Chirurgia stereotassica nei topi neonati e cure post-operatorie

Sommario

La capacità di esprimere vettori virali nel cervello prepuberale è fondamentale per studiare i meccanismi cellulari e circuitali dello sviluppo cerebrale. Qui descriviamo un protocollo per eseguire la chirurgia virale stereotassica nel neonato nei giorni postnatali 11 o 12 (P11-P12) e forniamo linee guida per la cura post-operatoria.

Abstract

Comprendere i processi di sviluppo, cellulari e circuiti durante il periodo postnatale è fondamentale per chiarire le complessità dello sviluppo cerebrale e il suo impatto sulla maturazione comportamentale e sociale. La transizione dall'età infantile all'età adulta comporta cambiamenti neurobiologici significativi, tra cui la potatura sinaptica e la mielinizzazione, fondamentali per le capacità cognitive, la regolazione emotiva e le interazioni sociali. Studiare lo sviluppo cerebrale nei topi prepuberi consente ai ricercatori di identificare periodi critici che favoriscono una crescita cerebrale sana e di stabilire interventi tempestivi per i disturbi neurosviluppativi. Per dissezionare con precisione la funzione cerebrale, la chirurgia stereotassica è stata una tecnica fondamentale nella ricerca neuroscientifica, offrendo una precisione senza pari nel mirare alle regioni cerebrali di interesse e nel permettere la somministrazione di agenti virali. Anche se gli interventi stereotassici nei topi adulti sono ampiamente implementati nei laboratori di neurobiologia, ci sono linee guida molto limitate per eseguire interventi stereotassici nei topi prepuberti, così come per cure post-operatorie cruciali per garantire che il neonato possa essere reintrodotto con successo alla madre e ai fratelli di cucciolata. Qui descriviamo un protocollo per la chirurgia stereotassica e l'iniezione virale nei topi neonati (P11-P12), evidenziando anestesia e somministrazione di analgesia, considerazioni per la cura post-operatoria e differenze rispetto alla chirurgia stereotassica negli adulti. Questo protocollo può essere implementato in qualsiasi regione cerebrale di interesse aggiornando le coordinate target desiderate e può essere modificato per il targeting cerebrale nelle fasi successive dello sviluppo postnatale, come durante il periodo giovanile (P15-P30). Nel complesso, questo protocollo fornisce un punto di ingresso per lo studio dello sviluppo e della funzione cerebrale postnatale.

Introduzione

L'infanzia e l'adolescenza sono periodi postnatali cruciali per lo sviluppo cerebrale, caratterizzati da mielinizzazione, sinaptogenesi e potatura sinaptica, che facilitano il raffinamento dei^{circuiti 1,2}. L'emergere di comportamenti sociali, inclusi accoppiamento, aggressività e gioco sociale, si verifica durante il periodo peripubertale (P28-40)³, ed è strettamente regolata dagli ormoni steroidei^{circolanti 4,5}. Nonostante i significativi progressi negli strumenti per analizzare le basi cellulari dei comportamenti sociali negli adulti, si sa poco sui meccanismi neurali alla base dell'emergere dei comportamenti sociali durante lo sviluppo postnatale. Le ragioni della mancanza di comprensione dei circuiti sociali in via di sviluppo includono: 1) le sfide associate all'esecuzione di interventi chirurgici nei topi neonati, inclusi dispositivi stereotassici non installati per topi più giovani, 2) il bilanciamento della sicurezza e dell'efficacia di analgesia e anestesia durante^{l'intervento 6)} e 3) l'accettazione dei neonati da parte della diga dopo l'intervento. Inoltre, i metodi attuali utilizzati per fornire costrutti genetici nei primi momenti postnatali, come l'elettroporazione^{in utero 7}, l'iniezione virale intracerebroventricolare nel cervello neonatale del^{topo (}P0-P10) 8, o gli incroci genetici driver e -responsive^{line 9}, non sono ideali, poiché mancano di targeting preciso e focalizzano sul targeting embrionale o P0.

