzare i cicli di congelamento-disgelo.
      NOTA: Il protocollo può essere temporaneamente sospeso in questa fase.
    2. Prepara tutte le reazioni qPCR in triplicata utilizzando piastre a 96 pozzi.
    3. Includere un controllo senza modello (acqua di grado molecolare) e un blank di estrazione per ogni piastra qPCR.
    4. Prepara il master mix secondo il File Supplementare 1-Tabella Supplementare S2 e la Figura 8A.
    5. In un cappuccio per il carico di DNA, aggiungere gli standard di DNA preparati in precedenza e 3 μL di estratto di DNA in ciascun pozzo contenente il mix master (Figura 8B).
    6. Sigilla la piastra con una pellicola sigillante (Figura 8C).
    7. Centrifugare a 3.500 × g per 10 secondi e caricarla nel termociclatore quantitativo PCR in tempo reale (Figura 8D,E).
    8. Eseguire il test in condizioni di ciclaggio ottimizzate, specificate nella Tabella 2, e registrare i dati utilizzando il software del produttore (Tabella dei Materiali)11.

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Figura 6: Flusso di lavoro per la lisi del DNA. (A) Rimuovere il tappo di gomma dal filtro eDNA autoconservante e inserirlo in una fiaschetta di Erlenmeyer; (B) sterilizzare due paia di pinze con la fiamma tre volte; (C) piega la membrana filtrante; (D) inserirlo in un tubo da 2 mL; (E) aggiungere tampone di lisi e proteinasi K, e (F) incubare campioni a 56 °C per 3 ore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Materiali e attrezzature utilizzate per l'estrazione del DNA. (A) Legare, lavare ed eluzionare piatti, consumabili ed eluzionare piastre per la preparazione dell'estrazione; e (B) il robot da laboratorio a perle magnetiche utilizzato per la lavorazione dei campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Flusso di lavoro per qPCR. (A) Preparare il master mix in una stanza precedentemente sterilizzata ai raggi UV (sotto una cappa funzionante dedicata alla preparazione dei master mix); (B) caricare standard, estratti e controlli del DNA in una stazione di carico del DNA seguendo il modello mostrato; (C) piastra di sigillamento; (D) centrifuga; (E) carica nel termociclatore quantitativo PCR in tempo reale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Nel 2024 sono stati raccolti complessivamente 154 campioni di impronte flukeprint (308 filtri eDNA) utilizzando questo protocollo ottimizzato, inclusi 96 filtri nella baia di Skálfandi (Islanda; 9 controlli sul campo e 76 repliche di megattera) ottenuti da marzo a novembre, 151 filtri nelle Azzorre (Portogallo; 12 controlli sul campo e 15 repliche di megattere) ottenuti a luglio e 61 filtri nel Mar Ligure (Italia; 4 controlli sul campo) ottenuti da maggio a ottobre. Tutti i campioni hanno comportato la raccolta di fino a 10 L di acqua di mare (due repliche per ogni campione di flukeprint) utilizzando filtri eDNA autoconservanti (Tabella 3). Durante il lavoro sul campo sono stati raccolti due tipi di controlli negativi: acqua purificata filtrata dopo la pulizia della candeggina dell'attrezzatura, e acqua di mare raccolta al rientro nel porto/i/i. 42. Quest'ultimo è stato intenzionalmente filtrato prima della pulizia della candeggina per valutare la possibile contaminazione incrociata con l'eDNA dei cetacei durante il campionamento. I campioni venivano spediti da ciascun sito di campionamento in due lotti all'Unità di Ricerca in Ecologia Animale Applicata, Dipartimento di Zoologia, Università di Innsbruck (Austria) per la lavorazione in laboratorio.

