Protocollo chirurgico per una grande finestra cranica richiudibile che consente registrazioni elettrofisiologiche longitudinali e multimodali della rete in modalità predefinita del mouse

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo chirurgico a due fasi per creare una grande finestra cranica richiudibile e conservatrice della durata nei topi. Questa tecnica consente registrazioni elettrofisiologiche croniche e multimodali da reti cerebrali profonde distribuite, come la Default Mode Network, nell'arco di diverse settimane.

Abstract

La rete in modalità predefinita (DMN) è una rete cerebrale centrale su larga scala implicata in una serie di funzioni cognitive e disturbi neuropsichiatrici, come il disturbo depressivo maggiore (MDD). Studiare le dinamiche complesse della DMN nei modelli animali fornisce preziose informazioni sul suo funzionamento sia in stati sani che patologici. Tuttavia, eseguire registrazioni elettrofisiologiche stabili, a lungo termine e su larga scala dai molteplici nodi profondi e distribuiti del DMN in topi svegli e comportati rimane una sfida significativa.

Qui viene presentato un nuovo protocollo chirurgico bifaico per creare una grande finestra cranica (4 mm × 7,6 mm), duratura e richiudibile nei topi. La procedura è progettata per preservare l'integrità della dura madre, fondamentale per la salute cerebrale a lungo termine e la stabilità della registrazione.

Questa finestra consente registrazioni longitudinali simultanee e ripetute da oltre 1.000 elettrodi combinando microelettrocorticografia superficiale (μECoG) con due sonde ad elettrodi intracranici ad alta densità, fornendo un accesso senza precedenti alla DMN. Questa tecnica fornisce una piattaforma robusta per l'interrogazione multimodale e su scala multipla delle dinamiche elettrofisiologiche a livello di rete per diverse settimane, aprendo nuove strade per indagare i cambiamenti neuroplastici alla base della fisiopatologia dei disturbi cerebrali e per valutare gli effetti cronici di nuove terapie.

Introduzione

La Rete Modalità Default (DMN) è stata identificata per la prima volta negli studi di imaging cerebrale umano come una costellazione di regioni costantemente soppresse durante compiti orientati all'esterno e che richiedono attenzione¹. Oggi è considerata una rete fondamentale su larga scala che supporta processi cognitivi orientati all'interno, come il pensiero autoreferenziale, la memoria autobiografica e la pianificazione di eventi^{futuri 2,3}. Negli esseri umani, la DMN canonica comprende un insieme di regioni centrali anatomicamente connesse, tra cui la corteccia prefrontale mediale (mPFC), la corteccia cingolata posteriore (PCC), il lobulo parietale inferiore (IPL) e la formazione^{ippocampale 4}. La disfunzione all'interno di questa rete è una caratteristica chiave di diversi disturbi neuropsichiatrici. Nel disturbo depressivo maggiore (MDD), la DMN presenta comunemente iperattività e schemi alterati di connettività funzionale, che si ritiene siano alla base dei sintomi fondamentali del MDD, come la ruminazione e l'immagine negativa di sé ^5,6.

Per studiare i meccanismi cellulari e dei circuiti che guidano la disfunzione del DMN, modelli animali robusti sono indispensabili. Un DMN omologo è stato identificato in modo affidabile nei roditori, composto da regioni cerebrali comparabili come mPFC, corteccia cingolata e corteccia retrospleniale (RSP), convalidando così il topo come modello traslazionalmente rilevante per l'indagine^{meccanicistica 7,8}. Inoltre, lo stress cronico, un fattore chiave nella depressione, ha dimostrato di alterare la connettività DMN nei roditori in modo simile a quello osservato nei pazienti umani con^{MDD 9}.

Comprendere i cambiamenti neuroplastici che si verificano negli stati patologici o in risposta a interventi terapeutici cronici richiede un'osservazione longitudinale dell'attività neurale, poiché una singola sessione di registrazione non può catturare l'adattamento dinamico dei circuiti neurali nel^{tempo 10}. L'elettrofisiologia in vivo fornisce la risoluzione temporale a scala di millisecondi necessaria per studiare le oscillazioni neurali e la sincronia nel potenziale di campo locale (LFP). LFP mostra il segnale extracellulare sommato che riflette l'attività sinaptica sincronizzata delle popolazioni neuronali locali, che sono i substrati fondamentali della comunicazione di^{rete 11,12}. Tuttavia, eseguire registrazioni elettrofisiologiche croniche su larga scala su topi svegli rimane tecnicamente impegnativo. Le finestre craniche croniche convenzionali sono state sviluppate per l'imaging ottico nel topo sveglio e rimangono la preparazione standard a tale scopo, dove la loro tipica impronta a emisfero singolo e il vetrato trasparente sono ottimali per la lettura^{prevista 13}. Tuttavia, non erano progettati per l'elettrofisiologia multi-sito di veglia, quindi l'area di lavoro e l'interfaccia ottica impediscono la registrazione simultanea ad alta densità dai nodi bilaterali distribuiti di una rete come la^{DMN 14}. Gli impianti cronici di elettrodi, a loro volta, permettono registrazioni longitudinali ma provocano un progressivo incapsulamento di corpi estranei e cicatrici gliali attorno al gambo permanentemente posizionato, riducendo la qualità del segnale nel^{tempo 15,16}.

La procedura chirurgica in due fasi descritta qui affronta direttamente queste limitazioni. Produce una grande finestra cranica richiudibile tra le sessioni da una membrana passiva a polidimetilsilossano (PDMS), un sigillante siliconico e un cappuccio stampato in 3D che consente l'inserimento ripetuto e non terminale di griglie μECoG per registrazioni LFP mesoscale insieme a molteplici sonde intracraniche ad alta densità per microscala, unità singole risolute laminari e attività^{LFP 17,18}. A differenza degli approcci cronici precedenti, che si basano su array di elettrodi impiantati permanentemente che accumulano l'incapsulamento gliale degli elettrodi nel tempo oppure richiedono craniotomie acute terminali che impediscono disegni longitudinali, la finestra descritta qui preserva una dura intatta ed evita il contatto permanente con corpi estranei 15,16,18. Inoltre, in una coorte di validazione in cui la finestra cranica è stata riaperta tre volte (giorni post-operatori 0, 21, 22) senza registrazione elettrofisiologica, l'immunoreattività quantitativa della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e della molecola adattatrice ionizzata di calcio 1 (IBA1) non ha differenziato significativamente dai controlli non chirurgici, suggerendo una bassa astrogliosi e microgliosi secondo il programma di apertura ripetuta utilizzato qui. Il metodo è particolarmente adatto per registrazioni longitudinali multi-sito di reti corticali distribuite, inclusa la DMN, combinate con l'accesso laminare con sonde intracraniche ad alta densità a strutture profonde in topi svegli con la testa fissa. I suoi principali vincoli operativi sono le competenze microchirurgiche necessarie per la rimozione affidabile del lembo osseo conservatore della durate e la sua incompatibilità con le registrazioni a libero movimento, poiché le sonde ad elettrodo intracranico ad alta densità richiedono la fissazione della testa.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Consiglio nazionale degli Esperimenti Animali in Finlandia (numero di licenza: ESACI/40845/2022) e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la direttiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo riguardante la protezione dell'uso degli animali a scopi scientifici, nonché con le linee guida nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