Qui forniamo un protocollo semplice per la chirurgia stereotassica nei topi neonati (P11-P12) e l'assistenza post-operatoria per supportare una reintegrazione efficace con la madre e i fratelli di cucciolata. Questo protocollo sfrutta l'attuale protocollo stereotassico per topi^{adulti 10} e richiede solo modifiche minori alla configurazione stereotassica. Forniamo inoltre indicazioni dettagliate sulla cura post-operatoria e sull'anestesia e analgesia di successo nei topi neonati. Abbiamo selezionato il momento P11-12 per l'intervento chirurgico poiché c'è un periodo di incubazione di 2 settimane per l'espressione virale, così i topi possono essere testati in vivo a partire da P24, prima del periodo peripubertale (P28-40)³. Tuttavia, lo stesso protocollo può essere utilizzato per la chirurgia stereotassica in momenti successivi. Ci concentriamo sull'amigdala mediale in via di sviluppo (MeA), una suddivisione dell'amigdala caratterizzata dal suo ruolo in un insieme diversificato di comportamenti^{sociali 11,12}. Indagiamo specificamente la sottopopolazione di MeA che esprime Foxp2 (^{MeA Foxp2})¹³, un fattore di trascrizione forkhead box, poiché abbiamo già scoperto che queste cellule sono uniche per l'elaborazione in vivo dei segnali sensoriali maschili nei topi maschi durante lo sviluppo^{postnatale 14}. Inoltre, la sottopopolazione^{MeA Foxp2} deve modulare bidirezionalmente l'aggressività territoriale nei^{maschi 14}. Nel complesso, l'attuale protocollo consente ai neuroscienziati di somministrare con precisione agenti virali nelle regioni cerebrali mirate nelle fasi chiave dello sviluppo cerebrale postnatale per studiare le basi cellulari e circuitali dei comportamenti sociali e affiliati durante l'adolescenza e l'età adulta.

Protocollo

Questa procedura è stata approvata dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali del NIEHS ed è in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per l'uso e la cura degli animali. Durante tutta la sala operatoria e in presenza di animali sono stati utilizzati dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui guanti, mascherina, camice usa e getta, una rete per capelli e le scarpe.

1. Preparazione e regolazione degli apparecchi stereotassici del topo (Figura 1)

1. Prepara l'apparecchiatura stereotassica con accessori stereotassici per topi neonati, inclusi un paio di cuffie per le orecchie non rapture, un portatesta per anestesia al gas modificato e una barra per il palato per neonati P12.
2. Sanifica tutti gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore a perline di vetro (250 °C, 30 secondi per attrezzi più piccoli e 1 minuto per attrezzi più grandi). Posiziona gli strumenti sterili su una tenda sterile dopo la sterilizzazione. Gli strumenti sterili devono rimanere sul campo sterile per tutta la durata dell'intervento.
3. Posiziona un'altra panchina sterile su un cuscinetto riscaldante a una temperatura di ~37 ^°C sull'impianto stereotassico per mantenere il neonato a una temperatura controllata durante tutto l'intervento. Controlla la temperatura della borsa riscaldante durante tutto l'intervento.

