Trascrittomica spaziale della morfogenesi dentale precoce in tessuto embrionale di topo fissato con paraffina fissata in formalina

Summary

Il protocollo attuale descrive l'uso di sezioni fissate in formalina, incorporate in paraffina, provenienti dalle regioni craniofacciali E13.5 ed E15.5 degli embrioni di topo per analizzare i profili di espressione genica differenziali utilizzando la trascrittomica spaziale.

Abstract

Il dente in via di sviluppo comprende popolazioni cellulari diverse e altamente specializzate che lavorano insieme per mantenere la corretta forma e funzionamento. Chiarire le interazioni tra queste cellule e il microambiente circostante è fondamentale per comprendere i meccanismi regolatori alla base dello sviluppo normale dei denti. Le perturbazioni in questi processi possono causare disturbi congeniti come l'agenesia dentale, la dentinogenesi imperfetta e l'amelogenesi imperfetta. Nonostante i notevoli progressi resi possibili dal sequenziamento a RNA a singola cellula (scRNA-seq) nel rivelare l'eterogeneità cellulare, esso non preserva il contesto spaziale delle cellule all'interno dei tessuti, limitando la capacità di collegare l'espressione genica all'architettura tissutale. Le tecnologie trascriromiche spaziali affrontano questa limitazione integrando la profilazione dell'espressione genica ad alta risoluzione con la conservazione dell'architettura tissutale nativa, consentendo la localizzazione in situ delle firme molecolari. Qui descriviamo un protocollo passo dopo passo per la raccolta, fissazione e incorporamento della paraffina di tessuto craniofacciale embrionale di topo, adatto ad applicazioni trascrivomiche spaziali a valle. Il flusso di lavoro dettaglia la sezionazione e la gestione ottimizzate di tessuti fissi in formol, incorporati in paraffina, per preservare l'integrità dell'RNA e la morfologia tissutale per un'analisi spaziale ad alta risoluzione. Questo metodo è compatibile con le piattaforme di sequenziamento e trastrastomica spaziale basate su immagini, permettendo una profilazione trascritomica spaziale riproducibile della morfogenesi dentale precoce negli embrioni di topo. Questo approccio offre potenti intuizioni sull'organizzazione spaziale e la dinamica funzionale delle strutture craniofacciali sia in stati di sviluppo che patologici, fornendo un quadro fondamentale per collegare i meccanismi molecolari alla morfologia tissutale.

Introduction

Lo sviluppo dei denti si basa su una sequenza altamente coordinata di processi morfogenetici durante la crescita embrionale ^precoce 1,2,3,4. Sebbene numerosi geni chiave e vie di segnalazione siano stati identificati tramite studi genetici e dello sviluppo, la nostra comprensione di come questi fattori interagiscono per modellare le singole strutture craniofacciali rimane limitata. In particolare, anche con notevoli progressi nel collegare varianti genetiche specifiche sia a disturbi dentali sindromici che non sindromici, i meccanismi molecolari dettagliati alla base della morfogenesi struttura-specifica non sono ancora completamente^definiti 1,2,3,4. Questa lacuna di conoscenza continua a limitare il progresso di strategie terapeutiche mirate per l'agenesia dentale o altre anomalie dentali.

Il sequenziamento di mRNA a singola cellula (scRNA-seq) ha permesso la scoperta di tipi cellulari precedentemente non riconosciuti sia in tessuti sani che malati, nonché l'identificazione di più sottotipi cellulari basandosi su profili di espressione genica distinti. Tuttavia, poiché scRNA-seq richiede la dissociazione dei tessuti in singole cellule, si perde informazione sulla posizione spaziale originale di ciascuna cellula all'interno del tessuto. Di conseguenza, questi dataset non catturano come le cellule sono disposte rispetto all'architettura^{tissutale 5,6,7}. Inoltre, le interazioni cellula a cellula previste si basano sulla presenza di interazioni complementari di trascritti, ma non tengono conto delle informazioni spaziali effettive, il che è importante per determinare se tali interazioni avvengono in vivo ^5,6,7.

