Trascrittomica spaziale della morfogenesi dentale precoce in tessuto embrionale di topo fissato con paraffina fissata in formalina

Summary

Il protocollo attuale descrive l'uso di sezioni fissate in formalina, incorporate in paraffina, provenienti dalle regioni craniofacciali E13.5 ed E15.5 degli embrioni di topo per analizzare i profili di espressione genica differenziali utilizzando la trascrittomica spaziale.

Abstract

Il dente in via di sviluppo comprende popolazioni cellulari diverse e altamente specializzate che lavorano insieme per mantenere la corretta forma e funzionamento. Chiarire le interazioni tra queste cellule e il microambiente circostante è fondamentale per comprendere i meccanismi regolatori alla base dello sviluppo normale dei denti. Le perturbazioni in questi processi possono causare disturbi congeniti come l'agenesia dentale, la dentinogenesi imperfetta e l'amelogenesi imperfetta. Nonostante i notevoli progressi resi possibili dal sequenziamento a RNA a singola cellula (scRNA-seq) nel rivelare l'eterogeneità cellulare, esso non preserva il contesto spaziale delle cellule all'interno dei tessuti, limitando la capacità di collegare l'espressione genica all'architettura tissutale. Le tecnologie trascriromiche spaziali affrontano questa limitazione integrando la profilazione dell'espressione genica ad alta risoluzione con la conservazione dell'architettura tissutale nativa, consentendo la localizzazione in situ delle firme molecolari. Qui descriviamo un protocollo passo dopo passo per la raccolta, fissazione e incorporamento della paraffina di tessuto craniofacciale embrionale di topo, adatto ad applicazioni trascrivomiche spaziali a valle. Il flusso di lavoro dettaglia la sezionazione e la gestione ottimizzate di tessuti fissi in formol, incorporati in paraffina, per preservare l'integrità dell'RNA e la morfologia tissutale per un'analisi spaziale ad alta risoluzione. Questo metodo è compatibile con le piattaforme di sequenziamento e trastrastomica spaziale basate su immagini, permettendo una profilazione trascritomica spaziale riproducibile della morfogenesi dentale precoce negli embrioni di topo. Questo approccio offre potenti intuizioni sull'organizzazione spaziale e la dinamica funzionale delle strutture craniofacciali sia in stati di sviluppo che patologici, fornendo un quadro fondamentale per collegare i meccanismi molecolari alla morfologia tissutale.

Introduction

Lo sviluppo dei denti si basa su una sequenza altamente coordinata di processi morfogenetici durante la crescita embrionale ^precoce 1,2,3,4. Sebbene numerosi geni chiave e vie di segnalazione siano stati identificati tramite studi genetici e dello sviluppo, la nostra comprensione di come questi fattori interagiscono per modellare le singole strutture craniofacciali rimane limitata. In particolare, anche con notevoli progressi nel collegare varianti genetiche specifiche sia a disturbi dentali sindromici che n....

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC), secondo il Protocollo di Studio sugli Animali #21-031.

1. Preparazione dell'animale sperimentale e raccolta dei tessuti

1. Accoppiare maschio e femmina sani e fertili Mus musculus per accoppiamenti temporizzati. Identificare le femmine di topo in gravidanza dalla presenza di un tappo vaginale, designato come giorno embrionale (E) 0,5.
2. Eutanasiare le femmine di topi gravidi tramite i....

Results

Questo metodo delinea l'elaborazione di teste embrionali di topo appena dissezionate per generare campioni FFPE di tessuti craniofacciali, incluso il dente in via di sviluppo, che possono essere facilmente sezionati tramite microtomo mantenendo l'integrità dell'RNA (Figura 1). Questo protocollo è stato applicato con successo alle teste embrionali E13.5 (giorno embrionale 13.5), E15.5 ed E16.5 per regioni craniofaciali ad alta risoluzione basate su immagini (.......

Discussion

In questo lavoro, presentiamo un protocollo dettagliato per preparare blocchi FFPE di teste embrionali di topo ottimizzati per l'uso con piattaforme di imaging spaziale ad alta risoluzione dell'RNA, inclusi trascrittomica spaziale basata su sequenziamento e imaging. Un obiettivo chiave di questo protocollo è preservare sia la morfologia tissutale sia l'integrità degli acidi nucleici su sezioni intere della testa, con particolare attenzione alla regione craniofacciale in sviluppo. Garanti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  per eseguire lavaggi durante il flusso di lavoro
Tubi conici da 50 mL (Ambion) senza RNAsi	Thermo Fischer	AM12502	Usare per conservare campioni in diverse soluzioni
Oscillatore orbitale avanzato	VWR	6683-470	Da usare per scuotere i tessuti in soluzione di fissazione durante l'incubazione
Alcol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Usalo per pulire e disinfettare tutto lo spazio di lavoro
Processore automatico di tessuti a vuoto	Leica Biosystems	ASP300S	Uso per eliminare, disidratazione, reidratazione e infiltrazione di cera dei campioni
Spessore vetro di copertura 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Utilizzo per il montaggio di slide nel flusso di lavoro Visium HD
Buffer di bluing Dako, pronto all'uso	Agilant Technologies	CS70230-2	Uso per H& Colorazione E
Eosina-Y con flossina	Fisher Scientific	22050198	Uso per H& Colorazione E
Ematossilina, Mayer, Soluzione acquosa pronta all'uso	Agilant Technologies	S330930-2	Uso per H& Colorazione E
Bagno d'acqua HistoCore	Leica Biosystems	HIS2326	Usare per far galleggiare le sezioni a 40-43 °C; C per rimuovere le rughe dalle sezioni FFPE
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Uso per analizzare i dati Visium HD
Lame usa e getta a profilo basso DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Usare per sezionare i blocchi FFPE
Formalina tamponata neutra 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Usato per sistemare i tessuti
Soluzione di decontaminazione RNase RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Uso per pulire e rimuovere RNase
Microtomo rotatorio semi-automatizzato	Leica Biosystems	RM2245	Usa per sezionare i blocchi FFPE come riportato nelle linee guida.
Scaldalleve con copertura	Premiere	XH2004	Utilizzo per l'incubazione di vetri a diverse temperature
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Uso per collegare sezioni per Vsium HD
Lama chirurgica n. 11	Integra Miltex	4-311	Uso per la puntatura dei tessuti FFPE
Paraplasto Chirurgico	Leica Biosystems	39601006	Uso per effettuare l'infiltrazione dei tessuti e l'inserimento dei tessuti
TISsue DISH CULTURE 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Uso per raccogliere e dissezionare campioni in 1x PBS
Glicerolo UltraPure	Thermo Fischer	15514011	Uso per il montaggio a slitta Visium HD del coverglass prima di CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Uso per esperimenti di workflow Visium HD
Visium HD Sequenziamento Spaziale dell'RNA	10X Genomics, Inc.	1000676	Uso per eseguire esperimenti trasscrittomici spaziali
Localizzazione in situ dell'RNA Xenium 5K	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Uso per eseguire esperimenti trasscrittomici spaziali
Analizzatore di Xeno	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Utilizzare l'imaging di Xenium e Xenium 5K RNA
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Uso per analizzare i dati Xenium
Localizzazione in situ dell'RNA dello xeno	10X Genomics, Inc.	1000672	Uso per eseguire esperimenti trasscrittomici spaziali