Prestazioni di analisi e controllo
Un sottoinsieme di 44 filtri (30 repliche, inclusi 2 controlli di campo dalla baia di Skjálfandi, Islanda, e 14 filtri, incluso 1 controllo di campo dalle acque che circondano l'isola di Faial e Pico, Azzorre, Portogallo) è stato analizzato per l'eDNA della megattera (Figura 9). Il segnale è stato misurato in reazioni qPCR triplice. Un campione (cioè un filtro eDNA) veniva considerato positivo, se una qPCR su tre si replicava amplificata. Il limite di rilevamento (LOD) del saggio in questo studio è stato calcolato come 0,0001 ng/μL (Ct medio del LOD = 35,8). Tra i 41 filtri analizzati, 20 (49%) hanno prodotto amplificazioni, mentre 24 (58%) non hanno mostrato amplificazione. Le non rilevazioni (nessun valore di CT) riflettono molto probabilmente l'assenza o concentrazioni estremamente basse di DNA bersaglio. Le non rilevazioni comprendevano 5 dei 13 filtri provenienti dalle Azzorre (38%) e 19 dei 28 filtri provenienti dall'Islanda (68%). I blank di estrazione sono stati analizzati per il DNA di vertebrati marini utilizzando il testMarVer3 70 e non hanno mostrato alcuna amplificazione rilevabile, indicando nessuna contaminazione incrociata durante l'estrazione del DNA. I controlli sul campo (NC) e i controlli qPCR (NT) non hanno prodotto amplificazioni, confermando l'assenza di contaminazione durante il lavoro sul campo e lo screening qPCR (Tabella 4).

Tra i 20 filtri positivi, nove (22%) hanno prodotto almeno un valore di Ct al di sotto del limite di rilevamento (LOD; 0,0001 ng/μL) dell'analisi e sono stati quindi classificati come rilevamenti affidabili. Questi includevano 4 dei 8 filtri provenienti dalle Azzorre (50%) e 5 dei 12 dall'Islanda (42%). Altri 11 filtri (27%) hanno prodotto uno o più valori di Ct sopra il LOD, comprendenti 4 filtri dalle Azzorre (50%) e 7 dall'Islanda (58%), indicando rilevamenti plausibili (Figura 10). L'analisi comparativa ha rivelato un valore di soglia media del ciclo (Ct) marginalmente inferiore per i filtri delle Azzorre (34,7 ± 3,60; n = 8) rispetto ai filtri islandesi (36,9 ± 3,60; n = 10). Il test U di Mann-Whitney dimostrò che questa differenza non era statisticamente significativa (U = 199,0, p = 0,204). Data la relazione inversa tra il valore di Ct e la forza del segnale del DNA, i risultati indicano concentrazioni leggermente più elevate di eDNA della megattera target nei filtri delle Azzorre (Figura 11).

Vincoli di fattibilità
Il numero di campioni di impronte di flukee per viaggio variava a seconda della durata del viaggio e delle condizioni meteorologiche. Circa due o tre campioni (che hanno prodotto fino a sei filtri eDNA) sono stati raccolti durante i tour di 3 ore nelle Azzorre, due o quattro campioni durante ~8 ore in Italia (fornendo fino a otto filtri) e uno o due campioni (fino a 4 filtri) durante i tour di 3,2 ore in Islanda. Le prestazioni di filtrazione erano generalmente elevate nelle Azzorre e in Italia. Nelle Azzorre, 10 L di acqua di mare sono stati filtrati costantemente entro 10-15 minuti, mentre in Italia lo stesso volume è stato filtrato in circa 10 minuti. In Islanda, i volumi filtrati variavano da 4,5 a 10 L (media = 8,5 L), con un tempo medio di filtrazione di ~40 min dovuto a frequenti ostruzioni del filtro, probabilmente dovute a particelle nell'acqua nell'area di studio. In particolare, 10 L sono stati filtrati con successo per 46 dei 98 filtri (47%), volumi tra 7 L e 10 L sono stati ottenuti per 31 filtri (32%) e volumi tra 4 L e 7 L per 21 filtri (21%) (File Supplementare 1-Tabella Supplementare S3).

Il protocollo raccomanda la filtrazione di un controllo negativo di campo ogni cinque campioni di impronta fluke. Tuttavia, in condizioni operative di whale-watching, ciò non poteva essere completamente realizzato nel caso descritto a causa di vincoli logistici, tra cui la disponibilità limitata dei filtri, i vincoli di tempo e i ritardi nelle spedizioni. Questo ha ridotto i rapporti controllo/campionamento raggiungibili a 1:10,7 in Islanda (9/96), 1:12,6 nelle Azzorre (12/151) e 1:15,3 in Italia (4/61). Nonostante queste deviazioni, nessun controllo negativo di campo o laboratorio ha mostrato amplificazione.