NOTA: Tutte le procedure chirurgiche vengono eseguite all'interno di un cappuccio chirurgico a flusso laminare che è stato pre-sterilizzato con irradiazione ultravioletta (minimo 15 minuti) o con una completa decontaminazione superficiale con etanolo. Il gas di scarto isoflurano viene catturato da un sistema di recupero a carbone attivo montato all'interno della cappa. L'operatore indossa una copertura per capelli usa e getta, una mascherina chirurgica per il viso, un camice da laboratorio a maniche lunghe e guanti d'esame a strato singolo non sterili in nitrilo (spruzzati con etanolo all'80% prima di entrare nel cappuccio). Un contenitore per smaltimento di oggetti taglienti viene posizionato all'interno del cappuccio per lo smaltimento immediato di lame da bisturi e aghi ipodermici.

1. Preparazione preoperatoria e anestesia

1. Usa topi C57BL/6JRj, almeno 10 settimane e con un peso superiore a 20 g.
2. Prima dell'intervento, pulire tutti gli strumenti in un bagno a ultrasuoni caldo. Sciacqua, asciuga e lascia in ammollo al 70% di etanolo per almeno 15 minuti.
3. In alternativa, sterilizza gli strumenti con un breve passaggio attraverso una perla di vetro o uno sterilizzatore a infrarossi immediatamente prima dell'uso. Non si usano tende sterili. Tra gli animali consecutivi nella stessa sessione, rimettere gli strumenti in ammollo con etanolo per almeno 2^{min 19}.
4. Pesa ogni topo individualmente su una bilancia calibrata e calcola i volumi di farmaci preoperatori.
5. Preparare in anticipo le membrane sterili del PDMS (eseguite una volta per lotto, fuori dal giorno dell'intervento acuto).
   1. Getta membrane sterili di PDMS da una miscela 10:1 elastomero-agente di polimerizzazione preparata secondo le istruzioni del produttore e un foglio fino a uno spessore target di circa 500 μm incollando la miscela non polimerizzata tra due piastre di vetro borosilicato piatte, poi indurisci a 60 °C per almeno 2 ore.
   2. Sigilla le lastre stagionate in sacchetti autoclave e sterilizza tramite autoclaving a vapore. Nel cappuccio chirurgico pre-sterilizzato, si utilizza un bisturi sterile #11 e un piccolo righello in acciaio inox per tagliare ogni foglio in membrane rettangolari abbinate alle dimensioni della finestra cranica.
   3. Conservare le membrane pre-tagliate in oggetti da laboratorio sterili (ad esempio, singoli pozzi di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzi) fino all'utilizzo.
6. Esegui il controllo qualità hardware prima di ogni sessione di registrazione.
   NOTA: Non viene effettuato alcun controllo di impedenza di routine sull'array μECoG: i guasti del filo di riferimento sono facilmente evidenti nelle tracce grezze, e il test di impedenza viene attivato solo quando si sospetta un problema hardware. Le sonde ad elettrodi intracranici ad alta densità includono diagnostica integrata di impedenza e integrità del cavo accessibili tramite l'interfaccia grafica del software di registrazione; esegui questi dispositivi quando la qualità del segnale è dimostrabilmente compromessa.