La tecnologia di trascritomica spaziale consente un profilaggio ad alto rendimento dell'espressione genica mantenendo le informazioni spaziali all'interno delle sezioni^{tissutali 8,9}. Le tecnologie di trascrivomica spaziale sono basate^sull'imaging 10,11,12 o basate sul ^{sequenziamento 12,13}. Gli approcci di trascritomica spaziale basati sull'imaging impiegano FISH per rilevare e misurare l'espressione genica mirata con precisione spaziale cellulare o subcellulare. Al contrario, le tecnologie basate sul sequenziamento catturano l'espressione genica a livello di trascrittoma a una risoluzione spaziale inferiore. La trascritomica spaziale basata sul sequenziamento impiega una strategia per raggiungere una risoluzione quasi unicellulare con copertura del trascritoma intero (~20.000 geni), supportando analisi esplorative imparziali, mentre la trascritomica spaziale basata su immagini prende di mira i panel genici (fino a ~5.000 geni), consentendo un'analisi precisa basata su ipotesi di vie specifiche e interazioni^{cellulari 14}.

I progressi tecnologici nella trasscrittomica spaziale ora permettono l'analisi dell'espressione genica all'interno dell'architettura tissutale preservata. I flussi di lavoro basati su paraffina fissata con formalina (FFPE) e quelli basati sulla criosezione offrono approcci complementari per la trascritomica^spaziale 15,16,17. La FFPE offre una conservazione superiore dell'architettura tissutale, consentendo una mappatura spaziale accurata dell'espressione genica in tessuti strutturalmente complessi come denti in sviluppo e piattaforme palatiche. Nel nostro studio e in altri, la fissazione e l'archiviazione del FFPE hanno prodotto dati trascritomici spaziali altamente accurati^{e riproducibili 18}. I flussi di lavoro della criosezione preservano l'integrità dell'RNA ma sono più soggetti a distorsioni^{tissutali 18}. Pertanto, è stato selezionato il FFPE per questo studio. Sebbene il successo dello scRNA-seq dipenda in gran parte dal mantenimento di un'elevata integrità dell'RNA, la trascritomica spaziale richiede anche una morfologia tissutale di alta qualità per localizzare accuratamente i segnali di espressione genica a specifiche caratteristiche istologiche.

Questo protocollo è più adatto ai tessuti craniofacciali embrionali di topo FFPE che coprono le prime fasi dello sviluppo, dove la conservazione dell'architettura tissutale fine è fondamentale per l'analisi trascrivomica spaziale. Il flusso di lavoro probabilmente si comporterà in modo subottimale in campioni troppo fissi, blocchi di paraffina mal orientati o tessuti con integrità dell'RNA compromessa, il che può portare a una riduzione della qualità del segnale e alla perdita di risoluzione spaziale. L'applicazione efficace di questo metodo è indicata da una morfologia tissutale intatta, una minima distorsione delle sezioni e segnali trascrittomici robusti e spazialmente risolti che si allineano con le caratteristiche istologiche.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC), secondo il Protocollo di Studio sugli Animali #21-031.