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Figura 9: Panoramica delle posizioni dei campioni. I punti neri sulla mappa rappresentano i luoghi in cui sono stati prelevati campioni da un'impronta di tremata di megattera nella baia di Skjálfandi (Islanda) e nelle Azzorre. Il nome del filtro eDNA è indicato vicino alla regione di campionamento corrispondente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Rilevamenti da un sottoinsieme di filtri eDNA dalle Azzorre e dall'Islanda. qPCR media valori di Ct e potenza del segnale del DNA per rilevazioni positive a Azzorre e Islanda (almeno una replica PCR positiva), con SD e LOD. Le barre sono colorate in base alla potenza del segnale rispetto al LOD: blu scuro = segnale forte (Ct ≤ 35.8) indica rilevamenti affidabili, azzurro chiaro = segnale debole (Ct > 35.8) indica rilevamenti plausibili. Le barre di errore SD rappresentano la variabilità tra repliche PCR. La linea tratteggiata rossa indica il LOD (Ct = 35,8). I valori medi di Ct sono mostrati sopra ogni barra. Abbreviazioni: Ct = soglia ciclica; SD = deviazione standard; LOD = limite di rilevamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Valori medi della soglia ciclica per le rilevazioni del DNA della megattera dalle Azzorre e dall'Islanda. Le linee nere all'interno dei box plot indicano la mediana, e i quadrati rossi rappresentano i valori medi di Ct (SD), mentre i baffi rappresentano i valori minimi e massimi per le Azzorre e l'Islanda. Il test U di Mann-Whitney dimostrò che questa differenza non era statisticamente significativa (U = 199,0, p = 0,204). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Sequenze di primer e sonda per il saggio qPCR mirato a ND5. Queste sequenze includono primer forward e back, sequenze di sonda MGB (5′-3′), temperatura ottimale di ricottura e limite di rilevamento (LOD) nel saggio. (*) LOD è definita come la concentrazione minima di DNA (ng/μL) del DNA della specie bersaglio, a cui il ≥95% delle replicazioni PCR ha prodotto un'amplificazione positiva. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Condizioni di ciclo ottimizzate per il saggio qPCR eDNA della megattera.Queste impostazioni ottimizzate della qPCR sono: 95°C per 10 minuti (attivazione enzimatica), poi 40 cicli a 95°C per 15 secondi (denaturazione) e 60°C per 90 secondi (ricottura/estensione). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Panoramica della configurazione del campionamento sul campo. Panoramica delle regioni di campionamento, partner sul campo, tipi di imbarcazioni, specie target, periodi di campionamento e repliche di campionamento nelle Azzorre, Islanda e Italia. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: riepilogo della rilevazione qPCR per campioni ambientali e controlli. Vengono mostrati i rilevamenti positivi (evidenziati in giallo), i valori di replicazione della qPCR e i risultati della rilevazione; i campioni sono stati classificati positivi quando almeno una delle replicate qPCR ha mostrato amplificazione. "No Ct" indica nessuna amplificazione, i controlli negativi non hanno mostrato amplificazione e la serie standard di diluizione di M. novaeangliae usata per definire la performance del saggio e il LOD è inclusa in fondo alla tabella. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File Supplementare 1: Contiene Figure e Tabelle Supplementari, fornendo informazioni aggiuntive sull'applicazione del protocollo, inclusi kit di campionamento per il design del primer per l'eDNA, tipi di navi per l'osservazione delle balene, caratteristiche del filtro eDNA autoconservante, volumi di reagenti per l'estrazione del DNA e le reazioni qPCR, e variazioni nei tassi di filtrazione tra le regioni di campionamento. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 2: scheda tecnica sul campo utilizzata durante il campionamento di eDNA dei cetacei. Forma standardizzata per la registrazione dei metadati delle crociere, osservazioni dei cetacei e informazioni su campioni e filtri. Clicca qui per scaricare questo File.