2. Fase 1: Preparazione animale e impianto della corazza

1. Preparazione degli animali
   1. Anestetizzare il topo con isoflurano (induzione: 4%, mantenimento: 1,5−2,5%, portata di ossigeno di 0,5 L/min). Confermare la profondità dell'anestesia con la perdita del riflesso del pizzichio del dito del piede.
   2. Rasi il pelo dalla sommità della testa, approssimativamente dagli occhi al collo.
   3. Posiziona l'animale su una borsa riscaldante a retroazione dotata di un sensore interno calibrato per mantenere la temperatura corporea a 37 °C durante tutta la procedura. Applica la pomata carbomerica per gli occhi per prevenire la secchezza corneale.
   4. Fissa il mouse nel fotogramma stereotassico usando barre auricolari anti-rottura. Regolare la barra incisive in modo che il cranio sia piatto, con bregma e lambda alla stessa altezza dorsoventrale (orientamento piatto del cranio). Mantieni l'anestesia con isoflurano (1,5–2,5%) somministrato attraverso un cono nasale con una portata di ossigeno di 0,5 L/min.
   5. Somministrare analgesici e antinfiammatori preoperatori tramite iniezioni sottocutanee (s.c.): Carprofene (5 mg/kg), Buprenorfina (0,05 mg/kg) e Desametasone (2 mg/kg).
   6. Disinfetta l'area rasata con una soluzione di povidone-iodio.
   7. Iniettare la soluzione di lidocaina-epinefrina (s.c.) come anestetico locale sotto la pelle del cuoio capelluto.
2. Esposizione al cranio
   1. Fai una piccola incisione trasversale sulla linea dell'orecchio (circa 1 cm).
   2. Ingrandire progressivamente l'incisione estendendo il taglio lateralmente intorno alle orecchie e lungo ciascun lato della testa verso gli occhi, ma senza superare il taglio agli occhi. Completa l'esposizione facendo un taglio diagonale su ciascun lato verso la linea mediana in modo che l'intera superficie dorsale del cranio sia esposta.
3. Pulizia del cranio
   1. Pulisci meticolosamente il cranio esposto con acetone di laboratorio. Immergi un cotton fiampon sterile nell'acetone, elimina il solvente in eccesso (impedendo la perdita di colpi sui tessuti adiacenti) e applica sull'osso finché non è stato rimosso tutto il periosto visibile.
   2. Usa l'acetone per la sua capacità di dissolvere residui grassi e residui membranosi persistenti sulla superficie ossea, non come disinfettante.
      NOTA: La completa rimozione del periosto e dei residui lipidici dalla superficie ossea è fondamentale per una forte adesione della piastra e del cemento dentale. Poiché l'impianto deve resistere alle tensioni meccaniche generate dal topo sveglio, qualsiasi periosto residuo o pellicola lipidica all'interfaccia adesiva ossea diventa un punto dominante di rottura.
   3. Utilizzare una lama microchirurgica (circolare) smussata per rimuovere eventuali frammenti residui di tessuto periostico e connettivo che il lavaggio con acetone non ha completamente sciolto. Tenelo a circa 45° rispetto alla superficie ossea e raschiare il cranio con leggeri colpi radiali diretti verso l'esterno dalla giunzione bregma–linea mediana verso i bordi laterali dell'osso esposto.
   4. Continuare finché l'intera superficie ossea esposta non è stata attraversata almeno una volta e appare uniformemente pulita e opaca.
   5. Concludere con un ultimo breve passaggio di pulizia usando acetone su un applicatore con punta di cotone.
4. Segnatura del sito della craniotomia
   1. Attacca un marcatore chirurgico biocompatibile alla base stereotattica digitale.
   2. Segna un'area rettangolare di 4 mm × 7,6 mm sul cranio rispetto al bregma.
      1. Naviga la punta del marcatore fino al bregma e reimposta le coordinate X e Y sulla lettura digitale a zero.
      2. Traslare il braccio a ciascuno dei quattro angoli della finestra prevista, in modo che il rettangolo si estenda lateralmente di 2 mm dal bregma su entrambi i lati, 3 mm rostralmente e 4,6 mm caudali, e posiziona un singolo punto a ciascun angolo.
5. Segna i due siti di inserimento della sonda intracranica sull'emisfero destro.
   1. Segna il sito della sonda rostrale a 1,66 mm A/P e 1,95 mm M/L dal bregma.
   2. Segna il sito della sonda caudale a -2,2 mm A/P e 1,9 mm M/L dal bregma.
      NOTA: Questi siti sono adattati per rivolgersi a regioni specifiche DMN. I siti di inserimento possono essere regolati su più regioni diverse con questo protocollo.
   3. Stacca il marcatore dal braccio stereotattico.
   4. Tieni un bordo dritto sterilizzato e flessibile (ad esempio, una sottile carta di plastica) contro il cranio e collega i quattro punti agli angoli con il pennarello per delineare la futura finestra cranica come un rettangolo continuo.
6. Aumentare la superficie per una migliore adesione
   1. Esegui tutti i passaggi seguenti fino alla sezione 4 al microscopio binoculare.
   2. Incidere un motivo incrociato su tutte le superfici ossee esposte al di fuori dell'area designata della finestra utilizzando una lama chirurgica #11 e produrre scanalature superficiali ma definite profonde 0,2–0,4 mm per formare una griglia uniforme di circa 1 mm × 1 mm quadrati.
      NOTA: Questo aumenterà l'area superficiale efficace e quindi la presa meccanica dell'adesivo e del cemento dentale sovrastanti.
   3. Crea un applicatore di colla fine applicando un ago sterile da 30 G sulla punta di un cotton fioc a collo lungo e piegando l'ago a forma di V.
   4. Dispensa la colla cianoacrilato in una pesatrice di plastica usa e getta e immergi l'applicatore nel serbatoio della colla.
   5. Deposita della colla su ogni superficie ossea esposta e incisa, applicando non più di un singolo deposito per sito, così da una copertura approfondita ma mai eccessiva. Lascia asciugare la colla per 7 minuti.
7. Impianto della presa di riferimento
   1. Seleziona un sito di perforazione sopra il cervelletto sinistro posizionato per evitare vasi superficiali visibili.
   2. Monta il trapano dentale su un portatrapano nel braccio stereotattico.
   3. Forare il foro pilota a scatti da 5–10 secondi usando una bura d'acciaio rotonda a 20.000–25.000 giri/min, ritraendo la punta tra una scatta e l'altra per ispezionare il sito sotto il binocolo.
   4. Trapano finché il foro non diventa più traslucido, rivelando una lieve sfumatura rosa e la dura dura diventa visibile attraverso l'osso assottigliato.
   5. Smetti subito di forare a questo punto per evitare penetrazione durale. Dimensionare il foro finito a un diametro di circa 0,5 mm, solo leggermente più grande del diametro esterno della presa di riferimento.
   6. Inserire la presa di riferimento placcata oro nel foro pilota, fissarla con colla cianoacrilato e rinforzare la giunzione con cemento dentale polimerizzabile ai raggi UV. Indurisci il cemento dentale con una penna a diodo a emissione luminosa (LED) da 405 nm per 1 minuto.
8. Impianto della piastra frontale
   1. Applicare una piccola quantità di cemento dentale polimerizzabile ai raggi UV sull'apice dell'osso rostrale esposto (il punto più vicino al naso) per fungere da supporto livellante.
   2. Adagiare la piastra sulla testa in modo che un bordo poggi sull'impalcatura in cemento dentale attenuata attorno alla presa di riferimento (passo 2.7.6), e con il bordo opposto appoggiato sul fresco dab di cemento rostrale.
   3. Allineare la piastra frontale in modo che il suo asse lungo sia centrato sulla linea centrale sagittale e le sue due maniglie di fissazione si estendano perpendicolarmente (90°) all'asse mediano. Polimerizza il composito sotto la luce UV per bloccare la piastra frontale in posizione.
   4. Rinforzare la struttura applicando strati successivi di cemento dentale polimerizzabile ai raggi UV di circa 1 mm di spessore depositato attorno alla base della piastra della testa, circondando l'osso inciso e l'alveolo di riferimento, fino a formare un recinto continuo e sigillato attorno al perimetro della futura finestra cranica.
   5. Indurisci ogni incremento separatamente con una penna di polimerizzazione LED da 405 nm per 40 secondi a una distanza di lavoro di 1–2 cm, assicurando una polimerizzazione completa prima di applicare lo strato successivo. Assicurati che la parete in cemento finito si estenda a filo con la superficie superiore della piastra e racchiuda completamente il perimetro di osso esposto senza sovrapporsi all'area segnata della finestra.
9. Lascia che il topo si riprenda dall'anestesia. Riporta il topo nella sua gabbia di casa per almeno 48 ore.
10. Prima di procedere con la sezione 3, verifica che l'animale sia tornato entro il 5% rispetto al suo peso corporeo pre-operatorio e non mostri segni di dolore sulla scala della smorfia^{del topo 20}. Se uno di questi criteri non viene soddisfatto, estendi il periodo di recupero fino a quando non sono soddisfatti.
    NOTA: Questo design a stadi con intervallo di recupero inter-chirurgico è fondamentale. Permette all'animale di recuperare dallo stress fisiologico e dall'infiammazione iniziali prima della craniotomia, il che si è dimostrato migliorare i tassi di successo chirurgico e la salute a lungo termine dell'impianto; Qui si utilizza un minimo di 48 ore, e un impianto cranico a stadi con intervallo di recupero di più giorni tra la fissazione della piastra frontale e la craniotomia ha dimostrato di ridurre l'infiammazione peri-operatoria e migliorare la qualità della preparazione a lungo^{termine 14}.