2. Preparazione chirurgica del topo, posizionamento stereotassico, livellamento e craniotomia

1. Misura il peso corporeo per fornire la dose appropriata di analgesia.
2. Inserire il topo in una camera di induzione riempita al 3% di isoflurano con una portata di ossigeno di 0,9 L/min. Controlla che la respirazione del mouse sia diminuita a ~1 respiro/s e che non ci sia risposta dopo aver testato il riflesso di astinenza del pedale. Sposta il flusso di isoflurano/ossigeno al sistema stereotassico e riduci la concentrazione di isoflurano al 2%.
   NOTA: L'adeguata anestesia deve essere confermata dall'assenza di risposte al riflesso di ritiro del pedale ogni 5 minuti per tutta la durata dell'intervento. Osserva attentamente il ritmo respiratorio del topo durante tutta l'intervento. Regola la concentrazione di isoflurano durante tutto l'intervento in modo che la percentuale più bassa venga utilizzata per mantenere l'anestesia profonda ed evitare un sovradosaggio anestesico.
3. Monta il mouse sull'apparecchiatura stereotassica modificata con accessori stereotassici per topi neonati. Posizionare le barre auricolari non perforanti ai lati della testa del mouse e allineare il righello della barra per l'orecchio in modo che sia equidistante per entrambi i lati rispetto al righello stereotassico. Per i neonati P11, imposta il righello stereotassico a 5 mm.
   NOTA: I neonati a P11 di solito non hanno ancora gli occhi aperti, quindi non è necessario lubrificante per gli occhi. Verso P12, alcuni neonati hanno gli occhi aperti. Se gli occhi del neonato sono aperti, si deve applicare una pomata oftalmica e riapplicare secondo necessità durante l'intervento.
4. Iniettare Meloxicam da 5 mg/kg tramite via intrascapolare sottocutanea (s.c.) usando una siringa da 1 mL con ago da 27 G.
5. Diluire lo 0,5% di bupivacaina (5 mg/mL) con soluzione salina a 0,5 mg/mL (1:10) e iniettare s.c. sotto la pelle della testa (cioè 0,05 mL per un neonato da 5 g).
   NOTA: I passaggi da 2.6 a 3.15 devono essere eseguiti con guanti sterili.
6. Esegui un'incisione di 1,5 cm con piccole forbici lungo la linea mediana della testa.
7. Usa un cotton ficon sterile per rimuovere con cura i tessuti molli dalla superficie del cranio con betadina.
8. Inserire un capillare in vetro tirato (~0,8 mm di lunghezza) in un portapipete in vetro. Monta il supporto sul braccio stereotastico verticale.
   NOTA: I passaggi da 2.9 a 3.10 devono essere eseguiti al microscopio dissezionale.
9. Livellare l'angolo anteroposteriore della superficie cranica:
   1. Spostare il capillare al punto di confluenza rostrale dei seni dorsali (RCS) (Figura 2) come illustrato in Chan et ^al.15.
   2. Al microscopio con ingrandimento 2x, azzerare le coordinate X (Mediale-Laterale), Y (Anteriore-Posteriore) e Z (Dorsale-Ventral) quando il capillare tocca leggermente il cranio nel punto RCS utilizzando la console digitale dello strumento stereotassico.
   3. Sposta il capillare verso lambda (a Y = -7,30 mm) e abbassa il capillare fino a toccare leggermente il cranio (Figura 2).
   4. Controlla il valore delle coordinate Z e livellare l'angolo anteroposteriore nel rig stereotassico per cambiare l'angolo di inclinazione della testa. Ripeti i passaggi da 2.9.1 a 2.9.3 finché la differenza nel valore della coordinata Z tra RCS e lambda è di <0,02 mm.
10. Livellare l'angolo mediale-laterale della superficie cranica:
    1. Sposta il capillare sul punto RCS.
    2. Zera le coordinate X (Mediale-Laterale) e Y (Anteriore-Posteriore) quando il capillare tocca leggermente il cranio nel punto RCS.
    3. Per livellare la testa usando le coordinate posterodorsali MeA (MeApd), si sposta il capillare a X = +2,50 mm, Y = -4,20 mm e zero Z (Dorso-Ventrale) mentre il capillare tocca leggermente il cranio.
    4. Sposta il capillare a X = -2,50 mm, Y = -4,20 mm nell'altro emisfero e abbassa leggermente il capillare fino a toccare il cranio.
    5. Controlla il valore di Z e regola l'asse mediale-laterale nel rig stereotassico per cambiare l'angolo di inclinazione della testa. Ripeti i passaggi da 2.10.1 a 2.10.4 finché la differenza nel valore Z tra gli emisferi destro e sinistro è di <0,03 mm.
11. Rimuovi il portacapilares e monta un microtrapano con una punta #75 in un porta-trapano stereotassico sul braccio stereotassico verticale.
12. Posiziona la punta della punta sopra il punto RCS, azzera le coordinate X (Mediale-Laterale) e Y (Anteriore-Posteriore). Sposta su X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm per puntare al MeApd dei neonati P11.
13. Forare una craniotomia di 0,5 mm di diametro attraverso il cranio.
14. Pulisci attentamente la superficie del cranio con soluzione salina sterile usando salviette delicate e cotton fioc.
    NOTA: Applica regolarmente soluzione salina sterile per mantenere idratata la superficie del cranio.