File Supplementare 3: Protocollo di campo passo dopo passo per il campionamento di eDNA dei cetacei a bordo delle navi di osservazione delle balene, inclusa pulizia delle attrezzature, raccolta dell'acqua di mare e filtrazione a bordo, segnalazione dei campioni e conservazione. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 4: Modello di foglio di calcolo per campionamento di eDNA dei cetacei. Modulo standardizzato per la registrazione delle informazioni di campionamento dopo la raccolta del campione e la filtrazione a bordo. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Fattibilità operativa e implementazione sul campo
Il protocollo qui presentato contribuisce con un flusso di lavoro standardizzato per eDNA che bilancia la sensibilità del rilevamento con i vincoli reali. Integrando campionamenti ad alto volume e mirati a flukeprint, filtrazione a bordo tramite filtri chiusi autoconservanti e misure standardizzate di controllo della contaminazione, il protocollo fornisce un quadro riproducibile applicabile in diverse regioni e campagne di campionamento. Questo approccio è in linea con il crescente riconoscimento dell'eDNA come complemento economico e scalabile alle tecniche convenzionali di monitoraggiomarino 9,10,22.

Studi precedenti sull'eDNA dei cetacei si sono basati principalmente su campionamenti di acqua di mare basati su transetti provenienti da grandi navi da ricerca o su campionamenti opportunistici di piccolo volume vicino a avvistamenti di cetacei. Gli approcci basati su transetti permettono una copertura spaziale ampia ma spesso catturano segnali di DNA diluiti e temporalmente disaccoppiati, limitando le rilevazioni di specie rare otransitorie 71, anche quando il campionamento avviene vicino alla superficie, e tipicamente richiede vasi e infrastrutturespecializzate 25,37,72. Al contrario, il campionamento a piccolo volume vicino alle balene in superficie migliora la specificità dell'incontro ma rimane soggetto a falsi negativi a causa di volumi idrici limitati e pratiche di filtrazioneincoerenti 72,73. Puntando esplicitamente alle impronte di flukee e filtrando grandi volumi a bordo, il flusso di lavoro qui presentato aumenta la probabilità di catturare eDNA di cetacei a bassa concentrazione, pur rimanendo fattibile sotto i vincoli di tempo e spazio tipici delle operazioni di whale-watching. L'uso di filtri chiusi e autoconservanti minimizza ulteriormente i rischi di manipolazione e contaminazione, eliminando la necessità di buffer di conservazione applicati sul campo e semplificando la logistica in condizioni di bordolimitate 42,66.

Per garantire la comparabilità tra gli studi incrociati, i seguenti parametri devono rimanere fissi all'interno di una campagna di campionamento: raccolta diretta dell'acqua di mare dalle impronte visibili dei cetacei; due repliche biologiche da 10 L per impronta di colpo; l'uso di filtri eDNA autoconservanti è impossibile durante le misure standardizzate di controllo della contaminazione, inclusi i regolari controlli negativi sul campo a una frequenza minima definita; e screening qPCR specifico per specie eseguito in triplicata con controlli appropriati. Altri parametri possono variare senza compromettere il quadro metodologico, a condizione che vengano applicati in modo coerente e trasparente, inclusi l'attrezzatura e la gestione della raccolta dell'acqua, la dimensione dei pori del filtro, il tipo di pompa e la configurazione del tubo, la durata di filtrazione e il volume filtrato raggiungibile in condizioni di ostruzione, la logistica del campione a bordo e le condizioni di stoccaggio a breve termine prima della spedizione. Poiché molti passaggi di elaborazione negli studi sull'eDNA rimangono variabili, è fortemente raccomandata una segnalazione rigorosa di tutti i passaggi di campionamento e analitici.