3. Fase 2: Creazione cronica di finestre craniche

1. Preparazione preoperatoria
   1. Preparare l'area chirurgica e gli strumenti come descritto nella sezione 1.
   2. Ri-anestesiare il topo con isoflurano (induzione 4%, mantenimento 1,5–2,5%)
   3. Posiziona il mouse nel frame stereotassico come descritto nel passo 2.1.4.
   4. Somministrare i farmaci preoperatori alle stesse dosi descritte nel passo 2.1, ad eccezione dell'anestetico locale lidocaina-epinefrina (la pelle del cuoio capelluto è già stata rimossa nella Fase A, quindi non è più applicabile).
2. Forare la finestra
   1. Inizia a assottigliare l'osso con un trapano dentale lungo il contorno rettangolare indicato nella Fase 1 (passo 2.4). Inizia a 25.000 RPM con il dispositivo di perforazione tenuto perpendicolare (≈ 90 °) alla superficie ossea e esegui uno o due passaggi leggermente più profondi lungo i bordi rettangoli per stabilire una scanalatura iniziale di taglio.
      NOTA: La velocità di inizio della trappola può essere regolata in base al livello di esperienza dell'operatore.
   2. Scavare scanalature (profonde circa 0,2–0,3 mm) nell'osso e nel cemento dentale adiacenti alla finestra cranica alle due coordinate di inserimento della sonda indicate nel passo 2.5.
      NOTA: Questi solchi fungono da punti di riferimento visivi persistenti che rimangono visibili dopo la rimozione del lembo osseo e vengono utilizzati per riposizionare riproducibilmente le sonde intracraniche nelle successive sessioni elettrofisiologiche.
   3. Applicare regolarmente durante la perforazione liquido cerebrospinale artificiale sterile e freddo (ACSF; preparato secondo la ricetta contenente cefazolina di Goldey et ^al.14) per prevenire danni termici alla corteccia sottostante e minimizzare le emorragie¹⁴.
   4. Riduci progressivamente la velocità del trapano a 20.000 RPM man mano che l'osso si assottiglia e inclina il manovra a ≈ 45°, permettendo all'operatore di stabilizzare il trapano contro la mano e di passare a colpi più delicati e controllati.
3. Rimozione del lembo osseo (passo critico)
   1. Continua a forare lungo il perimetro rettangolare finché l'osso all'interno del contorno non si assottiglia circa al 90%. Non forare completamente il cranio.
   2. Confermare lo spessore osseo rimanente usando due controlli complementari:
      1. Al microscopio binoculare, batti delicatamente sul bordo della mensola ossea assottigliata con uno strumento smussato. L'entità della deviazione prodotta da un colpo leggero fornisce un'indicazione diretta dello spessore osseo residuo.
      2. Applicare ACSF gelato sulla finestra perforata e ispezionare immediatamente con il binocolo: per i primi 20–30 secondi, prima che l'ACSF penetri nell'osso, lo strato fluido aumenta nettamente il contrasto visivo, risolvendo i capillari corticali sottostanti ovunque l'osso sia stato assottigliato vicino alla durata, mentre le regioni di spessore residuo rimangono relativamente opache sotto il fluido. Una volta che il lembo appare uniformemente traslucido e dimostrabilmente flessibile, procedere al passo 3.3.3.
   3. Passa al fine gancio curvo a dura, che termina con una punta piegata a 90°. Inserire la punta sotto il bordo dell'osso assottigliato con estrema cautela a un angolo di circa 15° rispetto alla superficie ossea e far scorrere l'uncino lungo il perimetro della finestra, staccando con cura il lembo osseo dal cranio circostante e dal tessuto sottostante.
   4. Si lavora progressivamente da un angolo all'altro lungo i lati laterali su entrambi i lati, e infine si avanza dagli angoli verso il centro del rettangolo finché l'intero perimetro non si stacca dalla duratem sottostante.
   5. Non applicare alcuna pressione verso il basso sull'uncino della dura dura mentre scivoli ed evita di toccare il cervello.
      NOTA: Alternando angoli diagonalmente opposti con un angolo di gancio ridotto si distribuisce lo stress meccanico in modo uniforme attorno al lembo osseo. Questa strategia previene le lacerazioni durali e preserva la salute a lungo termine del tessuto cerebrale sottostante.
   6. Non forzare alcun movimento se l'uncino incontra resistenza focale in un angolo. Invece, abbassa il lembo e torna al passo 3.4 per diluire ulteriormente la regione aderente.
      1. Se si verifica una lacerazione durale, interrompere la procedura per quell'animale (riconosciuta da un improvviso rigonfiamento focale, una fuoriuscita di liquido rosa o un sanguinamento arterioso rosso brillante che non si attenua dopo aver allagato tre volte la cavità della piastra frontale con ACSF gelido, lasciando che ogni lavaggio riposi per 30 secondi).
         NOTA: Un distacco riuscito è indicato dal lembo osseo che diventa uniformemente mobile lungo tutto il perimetro, senza un rigonfiamento durale visibile e solo lieve sanguinamento capillare.
   7. Sollevare con attenzione il lembo osseo staccato con successo con il gancio della dura dura in direzione posteriore-anteriore fino a circa 35° sopra la superficie del cranio.
   8. Afferra il bordo sollevato con la pinza e dondola delicatamente a sinistra e a destra finché la piastra non si libera completamente. Se la piastra resiste in un angolo, si abbassa di nuovo in posizione e si torna al passo 3.3.4 per assottigliare la zona aderente prima di tentare di rimuoverla; tale resistenza indica una sezione ossea localmente sotto-assottigliata.
   9. Pulire delicatamente l'area esposta di sangue coagulato con ripetuti lavaggi di ACSF gelido.
   10. Verifica che la dura dura sia intatta e trasparente prima di procedere.
       NOTA: Un sollevamento lento e graduale dal bordo posteriore è essenziale per minimizzare il rischio di lesioni ai seni venosi superiori e trasversi sottostanti e alla superficie corticale.
4. Sigillare la finestra cranica
   1. Posizionare una singola membrana PDMS sterile e prefabbricata (preparata nella sezione 1) direttamente sulla superficie durale una volta che il sanguinamento si è attenuato. Quando è dimensionato correttamente, copre la finestra con precisione e aderisce passivamente alla dura, tenendola appoggiata al cervello.
   2. Assorbire l'ACSF residuo dal perimetro della finestra con una salvietta non fibrosa.
      NOTA: La salvietta non deve mai entrare in contatto con la duratem esposta, e una tecnica asettica rigorosa (operatore sterile, strumenti e campo) deve essere mantenuta per tutta la durata, poiché la finestra viene riaperta ripetutamente e qualsiasi contaminazione introdotta in questo passaggio comprometterà le successive registrazioni longitudinali.
   3. Prepara il sigillante in elastomero in silicone a due componenti secondo le istruzioni del produttore e applica l'elastomero misto entro 30 secondi dalla dispensazione per riempire ogni fessura tra il contenitore in cemento dentale e il bordo interno della piastra frontale, circondando completamente e sovrapponendo i bordi della membrana PDMS.
   4. Lascia asciugare l'elastomero per circa 2 minuti (o il tempo specificato dal produttore). Assicurati che la tenuta polimerizzata sia continua e a tenuta liquida, ma che rimanga meccanicamente rimovibile all'inizio di ogni sessione di registrazione.
   5. Fissa un cappuccio protettivo personalizzato stampato in 3D sulla piastra con una piccola quantità di colla cianoacrilato per proteggere la finestra tra una sessione di registrazione e l'altra.
   6. Permettere al topo di riprendersi dall'anestesia e riportarlo nella gabbia di casa per ospitare singolarmente, per evitare danni all'impianto.