3. Iniezione virale

1. Riempi un nuovo capillare con olio minerale usando un ago flessibile microfil.
2. Attacca e stringi il capillare all'iniettore a nanolitri.
3. Rimuovi il microtrapano e monta l'iniettore nanolitrico sul braccio stereotassico verticale.
4. Ritira almeno il doppio della quantità di virus richiesta per l'intervento chirurgico (qui, 400 nL) a una velocità di 10 nL/s.
   NOTA: Qualsiasi virus AAV di interesse può essere utilizzato per iniezioni virali dopo l'approvazione istituzionale. In questo protocollo, abbiamo utilizzato AAV2-DIO-mCherry (BSL-1, 2,5 E+13 vg/mL, 3 μl/tubo, conservato a -80 °C e poi trasferito sul ghiaccio per l'intervento).
5. Sposta il capillare al punto RCS e azzera le coordinate X e Y.
6. Spostare il capillare nell'area cerebrale di interesse, qui il MeApd (coordinate: X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm, Z= -5,08 mm da RCS).
7. Abbassare il capillare alla superficie del cranio, poi azzerare la coordinata Z.
8. Crea un percorso abbassando il capillare alla profondità desiderata e ritirando il capillare fuori dal cervello.
9. Iniettare ~8 nL di virus per assicurarsi che il capillare non sia ostruito prima di reinserirlo nel cervello. Se è intasato, aggiungi soluzione salina sterile al tergicristallo e pulisci delicatamente i lati e la parte inferiore del capillare per eliminare l'ostruzione.
10. Abbassare il capillare un'altra volta alla profondità desiderata e iniettare la quantità virale desiderata (in questo caso, 150 nL di virus) a una velocità di 20 nL/min.
11. Quando hai finito, aspetta 5 minuti prima di ritirare lentamente il capillare.
12. Se necessario, ripetere i passaggi 3.4-3.11 per iniettare il virus nell'emisfero controlaterale.
13. Rimuovi il capillare dall'iniettore a nanolitri. Scartare i capillari usati e i tubi virali in un tubo conico da 50 mL con candeggina al 10%.
    NOTA: I singoli laboratori devono seguire tutte le linee guida di gestione dei rifiuti, gestione delle fuoriuscite e conformità alla biosicurezza fornite dal loro Institutional Biological and Biosafety Branch.
14. Sutura la pelle con una sutura 7-0 non assorbibile. Prova a sollevare i capelli durante la sutura così che i punti restino nascosti.
    NOTA: Tipicamente, 3-4 punti di sutura sono sufficienti. Nelle nostre mani, una sutura 7-0 funziona meglio per evitare che la madre rompa i punti una volta che il neonato viene riportato nella gabbia di casa.
15. Strofina l'area della sutura con perossido di idrogeno al 3%, seguito da soluzione salina usando cotton fioc sterili.
    NOTA: L'intervento dura tipicamente tra 1 e 2 ore, a seconda del numero di virus iniettati. I virus richiedono tipicamente un minimo di 2 settimane per l'espressione completa.

4. Cure post-operatorie

1. Togli il neonato dal telaio stereotassico e mettilo in una gabbia pulita sopra una borsa riscaldante. Per prevenire la disidratazione, si raccomanda l'iniezione di soluzione salina sterile.
2. Monitora il neonato finché non si muove.
3. Quando il neonato può muoversi nella gabbia, metti la diga in una nuova gabbia pulita per ~2 minuti.
4. Mettete il cucciolo nella gabbia originale insieme ai suoi fratelli di cucciolata. Pulisci con cura tutti i piccoli con materiale per il nido e la lettiera dalla gabbia di casa, poi rimettili all'interno del nido. Procedi a rimettere la diga nella gabbia.
5. Monitorate attentamente la madre e i neonati. Conferma che la madre torni al nido e si togli il neonato chirurgico ma non tiri i punti di sutura.
6. Se dopo 1 ora la madre non accetta il neonato chirurgico, si usa una madre affidataria. Se una madre ha già dimostrato di accettare i cuccioli, usa questa diga per le cucciolate successive (l'accettazione dopo aver accettato i piccoli nella prima cucciolata è stata al 100%).
7. Ventiquattro ore dopo l'intervento, controllate il sito dell'incisione e somministrate Meloxicam (5 mg/kg, s.c.).
8. Dopo cure postoperatorie di successo, lasciare il topo chirurgico con la madre e i fratelli di cucciolata fino allo svezzamento a P21. Rimuovi eventuali punti di sutura visibili entro 10-14 giorni dall'intervento.
   NOTA: Non si prevedono differenze significative nell'apporto di cibo, nel peso corporeo o nel comportamento di locomozione nei topi chirurgici rispetto ai controlli di cucciolate.
   I neonati saranno monitorati quotidianamente per almeno 2 giorni dopo l'intervento e poi almeno 2 volte a settimana. Criteri umani per il punto finale: Se il neonato non è ambulato dopo 2 ore dall'intervento, sarà soppresso in modo umano. Se il neonato mostra una diminuzione del peso corporeo e/o della locomozione dopo l'intervento, sarà soppresso in modo umano.