1. Preparazione dell'animale sperimentale e raccolta dei tessuti

1. Accoppiare maschio e femmina sani e fertili Mus musculus per accoppiamenti temporizzati. Identificare le femmine di topo in gravidanza dalla presenza di un tappo vaginale, designato come giorno embrionale (E) 0,5.
2. Eutanasiare le femmine di topi gravidi tramite inalazione di CO₂ seguita da una lussazione cervicale. Posizionare il supino dell'animale su una superficie chirurgica sterile assorbente e disinfettare l'area addominale con il 70% di etanolo lungo il sito dell'incisione previsto.
3. Realizza un'incisione addominale mediana usando forbici chirurgiche sterili e apri con cura la parete peritoneale con forbici microchirurgiche per esporre le corna uterine. Esteriorizza delicatamente la catena uterina usando una pinza smussata. Isolare gli embrioni rilasciando il tessuto uterino lungo il miometrio e secando l'ovidotto e l'attacco mediano del corno uterino.
4. Trasferire immediatamente embrioni interi in un PBS freddo e sterile in una piastra di Petri da 10 cm.
5. Separare con cura ogni embrione dalle membrane uterine, amniotiche e corioniche circostanti e trasferirlo in una nuova piastra da 10 cm contenente 1x PBS sterile e fredda come ghiaccio.
6. Dissezionare le teste embrionali nelle fasi di sviluppo desiderate utilizzando una lama chirurgica sterile e sciacquarle una volta in 1x PBS freddo prima di ulteriori lavorazioni.

2. Fissazione e lavorazione del tessuto

1. Dissezionare teste embrionali di topo nelle fasi di sviluppo desiderate e fissare formalina al 10% di neutro tamponata durante la notte a temperatura ambiente su uno shaker.
2. Dopo la fissazione, rimuovere la formalina e risciacquare i campioni con 1x PBS prima di trasferirli al 70% di etanolo per la conservazione. Esegui disidratazione, pulizia e infiltrazione da paraffina utilizzando un processore automatico di tessuti.
3. Immergere le teste embrionali in paraffina con orientamento sia nel piano coronale che nel piano sagittale.
4. Dopo la solidificazione della cera, rimuovere i blocchi di paraffina dagli stampi, metterli in contenitori ermetiche etichettati o sacchetti zip-lock e conservarli a 4 °C fino alla sezionazione.
   NOTA: I blocchi di FFPE possono essere conservati per diversi anni prima di essere sezionati senza compromettere l'integrità del tessuto.

3. Elaborazione del tessuto FFPE per la trascrivomica spaziale

1. Disinfettare superfici di lavoro e strumenti con il 70% di etanolo, seguito dal trattamento con soluzione decontaminante RNase per minimizzare la degradazione dell'RNA.
2. Prepara un bagno d'acqua contenente acqua deionizzata e mantieni la temperatura a 40 °C, regolando la temperatura tra 40 °C e 43 °C secondo necessità in base allo stadio embrionale o alle caratteristiche tissutali.
3. Imposta il microtomo, installa una nuova lama dopo averla pulita delicatamente con una soluzione decontaminante RNase, fissa la lama e imposta l'angolo di spazio a 10°.
   NOTA: Assicurarsi che la nuova lama venga utilizzata per la sezione, ottenendo tagli di tessuto precisi. Modificare l'angolo della lama del microtomo può influire significativamente sulla qualità della sezione, compromettendo l'integrità del tessuto, l'uniformità dello spessore e la conservazione delle caratteristiche morfologiche.
4. Taglia la paraffina in eccesso intorno al tessuto incorporato e monta il blocco FFPE sulla fase fredda del microtomo.
5. Prepara e tratta pinzette e spazzole pulite con una soluzione decontaminante RNase prima dell'uso.
6. Allineare la faccia del blocco di paraffina con la lama del microtomo e eseguire tagli di taglio di circa 12 μm fino a raggiungere la regione di interesse (ad esempio, fino a quando la parte mesiale dei molari diventa visibile nelle sezioni coronali). Regolare il blocco e la posizione della lama secondo necessità per garantire sezioni coronali a tutta la testa simmetriche e correttamente orientate.
7. Se si prevede di eseguire l'isolamento a RNA delle sezioni tissutali, si raccolgono direttamente sezioni da 10 μm in tubi microcentrifughe da 1 mL e le processano secondo le raccomandazioni del^{produttore 19,20} per la valutazione della qualità DV200.
8. Tagliare sezioni seriali di spessore 5 μm e monitorare continuamente la vicinanza all'area di interesse esaminando le sezioni di prova su un vetrino regolare al microscopio.
9. Una volta vicino alla regione di interesse, si incida con cura l'area del tessuto usando una lama No. 11 senza tagliare completamente, in due regioni strategicamente distanziate per evitare che le sezioni si arriccino o si aderiscano. Dopo la sezione, rimuovere eventuali paraffine attaccate usando le setole di un pennello fine.
10. Spostare le sezioni di tessuto galleggiante sul bagno d'acqua a 41 °C per permettere un rilassamento e appiattimento delicato prima di prenderle su uno scivolo.