4. Cure post-operatorie e abituazione

1. Monitora attentamente la salute del topo per almeno 2 giorni dopo l'intervento. Somministrare analgesici aggiuntivi (s.c.) per 2 giorni dopo l'intervento se il topo mostra segni di dolore secondo la scala delle smorfie^{del topo 20}.
2. Lascia che il topo si riprenda senza essere disturbato per almeno 4 giorni dopo l'intervento. Successivamente, inizia un periodo di abituazione di 5 giorni di durata incrementale: 5 minuti il giorno 1, seguiti da 15, 30, 45 e 60 minuti rispettivamente nei giorni 2, 3, 4 e 5, per abituare il mouse alla manipolazione e alla piattaforma di registrazione della fissazione della testa.
   NOTA: L'edema tissutale post-craniotomia e l'infiammazione locale sono noti per persistere fino a due^{settimane e 21}. Quando la tempistica sperimentale lo consente, è quindi consigliabile un periodo di recupero prolungato prima della prima sessione di registrazione. Prima della prima sessione di registrazione, verifica che la finestra cranica appaia chiara e priva di opacità o tessuto fibroso sotto il microscopio binocolore, e che il peso e il comportamento dell'animale siano normali.

5. Procedura per registrazioni elettrofisiologiche longitudinali

1. Posizionare l'animale sulla piattaforma di registrazione
   1. Posiziona il mouse sulla piattaforma di registrazione e guida i morsetti di fissazione della testa del mouse. Assicurati che l'altezza sia stata preregolata per preservare la postura naturale dell'animale in piedi durante la fissazione della testa.
      NOTA: Se il topo resiste persistentemente alla fissazione della testa, non forzare la procedura. Riporta l'animale nella gabbia di casa e prolunga la fase di abituazione (sezione 4) di una o due sessioni aggiuntive prima di ritentare la fissazione.
   2. Stringi le viti di bloccaggio della morsetta.
   3. Immergi la lama circolare microchirurgica smussata con etanolo all'80% immediatamente prima dell'uso.
   4. Inserire la lama tra il cappuccio stampato in 3D e la superficie superiore della piastra frontale, mantenendo la lama quasi parallela alla superficie della piastra frontale. Non far mai avanzare la lama oltre il bordo interno dell'apertura della placca, per evitare il rischio di contatto con il cervello.
      NOTA: Il cappuccio è intenzionalmente stampato in resina trasparente in modo che la profondità della lama rimanga visibile ovunque.
   5. Avanza intorno al cappuccio con movimenti delicati di movimento sinistra-destra che tagliano gradualmente lo strato adesivo.
   6. Usa pinze fine per sezionare il tappo e scartarlo una volta completamente rilasciato.
   7. Stringi il bordo esterno della guarnizione in elastomero di silicone e sollevalo lentamente dal lato caudale verso il lato rostrale. La guarnizione elastomerica e la membrana PDMS sottostante si staccano insieme come un'unica unità, esponendo una duram intatta.
   8. Mantieni il cervello umido applicando qualche goccia di ACSF.
2. Posizionamento dei dispositivi di registrazione
   1. Montare l'array μECoG su un braccio articolato con base magnetica; Regolare la manopola di attrito del braccio in base all'esperienza dell'operatore, con operatori esperti che preferiscono una regolazione a basso attrito che preserva il controllo motore fine durante il posizionamento.
   2. Guidare la matrice in modo che la faccia dell'elettrodo atterrasse perpendicolare (90°) alla superficie corticale lungo il bordo destro della finestra cranica; Una volta posizionato soddisfacentemente, stringi la manopola di attrito per fissare il braccio.
   3. Usa uno strumento punta in silicone per tamponare delicatamente il cavo a nastro piatto dell'array verso il basso sulla superficie superiore della piastra frontale, in modo che il cavo si scatti in conformazione con la piastra e l'array stesso si posi piatto contro la dura, dove l'ACSF residuo fornisce un'adesione passiva. Poiché la finestra cranica è dimensionata per accogliere l'array a due sottogriglia in un'unica orientazione, l'allineamento grossolano è facilmente rilevabile.
   4. Effettuare le ultime regolazioni fini con lo strumento in silicone, spingendo lateralmente l'array finché la linea centrale sagittale non è chiaramente centrata all'interno dell'array semitrasparente.
      NOTA: La griglia traslucida μECoG espone il seno sagittale come un indizio anatomico inequivocabile che rimane visibile attraverso l'array, permettendo di riprodurre lo stesso offset laterale durante le sessioni longitudinali. L'array è posizionato in modo da coprire bilateralmente la corteccia cingulata anteriore (ACC) nella sua metà rostrale e la corteccia retrospleniale (RSP) bilateralmente nella sua metà caudale, attraversando i nodi DMN previsti in questo studio. Un pacchetto di analisi open-source (ephy_spatial_fidelity-toolkit, disponibile a https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit) quantifica la deriva della griglia da sessione a sessione da registrazioni conservative.
   5. Collega il filo di riferimento μECoG alla presa di riferimento placcata oro impiantata nel passo 2.7.
      NOTA: Come controllo qualità opzionale pre-sessione, acquisire una breve registrazione con le sonde e l'array immersi in un tubo conico di ACSF da 50 mL per confermare che la gabbia di Faraday sta attenuando efficacemente le interferenze elettromagnetiche ambientali prima di procedere con la registrazione in vivo .