Risultati

Sicurezza della combinazione di isoflurano, bupivacaina e meloxicam per gli interventi chirurgici infantili
La sicurezza dell'uso di anestesia e analgesia nei topi neonati rimane^{incerta 6}. Pertanto, abbiamo testato l'uso di una combinazione di anestesia e analgesia nei topi neonati per determinarne il tasso di sopravvivenza. I topi neonati con P11 (peso corporeo = 6,09 ± 0,90 g, il peso corporeo minimo era 3,9 g; n=13) sono stati inseriti nella camera di induzione per l'anestesia iniziale con isoflurano al 3% in 0,9 L/min di ossigeno. Una volta che i neonati erano anestetizzati e non rispondevano al riflesso di ritiro dei pedali, venivano trasferiti all'apparato stereotassico e l'anestesia isoflurana veniva ridotta all'1,5-2% di isoflurano in 0,9 L/min di ossigeno con un cuscinetto riscaldante (41,23 ± 2,28 °C). Dopo la collocazione dei neonati nell'apparato stereotassico, è stata somministrata un'analgesia interscapolare (5 mg/kg Meloxicam) e anestesia topica somministrata sotto la pelle della testa (0,05 mg/mL di bupivacaina). Trenta minuti dopo, abbiamo tolto i piccoli dal sistema stereotassico e li abbiamo messi in una gabbia pulita. Abbiamo osservato un tasso di sopravvivenza del 100% (13/13) 30 minuti dopo la somministrazione dell'analgesia. Inoltre, non abbiamo osservato complicazioni né 24 e 72 ore dopo l'intervento, né fino all'età adulta. Questi risultati dimostrano che combinare anestesia locale con un farmaco antinfiammatorio non steroideo è sicuro per i topi neonati e riduce dolore e disagio.

Consegna virale precisa e accurata nel MeA
Per confermare l'accuratezza e la precisione della somministrazione virale durante gli interventi stereotassici infantili, abbiamo somministrato bilateralmente AAV2-hSyn-DIO-mCherry nel MeApd di topi maschi Foxp2^cre+/- a P11 (Figura 3A). I topi sono stati poi svezzati a P21. A P45, sono stati raccolti cervelli di topo per immunoistochimica e analisi delle immagini come descritto in precedenza dal nostro gruppo¹⁴ e dagli^{altri 16} (Figura 3B,C). I topi sono stati anestetizzati e perfusi con 30 mL di PBS 1×, seguiti da 30 mL di PFA al 4% a 10 mL/min. I cervelli sono stati post-fissati durante la notte a 4 °C con PFA al 4%, crioprotetti con saccarosio al 30%, inseriti in O.C.T. e sezionati a 50 μm su criostato. Ogni terza sezione è stata processata per immunoistochimica come descritto in^{precedenza, 14}. Le sezioni libere sono state bloccate nel siero normale al 10%, incubate con l'anticorpo primario durante la notte, lavate, incubate con l'anticorpo secondario per 4 ore, lavate nuovamente e montate con un mezzo contenente DAPI prima di scorrere. Le sezioni cerebrali sono state colorate con anticorpi Foxp2 e Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L).