La fattibilità di questo protocollo è massima in condizioni di mare calmo o moderato (≤ Beaufort 3), con torbidità bassa o moderata, quando a bordo il tempo e lo spazio permettono di elaborare due filtri eDNA per ogni impronta flukeprint e un volume d'acqua filtrato di 10 L per filtro. In pratica, gli scienziati formati possono campionare fino a Beaufort 3, ma gli scienziati cittadini dovrebbero lavorare solo in condizioni calme (Beaufort 1-2), a causa del movimento e della turbolenza delle imbarcazioni, nonostante a volte le missioni di osservazione delle balene si svolgano a Beaufort 3. La filtrazione dovrebbe iniziare il prima possibile dopo la raccolta dell'acqua per minimizzare la degradazione del DNA47,74. Le strategie di campionamento che minimizzano la diluizione indotta dall'elica dell'eDNA superficiale, come il campionamento dai lati sottovento e inferiori della nave, supportano ulteriormente la precisione del puntamento e rilevamentiaffidabili 47. Evitare le manovre inverse e impedire che le corde (attaccate ai secchi) entrino in contatto con i campioni di acqua di mare riduce ulteriormente il rischio di contaminazione, in linea con le migliori pratiche di eDNAacquatico 38. A seconda della configurazione e della logistica della nave (ad esempio, altezza, moto e spazio disponibile a bordo), sono supportate due strategie di campionamento se applicate in modo coerente: (i) raccolta e filtrazione indipendenti di due repliche da 10 L usando due secchi separati, oppure (ii) raccolta di un singolo campione d'acqua da 20 L trasferito in un contenitore sterile sigillato per il trasporto sicuro a bordo e successivamente suddiviso in due repliche da 10 L per la filtrazione. Un volume di filtrazione di 10 L per filtro rappresenta un compromesso pratico tra probabilità di rilevamento e sforzo di filtrazione in condizioni di osservazione delle balene.

Volumi maggiori aumentano la probabilità di catturare eDNA raro o a bassa concentrazione e riducono i falsi negativi comuni negli studi suicetacei 39,40,75, pur rimanendo operativamente fattibili se abbinati a filtri autoconservanti e pori di grandi dimensioni 42. Carichi di particolato elevati, movimenti della nave, spazio limitato sul ponte o vincoli di tempo possono ridurre l'efficienza di filtrazione e i volumi raggiungibili, limitando così l'applicabilità del protocollo. In tali casi, possono essere necessarie adattamenti allineati al protocollo, come la riduzione dei volumi d'acqua o dimensioni alternative dei pori dei filtri, che dovrebbero essere applicate in modo coerente all'interno delle campagne di campionamento per mantenere la comparabilità dei dati. La durata del viaggio, il momento degli incontri con le balene e la capacità di filtrazione determinano i numeri di campione raggiungibili. Nei tour standard di osservazione delle balene di 3 ore, è tipico possibile completare uno o due campioni di impronte fluke-mark (occasionalmente tre) senza interrompere le operazioni o l'esperienza di sciència cittadina. Durante spedizioni più lunghe, la capacità di campionamento aumenta con lo sforzo giornaliero di osservazione delle balene (ad esempio, ~8 ore al giorno nel nostro studio di caso in Italia). In pratica, il campionamento di eDNA potrebbe essere implementato in tutte e tre le località durante il picco dell'attività turistica.

Successo nell'amplificazione dell'eDNA e controllo della contaminazione
I campioni ambientali, specialmente quelli raccolti in acque ricche di nutrienti, possono contenere inibitori PCR in grado di sopprimere l'amplificazione e generare falsinegativi 76. Sebbene non sia stata rilevata inibizione in analisi precedenti su campioni islandesi nello stesso progetto42, l'inclusione di una fase di rimozione degli inibitori ha garantito un successo costante dell'amplificazione (vedi Tabella dei materiali) e si allinea con le raccomandazioni di best practice per i flussi di lavoro di eDNAacquatico 14,55.

Prestazioni costanti di rilevamento qPCR tra le regioni indicano che il protocollo cattura in modo affidabile l'eDNA dei cetacei in condizioni ambientali diverse. Variazioni minori di Ct probabilmente riflettono differenze regionali di temperatura, torbidità e produttività, che influenzano il rilascio, la degradazione e la dispersione dell'eDNA75,76. Il limite di rilevamento del saggio (0,0001 ng/μL) rientra nell'intervallo di sensibilità riportato per altri saghi validati sui cetacei sviluppati nell'ambito del progettoeWHALE 14,11,42. I tassi di rilevamento erano coerenti con le indagini precedentemente pubblicate basate su impronte fluke, sottolineando l'influenza del comportamento delle specie e della frequenza di emergenza sul successo dellarilevazione 41,42,47. Per la quantificazione qPCR sono stati utilizzati standard di DNA derivati dal tessuto, riflettendo una pratica comune nella ricerca sull'eDNAmarino 57,72,77,78,79. Sebbene questo approccio possa introdurre varianza nella quantificazioneassoluta 11,61,80,81,82,83, in particolare per campioni ambientali a bassa concentrazione ed eterogenei84,85, riflette la complessità reale delcampione 55,86. L'uso di standard sintetici può migliorare la riproducibilità quantitativa e la comparabilità tra studi ed è raccomandato per applicazioni future11,87.