   6. Posizionare la sonda caudale ad alta densità intracranica su un braccio micromanipolatore orientato perpendicolarmente (≈ 90°) alla superficie cerebrale e la sonda rostrale ad alta densità intracranica su un secondo braccio inclinato a 50°.
   7. Al microscopio binoculare, avanzare ogni sonda a circa 1 mm sopra la dura e allineare l'asse Y di ogni sonda con la corrispondente scanalatura incisa fresata nel passo 3.2.4.
   8. Registra con nota scritta o fotografia tramite il binocolo, dove la griglia dell'elettrodo μECoG si trova immediatamente adiacente al punto di ingresso previsto per ogni sonda.
      NOTA: Quando l'intervento viene eseguito correttamente e non è presente edema corticale, la distanza tra il bordo osseo e l'array μECoG è minima, rendendo la selezione del punto di ingresso inequivocabile. Per la massima precisione spaziale nelle sessioni longitudinali, cattura una fotografia della corteccia esposta con l'array in posizione e identifica un vaso pial distintivo all'interno della regione stretta tra il bordo osseo e l'array μECoG. Questa immagine, annotata con la nave di riferimento e la sua posizione relativa rispetto ai pad μECoG, funge da mappa di riferimento sessione a sessione per riprodurre lo stesso punto di ingresso nei giorni di registrazione successivi.
   9. Ritrae ogni sonda verso l'alto di circa 15 mm una volta registrata la corrispondenza sonda-pad per proteggere il fragile gambo dell'elettrodo durante la puntura durale.
   10. Fabbricare lo strumento per la puntura durale fissando un ago sterile da 30 G sull'estremità di un applicatore con punta di cotone e piegando la punta dell'ago a 90° con una pinza fine non dentata.
   11. Guida lentamente lo strumento per la perforazione sopra la piastra frontale. Guardando attraverso il binocolo, contare i cuscinetti elettrodi di μECoG per allineare lo strumento con la coordinata di ingresso registrata. Abbassare la punta piegata sulla superficie durale in modo che la punta di taglio si avvicini alla dura a 90° mentre l'asta dello strumento sia tenuta parallela all'asse lungo della schiena del topo.
   12. Avanzare la punta circa 1 mm sotto il piano durale e ritrarla. Si prevede un leggero spurgo transitorio alla puntura; Asciugala con l'angolo contorto di una salvietta non fibrosa.
   13. Abbassare ogni sonda ad elettrodo intracranico ad alta densità sulla superficie durale sotto osservazione binoculare continua immediatamente dopo la puntura. Se la perforazione è stata posizionata con precisione, la sonda scivola attraverso la perforazione in modo fluido, senza deviazione del gambo.
   14. Scendere gradualmente ogni sonda fino alla profondità obiettivo di 5 mm sotto la dura dur a una velocità controllata di circa 0,1 mm/s o meno²².
   15. Lascia che le sonde si stabilizzino meccanicamente per 10 minuti prima di iniziare l'acquisizione dei dati.
       NOTA: La piccola perforazione durale creata dall'ago da 30 G si chiude da sola in pochi minuti; Pertanto, l'inserimento della sonda deve seguire senza ritardo la puntura.
3. Acquisizione dati
   1. Inizia l'acquisizione dati.
      NOTA: I segnali μECoG sono amplificati da quattro headstage digitali a 128 canali collegati tramite cavi di interfaccia SPI a una scheda di acquisizione open-source, mentre le due sonde di elettrodi intracranici ad alta densità vengono acquisite tramite un modulo di acquisizione dedicato a sonde ad alta densità alloggiato in un telaio strumentale modulare, insieme a moduli multifunzione di input/output e acquisizione dati per la sincronizzazione e la segnalazione digitale. Un comune orologio master TTL viene generato dalla scheda di acquisizione open-source μECoG e distribuito come linea di sincronizzazione hardware al telaio di acquisizione della sonda (tramite il suo modulo I/O multifunzione), così che i due flussi di acquisizione condividano una base temporale allineata al campione. Tutti i flussi di dati vengono registrati in modo sincrono tramite l'interfaccia grafica del sistema di acquisizione; i modelli hardware completi e i numeri di catalogo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
   2. Al termine della sessione di registrazione, erogare 0,5 mL di ACSF sulle griglie μECoG, poi ritrae ogni sonda di elettrodo intracranico ad alta densità alla stessa velocità utilizzata per l'inserimento (≈6 mm/min) e rimuovere delicatamente l'array μECoG.
   3. Pulisci le sonde e l'array lasciandoli in ammollo per 45 minuti in una soluzione enzimatica appena preparata all'1% (v/v).
   4. Dopo il bagno con detergente enzimatico, risciacqua gli elettrodi con tre immersioni consecutive in acqua purificata a osmosi inversa, utilizzando un nuovo tubo per ogni risciacquo.
   5. Sostituire la membrana PDMS con un nuovo foglio sterile come nel passo 3.4.1.
   6. Riapplica il sigillante elastomerico (passo 3.4.3–3.4.4) e fissa un nuovo cappuccio protettivo stampato in 3D (passo 3.4.5).
   7. Lascia asciugare il gruppo risigillato all'aria per 5 minuti prima di riportare il topo nella sua gabbia di casa. La procedura può essere ripetuta per più sessioni di registrazione nell'arco di diverse settimane.

Risultati

Un intervento di successo si traduce in una finestra chiara e trasparente sulla corteccia, con vascolarizzazione visibile e minimi segni di infiammazione o infezione. Questa chiarezza può essere mantenuta per oltre 21 giorni (Figura 1), consentendo studi longitudinali a lungo termine. La robustezza dell'impianto è dimostrata dalla sua capacità di rimanere stabile anche durante un paradigma di somministrazione cronica di corticosterone durata 21 giorni, un mo...