Per confermare l'efficienza del bersaglio, abbiamo determinato la co-espressione delle cellule mCherry⁺ e ^Foxp2+ nella MeA e osservato sovrapposizioni del 90,2% ± 2,1 tra popolazioni, indicando che l'espressione di mCherry è limitata alle cellule Foxp2+ in modo dipendente da Cre (Figura 3D). Questo risultato evidenzia l'elevata efficienza dell'iniezione virale utilizzando questo protocollo. Inoltre, abbiamo indagato l'accuratezza delle iniezioni virali analizzando la percentuale di cellule mCherry+ nel MeApd rispetto alla percentuale totale di mCherry in tutte le regioni. Abbiamo osservato che il 93,7% ± 1,4 delle cellule mCherry⁺ si trovavano all'interno del MeApd, indicando che l'espressione spaziale del virus è limitata alla nostra regione di interesse (Figura 3E).

Figura 1: Preparazione per la chirurgia stereotassica neonatale. (A) Apparato stereotassico. (B) Barre auricolari anti-rottura. (C) Portatesta per anestesia a gas e barra per il palato per neonati P12. (D) Sterilizzatore per perline. (E) Controller della base riscaldante. (F) Braccio stereotassico. (G) Iniettore a nanolitri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Principali punti di riferimento nel cranio del topo P11. (A) Illustrazione schematica dei principali punti di riferimento nel cranio del neonato. (B) La testa del neonato è fissata da accessori stereotassici specializzati che includono cuffie anti-rottura, un portatesta a gas modificato e una barra per pellet per topi P12. Abbreviazione: RCS = confluenza rostrale dei seni paranasali, SSS = seno sagittale superiore, RRV = vene rostrali-rinali, SOS = seno olfattivo superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Espressione virale bilaterale mirata nel MeApd dopo un intervento stereotassico infantile. (A) Illustrazione schematica della MeApd (vista coronale). (B) Immagine istologica rappresentativa dell'espressione bilaterale dell'anticorpo Foxp2 (verde) e delle cellule mCherry⁺ (magenta) nei maschi adulti di topo^{Foxp2 cre+/-} adulti. (C) Vista ampliata del MeA sia dai canali fusi che da quelli individuali. Le frecce bianche indicano anticorpi Foxp2 co-marcati e cellule mCherry⁺ . (D) Efficienza dell'iniezione. (E) Precisione dell'iniezione. (D,E) n=3 topi, emisferi/topo sinistro e destro. Abbreviazioni: MeApd = amigdala mediale posterodorsale; MeApv = amigdala mediale posteroventrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metodi	Pro	Contro	Riferimento
Elettroporazione in utero	Transfezione di plasmidi di maggiori dimensioni	Mancanza di mira precisa, tossicità, necessita di essere altamente qualificati	Wang, et al., Methods Mol Biol. (2013).
Iniezione virale intracerebroventricolare	Veloce, facile, economico	Mancanza di puntamento preciso, rischio di infanticidio	Kim, et al., J Vis Exp. (2014).
Microiniezione stereotassica a P0	Targeting preciso, minore rischio di rigetto materno	Tossicità cellulare dovuta al virus, non ideale per studiare i momenti post-pubertali	Chen, et al., J Vis Exp. (2018).
Incrocio genetico delle linee di ricombinasi	Non invasivi	Mancanza di puntamento preciso, costoso	Robertson et al., Nat Neurosci. (2013).

Tabella 1: Riepilogo dei metodi precedenti utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale e postnatale cellulare e circuitale nei roditori.

Discussione

Studiare i meccanismi neurali alla base dei comportamenti sociali nello sviluppo postnatale è essenziale per comprendere non solo la loro emergenza, ma anche come questi meccanismi possano essere interrotti da fattori ambientali o nei disturbi neurosviluppativi. Il nostro studio descrive un protocollo dettagliato per la chirurgia stereotassica per somministrare il virus in modo preciso ed efficiente nei cervelli dei topi neonati P11-12. Pertanto, questo protocollo consente la manipolazione, la registrazione e lo studio dei circuiti di sottopopolazioni neuronali definite molecolarmente prima e dopo la pubertà utilizzando una strategia virale. Mettiamo in evidenza le modifiche e le cure pre e post-operatorie, oltre a una combinazione sicura di anestesia e analgesia ben tollerata dai topi neonati.