Le potenziali fonti di contaminazione includono il trasferimento incrociato di campioni, così come l'introduzione di DNA ambientale umano o non bersaglio durante le fasi di manipolazione, che può portare a rilevamenti falsipositivi. Un rigoroso controllo della contaminazione è essenziale durante le lavorazioni sul campo e in laboratorio, soprattutto nelle condizioni limitate tipiche delle operazioni di citizen science. Cambi di guanti di routine, l'uso di apparecchiature prive di DNA, sistemi di filtrazione chiusi, addestramento standardizzato, l'inclusione di controlli di campo e laboratorio di routine, la documentazione di potenziali eventi di contaminazione e la validazione dei sami secondo i quadri consolidati sono fondamentali per garantire l'affidabilità dei dati e il rilevamento dellespecie 11,31,49,51,55,89 . Sebbene l'uso della plastica sia una limitazione inevitabile del campionamento molecolare basato sul campo, il consumo è stato ridotto quando possibile e sono stati utilizzati materiali di filtrazione parzialmentebiodegradabili 66.

Limitazioni, scalabilità e implicazioni future
L'ostruzione del filtro rimane un vincolo chiave in ambienti turbolenti o produttivi come la baia di Skjálfandi (Islanda), dove la sosta di materia organica e la densità di plancton probabilmente hanno ridotto l'efficienza difiltrazione 43,90. La registrazione della durata di filtrazione, gli indicatori di ostruzione del filtro come la riduzione del flusso, le bolle d'aria visibili nel filtro o la tensione della pompa, e la limitazione del tempo di filtrazione a circa 45 minuti per replica supportano l'interpretazione e il confronto a valle. L'uso di un dispositivo galleggiante sterilizzato per sospendere il filtro o sacche di filtrazione alimentate per gravità può potenzialmente ridurre i tempi di manipolazione durante la filtrazione, anche se quest'ultimo potrebbe essere incompatibile con filtri eDNA autoconservanti e grandi volumi (≥1 L)91. Filtri di pori di dimensioni maggiori (≥ 5 μm) potrebbero migliorare ulteriormente i tassi di filtrazione, anche se l'efficienza di rilevamento specifica per il taxone dovrebbe essere valutata durante il campionamento pilota per l'eDNA deicetacei 45,92.

Le considerazioni chiave prima del campionamento su larga scala includono: dare priorità alla filtrazione a bordo rispetto alla lavorazione ritardata, mantenere volumi d'acqua e configurazione del filtro costanti, condurre campionamenti pilota per ottimizzare la filtrazione in condizioni locali e allineare lo sforzo di campionamento con la capacità della nave e la durata del viaggio. Strumenti digitali di inserimento dati che permettano la registrazione strutturata e sul campo da parte di scienziati cittadini sono raccomandati per applicazionifuture 93.

L'applicazione con successo di questo flusso di lavoro dall'inizio alla fine dimostra la robustezza sotto vincoli operativi, mettendo in evidenza al contempo limitazioni legate a spazio, tempo, condizioni meteorologiche e rischi di contaminazione insiti nei contesti della citizenscience 10,94. Nonostante questi limiti, le navi per l'osservazione delle balene rappresentano una piattaforma potente e sottoutilizzata per il monitoraggio dei cetacei a DNA quando vengono forniti addestramenti e supervisionistandardizzati 31,32,42,95. Integrare questo flusso di lavoro con strumenti consolidati di monitoraggio dei cetacei, come l'identificazione fotografica, l'acustica passiva e il campionamento tramite biopsie, può collegare le rilevazioni genetiche ai dati comportamentali e demografici. Sebbene questo studio si concentri sulla rilevazione basata su qPCR specifica per specie, applicazioni future potrebbero integrare DNA metabarcoding o analisi genetiche di popolazione, ampliando ulteriormente il valore ecologico e conservativo del monitoraggio dell'eDNA dei cetacei.

Man mano che gli approcci basati sull'eDNA continuano a prosperare, questo flusso di lavoro fornisce una base scalabile per integrare il monitoraggio genetico nei programmi esistenti di osservazione e conservazione marina, in particolare nei punti caldi dei cetacei ed ecosistemi sensibili.