Discussione

Questo rapporto descrive un protocollo chirurgico a due fasi, risparmiante per la dura, che fornisce un metodo affidabile ed altamente efficace per creare una finestra cranica ampia, cronica e richiudibile nei topi. L'importanza di questa tecnica va oltre la dimensione della finestra. Il suo principale vantaggio è la capacità di interrogare simultaneamente e su più scale reti cerebrali su scale temporali longitudinali. Combinando le griglie di superficie μECoG (fornendo dati LFP mesoscas...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
& micro; Array ECoG & mdash; Personalizzato 512 canali (2 e 256 canali)	NeuroNexus	E256-200-30-80	Confezione: IH256. Due 16 e 16 volte; 16 sottogriglie (ciascuna 3,3 mm e volte 3,5 mm); 200 & mu; intonazione M; 80 & mu; m diametro dell'elettrodo. Registrazioni DMN a livello superficiale.
Braccio micromanipolatore sinistro a 3 assi	Strumenti di Precisione Mondiale (WPI)	504926	10 & mu; risoluzione m; display digitale; Utilizzato per il posizionamento della placca/sonda durante l'intervento chirurgico
Cappuccio protettivo stampato in 3D	Interno (Anycubic Photon Mono 4K)	N/A	Design personalizzato; stampata in resina UV Anycubic High Clear; Archivio STL disponibile su https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap
Acetone (di grado laboratorio)	Sigma-Aldrich	179973	Sgrassaggio della superficie cranica e rimozione del periosteo prima dell'applicazione dell'adesivo
Adson Dura Hook 5 mm (Fine Dura Hook)	gSource	gS 25.2570	Usata per staccare la piastra ossea dalla dura dura lungo il perimetro; realizzati con filo di tungsteno fine o simili
Anycubic High Clear UV Resina	Anycubic	STMGCL-102B	Resina fotopolimerica usata con la stampante Anycubic Photon Mono 4K per cappucci protettivi stampati in 3D
Stampante a resina 3D Anycubic Photon Mono	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	Usato per stampare tappi protettivi per finestre con Anycubic High Clear Resin
Lavaggio e lavaggio in resina UV Anycubic Macchina di Cura 2.0	Anycubic	285-550	Lavaggio post-stampa e polimerizzazione UV dei condensatori stampati in 3D
Braccio articolante con base magnetica (× 2)	Utensili Haas	09-0535	Teneva e micro; Sotto-griglie ECoG presenti sulla superficie corticale durante le registrazioni
CSF artificiale (aCSF)	Preparazione interna	N/A (Interno)	Ricetta aCSF: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 1,25 mM KH2PO4, 10 mM di D-glucosio; ossigenare con 95% di O2 / 5% CO2 subito dopo la preparazione. Numeri di catalogo elencati separatamente.
Lama microchirurgica smussata (bisturi circolare)	Iogen	374769	Utilizzato per la raschiatura della superficie del cranio e la rimozione del cappuccio
Buprenorfina (Temgesic)	Indivior	BE-112515	analgesico oppioide; 0,05 mg/kg s.c. pre-operatorio
Mouse C57BL/6JRj	Janvier Labs		Maschio o femmina; Minimo 10 settimane, >20 g di peso corporeo al momento dell'intervento
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C-7902	2 mM; MW 147.02; 0,29 g/L. Preparato come Ca e tempi; 100 azioni. Componente dell'aCSF interno.
Carprofene (Rimadyl)	Zoetis Salute Animale	RXRIM-INJ	Analgesico FANS; 5 mg/kg s.c. pre-operatorio
Corticosterone	Sigma-Aldrich	C2505	Sciolto in acqua potabile per un modello di stress cronico/depressione di 21 giorni
Cotton fioc	Fisherbrand	22-363-157	Serve come manico per il dispositivo di puntura dura da 30 G e per sgrassare la superficie del cranio con acetone
Colla cianoacrilato — Loctite 401	Adesivi Henkel	Loctite 401	Cianoacrilato a viscosità sottile; Utilizzato per la preparazione della superficie del cranio, la fissazione della piastra frontale e del cappuccio
Trapano dentale & mdash; Predominio K.1070	Dominio	K.1070	Trapano rotante ad albero flessibile; Utilizzato per l'assottigliamento di craniotomie e la perforazione del foro pilota
Desametasone	Dopharma	1DEX004	anti-antinfiammatori corticosteroidi; 2 mg/kg s.c. pre-operatorio
D-Glucosio	Sigma-Aldrich	G-7021	10 mM; MW 180.20; 1,80 g/L. Preparato come glucosio e tempi; 100 azioni. Componente dell'aCSF interno.
Punta da trapano Steel Bur round 1/007W	Hager & Meisinger	18089	Utilizzato per il sito di riferimento e la finestra cranica
Etanolo 80% (v/v) - Diluto A12t	Berner	13221132	Ammollo preoperatorio di strumenti chirurgici e cappuccio laminare chirurgico per la sterilizzazione
Apparecchiatura di evacuazione del gas	Scienze della Vita RWD	R546W	Recupera i gas anestetici dall'area chirurgica
Presa di riferimento placcata in oro	DigiKey	310-13-102-41-001000	Impiantata sopra il cervelletto sinistro; serve come terra/riferimento ECoG
Purificatore a ultrasuoni GRANT & mdash; Modello 17002A	Strumenti GRANT	17002A	EAN: 4064343191654. Bagno ultrasonico ad acqua calda; Utilizzato con TICKOPUR TR 3 per la pulizia degli strumenti
Cuscina riscaldante e mdash; Supertech TMP-5B	Supertech	TMP-5B	Mantiene la temperatura corporea a 37 °F; C durante l'anestesia
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-017-25	Anestetico inalatorio; induzione 4%, manutenzione 1,5 e ndash; 2.5%
Kimtech Science, Precision Wipes (tessuto non fibroso)	KIMBERLY CLARK	7552	Usata con punta appuntita per asciugare l'ACSF residuo e aiutare l'adesione della membrana PDMS alla dura
Sigillante sterile in elastomero Kwik-Cast	Strumenti di Precisione Mondiale (WPI)	KWIK-CAST-s	Modello: KWIK-CAST-S. silicone biocompatibile; usata per creare una tenuta rimovibile attorno alla membrana PDMS.
Penna LED per polimerizzazione UV 405 nm	CureUV	514424-405	Utilizzato per curare il cemento dentale attivato dai raggi UV (C-Ram totale) durante l'impianto
Soluzione di lidocaina-epinefrina	Orion Pharma	05 10 31	anestetico locale; iniezione di s.c. sotto la pelle del cuoio capelluto
Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	M-7774	1 mM; MW 246.48; 0,25 g/L. Preparato come Mg & tempi; 100 azioni. Componente dell'aCSF interno.