Un elemento chiave e impegnativo della chirurgia stereotassica neonatale è reintrodurre con successo il neonato nella gabbia di casa insieme alla madre e ai fratelli di cucciolata. Per garantire una cura adeguata del neonato al momento della reintroduzione nella gabbia, la madre dovrebbe recuperare e toelettare il neonato (senza toelettatura eccessiva), e qualsiasi segno di possibile trascuratezza deve essere monitorato attentamente. A causa dell'incisione e delle suture del neonato, la madre potrebbe toelettare eccessivamente la zona della testa, potenzialmente causando lacerazioni e rimozione dei punti. Questo sarebbe dannoso e, per questo motivo, monitorare il comportamento della madre verso il neonato dopo l'intervento è fondamentale per garantire la sopravvivenza. Per aumentare l'accettazione del neonato dopo l'intervento, raccomandiamo l'uso di perossido di idrogeno e soluzione salina dopo la sutura per rimuovere eventuali residui di sangue residui sulla pelle e dal pelo e di utilizzare suture più sottili (7-0) rispetto a quelle usate negli adulti (5-0). Queste due strategie portarono all'accettazione da parte della madre di topi neonati post-operatori.

Inoltre, il nostro studio fornisce indicazioni sull'uso sicuro di anestesia e analgesia per gli interventi chirurgici neonatali. Questo è fondamentale poiché neonati e topi neonati non resistono a dosaggi di analgesia e anestesia come gli adulti, il che può portare a effetti collaterali gravi per le malattie respiratorie e^{cardiache 6}. Abbiamo osservato che l'isoflurano, anestesia orale, e la combinazione di analgesia di meloxicam e bupivacaina, somministrate sottocutaneamente (intracuspolare e sotto la pelle della testa, rispettivamente), erano ben tollerati dai neonati e garantivano una sopravvivenza a lungo termine. Inoltre, abbiamo già dimostrato che la procedura chirurgica stereotassica nei topi neonati ha portato a tempi di ricerca simili per i conspecifici nei topi giovani 2 settimane dopo l'intervento, rispetto ai controlli con età, che non hanno subito^{l'intervento 14}. Pertanto, questi risultati indicano un recupero sufficiente e nessun deficit motorio evidente dopo l'intervento chirurgico nei topi neonati. Da notare che non abbiamo misurato l'ossigenazione del sangue durante tutto l'intervento. I livelli di ossigeno nel sangue dovrebbero essere monitorati con un ossimetro di polso per prevenire^{l'ipossia 17}.

Un altro componente fondamentale di questo protocollo è l'uso del sistema di coordinate stereotassici basato sulla lambda e sull'RCS sulla linea media^{sagittale 15}. La RCS è un punto di riferimento definito dalla giunzione tra il seno sagittale superiore e la giunzione del seno olfattivo superiore lungo la linea mediana sagittale. Questo punto di riferimento ha dimostrato di mostrare costantemente una variabilità posizionale inferiore rispetto ad altri punti dorsali dopo l'allineamento globale della testa. Questo è vero perché l'aumento della distanza di separazione tra RCS/lambda, rispetto a bregma/lambda, aumenta la stabilità e la riproducibilità dell'angolazione orizzontale^{inter-animale 15}.

I metodi precedenti per studiare lo sviluppo neuronale si sono concentrati su strategie virali ai momenti embrionali e P0, o su incroci genetici per cellule di interesse che mappano il destino (Tabella 1). Tecniche come l'elettroporazione in utero e le iniezioni virali intracerebroventricolari mancano di un targeting preciso. Eseguire iniezioni virali mirate a P0¹⁸ supera questo problema iniettando con precisione una struttura virale in una regione di interesse. Tuttavia, i costrutti virali possono diventare citotossici dopo diverse settimane, portando alla morte cellulare. Pertanto, iniettare un costrutto virale nel cervello del neonato per studi pubertari longitudinali che potrebbero proseguire fino all'età adulta potrebbe non essere l'ideale. Pertanto, il nostro approccio, in cui l'iniezione virale avviene una settimana e mezza dopo la nascita, riduce il rischio di tossicità cellulare durante la pubertà.