Dichiarazioni

Belén García Ovide è fondatrice e direttrice esecutiva di Ocean Missions, un'organizzazione no-profit focalizzata sulla conservazione degli oceani con sede a Húsavík, nel nord-est dell'Islanda. Ocean Missions coordina il campionamento da navi da osservazione delle balene in Islanda, così come da navi da spedizione artiche. È anche rappresentante di North Sailing, un'azienda di whalewatching di Húsavík, all'interno del progetto eWHALE. Queste affiliazioni non hanno influenzato la progettazione dello studio, la raccolta dei dati, l'analisi o l'interpretazione dei risultati.

Ringraziamenti

Desideriamo riconoscere tutte le persone coinvolte nel lavoro sul campo e in laboratorio, ovvero:

i) Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot e Isabell Österle, che hanno partecipato a campioni raccolti nella baia di Skjálfandi, Islanda; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontini, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet nelle Azzorre (Portogallo); iii) Sandra Schallhart, Jana Robertson in Austria; e iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri per la raccolta dati nel Santuario di Pelagos (Italia).

Questa ricerca è stata finanziata da Biodiversa+, il Partenariato Europeo per la Biodiversità nell'ambito della bando congiunta BiodivProtect 2021-2022 per le proposte di ricerca, cofinanziata dalla Commissione Europea (GA n. 101052342) e con le organizzazioni finanziatrici: 1) Il Centro Islandese per la Ricerca (RANNÍS), (Borsa n. 229030), 2) il Ministero delle Università e della Ricerca (MUR), dal conto speciale FIRST e IGRUE relativo al partenariato europeo Biodiversa+ Call 2021 - progetto eWHALE, 3) il Fondo Austriaco per la Scienza (FWF) [doi: 10.55776/I6389] e il fondo di pubblicazione dell'Università di Innsbruck.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtri eDNA alternativi: SterivexTM /WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0,45 & micro; Dimensione dei pori M. Richiedere buffer di conservazione dell'eDNA  
AW1, AW2, buffer AEQiagen   19081, 19072, 19077Soluzioni tampone utilizzate per la purificazione del DNA durante l'estrazione
Soluzione di candeggina (1:10)DM - Denk mit, HygienereinigerPersonalizzatoDecontaminazione superficiale. Tutte le fasi dei processi di laboratorio
SecchiNegozi di barche, attrezzatura da pesca, AmazonRigido. Gomma o plastica dura (≥ 10 L). Una o più a seconda dell'allestimento del campionamento e della logistica a bordo
Reagente di Pulizia, Express PCR ExoSAP-IT75001.1.EAPreparazione dei prodotti PCR per il sequenziamento Sanger
Scatola di raffreddamentoAbitazioniContenitore rigido isolante o sacco di raffreddamento
Guanti usa e getta, taglie Large (L) e Medium (M),
Senza polvere		Kimberly-Clark43431, 55090Guanti usa e getta in nitrile o lattice, scatola da 100 unità. Quantità richiesta: 1 scatola ogni 10 - 15 corse
Standard del DNA (3 μ L) NAPersonalizzatoDiluizione seriale derivata dal tessuto del DNA (8 punti, 10 ng/& micro; L) dalla megattera. Calibrazione nella qPCR
Abbigliamento da laboratorio sicuro per il DNAFalano, PP-Overall081-2900Tutti i passaggi dei processi di laboratorio.
Contenitore eDNANegozi di case o ferramentaNACoperchio, durevole, trasparente (≥ 10 L).  
Piastra di eluzione, copertura dell'asta, piastre di lavaggio, piastra di legaturaQiagen19581, 997004, 1031656, 302570Plastiche usate per l'estrazione del DNA & nbsp;
Etanolo (8:10)Resisti, ACS ISO suonaVariSterilizzazione in panca. Tutti i passaggi del laboratorio
Schede tecniche di campo
Saggio ad alta sensibilità basato su fluorescenzaThermo Fisher ScientificQ32851Test ad alta sensibilità del qubit dsDNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)