Piastra frontale metallica e mdash; Neurotar Modello 13	Neurotar	Modello 13	Corazza in titanio; apertura rotonda di diametro 11 mm; fissato al cranio con cianoacrilato e cemento dentale
Adattatore headstage NeuroNexus )	NeuroNexus	IH256 personalizzato 64 e volte; 4 Molex	Scheda adatta personalizzata; panini ciascuno & micro; Sotto-rete ECoG tra due headstage Intan RHD 128-ch
Sonda Neuropixels 1.0 con cappuccio metallico (e tempi; 2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960 siti di registrazione; Gambo da 10 mm. Una sonda prende di mira la colonna ippocampo-talamo-visiva, l'altra la colonna mPFC
Telaio NI PXIe-1083	Strumenti Nazionali	PXIe-1083	Telaio PXI Express a 9 slot che ospita il modulo Neuropixels e le schede NI DAQ
Modulo I/O multifunzione NI PXIe-3839	Strumenti Nazionali	PXIe-3839	Installato su telaio NI PXIe-1083; Utilizzato per la sincronizzazione e l'I/O ausiliaria
DAQ multifunzione NI PXIe-6363	Strumenti Nazionali	PXIe-6363	Installato su telaio NI PXIe-1083; I/O analogico e digitale per la sincronizzazione
Nova Microcinerator -  Sterilizzatore a infrarossi	Argos Tech	S3022	Utilizzato per la sterilizzazione rapida di qualsiasi strumento che possa toccare tessuti cerebrali esposti
Microscopio binocolo stereo Olympus SZ51	Olympus	SZ51	Visualizzazione chirurgica; Utilizzato durante tutte le fasi di craniotomia e impianto
Open Ephys Acquisition Board (One Box, 1ª generazione)	Open Ephys	OEPS-9029	Ricevimenti e micro; Flussi dati ECoG tramite SPI; hardware open source. Vedi open-ephys.org
Open Ephys GUI	Open Ephys	N/A (open source)	Software gratuito e open-source per l'acquisizione di elettrofisiologia. Disponibile su: open-ephys.org
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P-5405	3 mM; MW 74.55; 0,22 g/L. Componente dell'aCSF interno.
Fosfato di diidrogeno di potassio (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P-5655	1,25 mM; Moledì 136.09; 0,17 g/L. Componente dell'aCSF interno (Klebs & times; 10 azioni).
Soluzione di povidone-iodio (BETADINE)	Takeda	45 70 28	Disinfettante topico per la preparazione chirurgica sul campo
Modulo di acquisizione PXIe	Neuropixel	PXIE_1000	modulo in formato PXI per l'acquisizione dati di Neuropixels 1.0; installato su telaio NI PXIe-1083
Connettore a presa di riferimento	DigiKey	342-10-102-00-591000	Connettore di accoppiamento corrispondente per la presa di riferimento sopra; confermare il numero di parte con DigiKey
RHD a 128 canali (e orari; 4)	Intan Technologies	RHD 128	Due headstage per µ sotto-griglia ECoG; Conferma modello (ad esempio, RHD2132 o RHD2164)
Cavo di interfaccia RHD SPI, 0,9 m	Intan Technologies / Open Ephys	C3203	Cavo SPI standard che collega le headstage RHD alla scatola di acquisizione Open Ephys
Pompa ad aria a trazione longitudinale	Scienze della Vita RWD	R510-29	Fornisce flusso d'aria attraverso il circuito anestesiario
Vaporizzatore per anestesia per animali a trazione posteriore	Scienze della Vita RWD	R5835	Vaporizzatore di isoflurano di precisione per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia
Bisturi #11	Swann Morton	SM0103	Utilizzato per incisione di motivi a croce su superficie del teschio per migliorare l'aderenza adesiva
Tagliacapelli per piccoli animali - GT416	Aesculap Schermaschinen GmbH	D-98528H	Usata per tagliare il cuoio capelluto dell'animale prima dell'intervento chirurgico
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S-5761	26 mM; MW 84.01; 2,18 g/L. Componente dell'aCSF interno.
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S-5886	124 mM; MW 58.44; 7,25 g/L. Componente dell'aCSF interno.
SOL-M (Ago ipodermico sterile 30 G)	Europa Sol-Millennium	113005	Piegato a 90°; Alla punta e fissato al cotton werb per creare il dispositivo di puntura dura
Braccio manipolatore standard, 3 assi SINISTRA (Stoelting)	Stoelting Co.	51604	Utilizzato per l'inserimento delle sonde Neuropixel durante le sessioni di registrazione
Braccio manipolatore standard, 3 assi DESTRO (Stoelting)	Stoelting Co.	51606	Utilizzato per l'inserimento delle sonde Neuropixel durante le sessioni di registrazione
Frame stereotattico — RWD F67001	Scienze della Vita RWD	F67001	Frame stereotassico standard; Utilizzato per la stabilizzazione della testa e il posizionamento dell'impianto con riferimento coordinato
Penna per pelle a marcatore chirurgico con righello (Inchiostro viola)	Fannin	SM0372	Marcatore chirurgico biocompatibile sulla pelle a base di genziana e viola utilizzato per delineare la craniotomia pianificata e l'impronta dell'impianto sull'osso. Resistente al priming con cianoacrilato (Loctite 401) e rimane visibile tramite la disgrassazione del cranio e la fissazione della testa, consentendo un trasferimento affidabile delle coordinate stereotassate sulla superficie ossea.
Kit in elastomero in silicone SYLGARD 184 (PDMS)	Dow (Germania)	1673921	Polidimetilsilossano; colata in thin (< membrane di 1 mm; posizionato sulla superficie durale per proteggere il cervello
Detersivo enzimatico Tergazyme	Alconox	1304-1	Detergente a base di proteasi usato all'1% (w/v) in acqua osmosa tiepida per la pulizia post-seduta degli elettrodi (45 minuti di ammollo, poi risciacquo triplo in acqua purificata).
Cemento Dentale UV Total C-Ram Automix (Bianco)	Itena	R301950	Modello: TTCRAM-BLC. resina dentale polimerizzabile ai raggi UV; Utilizzato per rinforzo della piastra frontale e fissazione a bussole
Soluzione di pulizia a ultrasuoni (TICKOPUR TR 3)	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	Concentrato a base di acido citrico; Utilizzato nel bagno a ultrasuoni per la pulizia post-operatoria di strumenti
Gel Occhi Viscotears 2 mg/g	Alcon	503849	Unguento lubrificante per gli occhi a base di carbomeri; applicato alle cornee durante l'anestesia per prevenire l'asciugatura
Sorgente di luce fredda Zeiss KL1500 LCD	Carl Zeiss	KL1500 LCD	Illuminazione a freddo a fibra ottica per il campo chirurgico; Previene danni termici