Nonostante i vantaggi del nostro approccio, rimangono diverse considerazioni. Innanzitutto, le coordinate cerebrali usate nei topi neonati devono essere modificate rispetto a quelle usate negli adulti. Ad esempio, nei topi neonati P11, usiamo le seguenti coordinate per puntare il MeApd: X= +2,03 mm, Y= -4,20 mm, Z= -5,08 mm; mentre le coordinate usate negli adulti sono X= +2,15 mm, Y= -5,00 mm, Z= -5,10 mm. Purtroppo, ci sono meno riferimenti agli atlanti cerebrali per topi^{prepuberali 19} rispetto a quelli per topi adulti (Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org e atlas.brain-map.org)^20,21. Pertanto, per raggiungere con successo un corretto targeting virale in altre regioni cerebrali oltre il MeA, i ricercatori dovranno ottenere una stima informata delle coordinate e effettuare test delle coordinate. In secondo luogo, è necessario considerare il tempo di incubazione degli AAV. Il tempo di incubazione ottimale per l'espressione in vivo dell'AAV è di almeno 2-3 settimane. Considerando che, nel nostro protocollo, la chirurgia stereotassica viene eseguita su topi neonati a P11, i ricercatori potranno iniziare a testare i topi solo dopo l'intervento a P25, dopo il periodo ottimale di incubazione dell'AAV.

Nel complesso, questo protocollo fornisce linee guida dettagliate per i ricercatori per colpire con grande precisione le regioni cerebrali di interesse nei topi neonati utilizzando vettori virali. Questo approccio è molto vantaggioso, poiché estremamente flessibile: qualsiasi costruzione AAV commerciale o su misura può essere iniettata. Pertanto, consente di studiare sottopopolazioni cellulari di interesse definite molecolare e dei loro circuiti anatomici, dinamiche neuronali e ruolo cellulare prima e dopo la pubertà durante una finestra temporale critica in linea con l'emergere dei comportamenti sociali. Inoltre, questo approccio ha successo per colpire non solo l'amigdala, come mostrato qui, ma anche altre strutture sottocorticali, come l'ipotalamo e le regioni corticali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Punta da trapano #75	Città della Punta da Perforazione	10WS75-850FL
Ago da 27 G	Covetrus	60757
Perossido di idrogeno al 3%	Swan	NDC 0809-0871-43
32% paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	15714
AAV2-hSyn-DIO-mCherry	Addgene	50459-AAV2
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey (1:1000) Anti-Coniglio IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	711-545-152
Bilanciamento Analitico	Sartorius	1102--15
Betadine	Farmacia Avrio	NDC 67618-155-15
Bupivacaina	Hospira	NDC 0409-1163-18
Criostato	Leica	CM1950
Microscopio dissezionale	Zeiss	2149-629
Pomata per gli occhi	Dechra Veterinary	Puralube
Supporti di montaggio Fluoromount con DAPI	Thermo Fisher Scientific	00-4959-52
Anticorpo Foxp2 (1:1000)	Anticorpi Atlas/Bio Cosmo	HPA000382
Foxp2cre+/- topi	Il Laboratorio Jackson	30541
Portatesta e barretta per il palato per anestesia a gas per cuccioli P12	David Kopf Instruments	1934-C
Sterilizzatore per perline di vetro	Fisher Scientific	10-000-632
Capillare di vetro	Strumenti di Precisione Mondiale	504949
Porta-pipette in vetro	David Kopf Instruments	1975-1.2-A
Cuscina termica	Kent Scientific  Corporation	RT-0520
Isoflurano	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-10
Meloxicam	Fornitura Veterinaria Pivetal	NDC 46066-937-13
Micro Trapano	David Kopf Instruments	Drill modello 1911
Ago flessibile Microfil	Strumenti di Precisione Mondiale	MF28G67-5
Vetri per microscopio	Thermo Fisher Scientific	12-550-15
Olio minerale	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Iniettore a nanolitri	Strumenti di Precisione Mondiale	NANOLITER2020
Sutura non assorbibile	Chirurgia AD	S-N718SP13
Barre auricolari non rapture	David Kopf Instruments	1921-A
Siero Normale per Asino	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Complesso O.C.T.	Sakura	4583
Impianto stereotassico	David Kopf Instruments	1900
Sterile Cotton Swab	ULINE	S-21102
Drappeggio sterile	Usa e getta dell'ospedale Busse	696
Soluzione salina sterile	Hospira	NDC 0409-1966-02
Acqua sterile	Hospira	NDC 0409-4887-24
Sucrosio	Fisher Chemical	S5-500
Siringa	Fisher Scientific	50-252-2568