Centrifuga ad alta velocità (24.000 giri/min)Hettich Zentrifugen Separa il soprantagente contenente DNA dai detriti. Lisi del DNA
Impacchi di ghiaccioNegozi per abitazioniRaffreddamento dei campioni all'interno del container
Innesco IPC diretti e indietrosiTecnologie Integrate del DNANAProdotto personalizzato utilizzato per l'amplificazione del DNA della specie bersaglio
Sonde qPCR IPC PrimeTimeTecnologie Integrate del DNANAProdotto personalizzato utilizzato per l'amplificazione del DNA della specie bersaglio
Cappa a flusso laminare & nbsp;Prodotti Kendro LaboratoryVFS1206Ambiente sterile per le preparazioni di reagenti nella preparazione qPCR
Protocollo di campo illustrato laminato Personalizzato
Buffer di lisiQiagen79216DNeasy lysis buffer AL. Alternativa al TES Buffer + Proteinasi K
Sfera-magnetico– Robot DNA basatoTesta PCR KingFisher Apex 965400910Software: BindIx PC 
Particelle magnetiche per il legame degli acidi nucleici (30 & micro; L)Qiagen67563Particelle MagAttract. Facilita il legame del DNA alle sfere magnetiche nell'estrazione del DNA
Master mix (5 & mu; L)EMM, Life Technologies4396838TaqMan Environmental Master Mix (2.0)
Centrifuga a Mini Piastre Centrifughe & nbsp;LabnetC1000Spina gocce di liquido e condensa provenienti da PCR e micropiastre
Kit per la rimozione degli inibitori PCR OneStep-96Ricerca ZYMOD6035Purificazione e rimozione dei contaminanti negli estratti di eDNA  
Piastre PCRBio-RadHSP9601Hard-Shell 96-Well
Pipette + punte filtrate steriliPipettes: BIOHIT, Punte per filtri: Biozym Safe  Consigli per sigillare  ProfessionistaVariLe pipette manuali o elettroniche possono essere utilizzate a vari volumi massimi
Centrifuga a piastra per centrifuga & nbsp;NANARimuove le bolle prima di qPCR 
Proteinasi KAvantor VWRA4392.0010Digerisce proteine per aiutare a rilasciare il DNA durante la lisi
Acqua purificataMilliQNAAcqua senza RNASI, usata per i controlli negativi e la soluzione di pulizia  
Tubi di reazione (2 mL)Eppendorf30120094Lisi del DNA
Termociclatore quantitativo PCR in tempo realeAnalytikjenaNAPiattaforma 3G QTower. Amplifica e quantifica il DNA in tempo reale
CordeNavigazione, ferramenta, porti di pescaNAMateriale resistente (ad esempio, polietilene o corde intrecciate). Lunghezza almeno due volte l'altezza della nave
Film sigillante, adesivo, otticoBio-RadMSB1001Microsigillo 'B'. Sigilla la piastra PRC prima della PCR
Filtri eDNA autoconservantiSmith-Root 11579-251.2 & micro; Dimensione dei pori M. Quantità per campagna campionaria: secondo necessità
Container di spedizioneLaboratori, farmacie, AmazonVariIsolamento in polistirolo
Software per l'allineamento e l'analisi delle sequenze biologicheBio ModificaVersione 7Editor e programma di analisi per l'allineamento delle sequenze biologiche facile da usare per Windows 95/98/NT
Bottiglia a spremereLaboratori, farmacieVariRiempito di candeggina domestica (1:10)
Software di analisi statisticaTeam R Studio. (2023)Versione 4.2.1
Guanti sterilizzati senza DNASempercare  Edizione79712Tutte le fasi dei processi di laboratorio. 
Buffer TESProdotto personalizzato, equivalente al buffer di lisi DNeasy
Contenitore di rifiuti tossiciSmaltimento sicuro dei rifiuti pericolosi. Tutti i passaggi
Lampada UV SterilAIRSterilizzazione della cappa per la preparazione della qPCR
Vortex-genie 2 miscelatore vortice & nbsp;Thermo Fisher Scientific50728002Omogeneizza e mescola i reagenti. Lisi del DNA, estrazione
Contenitore dei rifiutiNegozi per abitazioniContenitore rigido piccolo
Pompa dell'acqua (peristaltica/a vuoto)Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root 12.34.SB; 410/12099Pompe portatili
Marcatore impermeabileVari

Riferimenti

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