4. Trascrivomica spaziale basata sul sequenziamento

1. Raccogli le sezioni di tessuto sui vetrini di vetro consigliati, assicurandoti che tutte le aree di interesse siano contenute in un'area di 6,5 × 6,5 mm. Quando più sezioni adiacenti sono posizionate sulla stessa slitta, riscaldare brevemente le vetrine su un scaldatore a 40 °C per favorire l'adesione e prevenire il distacco di sezioni già posizionate. Dopo aver posizionato tutte le sezioni, incubare le vetrine in un riscaldatore coperto a 60 °C per 2 ore per migliorare l'aderenza del tessuto.
   NOTA: Le sezioni che si estendevano oltre l'area di 6,5 × 6,5 mm non sono state lavorate.
2. Dopo l'incubazione, eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) utilizzando un protocollo standard di colorazione H&E, sostituendo acqua del rubinetto con acqua deionizzata per preservare l'integrità dell'RNA.
3. Montare i coverslip utilizzando l'80% di glicerolo e acquisire immagini H&E ad alta risoluzione, fornendo un'immagine di riferimento di qualità superiore per sostituire la tipica immagine H&E generata dal sistema di imaging a vetrata e trasferimento tessutale.
4. Dopo l'imaging, rimuovere le coperture immergendo le vetrine singolarmente in tubi da 50 mL contenenti acqua deionizzata, e preparare le vetrine per la consegna all'impianto di core per la successiva lavorazione.

5. Trascrivomica spaziale basata su immagini

NOTA: Le vetrine sono state fornite^{dal produttore di 20}, ciascuna contenente un'area immaginabile designata (linee delineate) di misura 12 mm × 24 mm, con una regione di posizionamento del campione disponibile di circa 235 mm² (10,45 mm × 22,45 mm).

1. Posizionare le sezioni tissutali completamente all'interno di quest'area definita, assicurandosi che le sezioni, inclusa la paraffina residua, non si sovrappongano. Quando si posizionano più sezioni adiacenti, riscaldare brevemente le vetrine su uno scaldatore a 40 °C per favorire l'adesione e prevenire il distacco di sezioni già montate.
2. Dopo aver posizionato tutte le sezioni di tessuto, posiziona le vetri in un scaldavetri coperto e incuba durante la notte a 40 °C per garantirne una corretta aderenza.
3. Dopo l'incubazione, si segue il protocollo¹⁹ del produttore per elaborare le vetrine e caricarle nella macchina per il sequenziamento dell'RNA, con il protocollo incrociato con la versione più recente, poiché i dettagli procedurali sono soggetti ad aggiornamenti periodici.
   NOTA: Tutti i materiali pericolosi generati durante il protocollo, come formalina, etanolo e soluzioni decontaminanti con RNasi, devono essere smaltiti secondo le politiche di sicurezza istituzionali e le normative locali, utilizzando i contenitori adeguati per rifiuti chimici, metodi di smaltimento dei biohazard e pratiche di cappe a fumo.

Results

Questo metodo delinea l'elaborazione di teste embrionali di topo appena dissezionate per generare campioni FFPE di tessuti craniofacciali, incluso il dente in via di sviluppo, che possono essere facilmente sezionati tramite microtomo mantenendo l'integrità dell'RNA (Figura 1). Questo protocollo è stato applicato con successo alle teste embrionali E13.5 (giorno embrionale 13.5), E15.5 ed E16.5 per regioni craniofaciali ad alta risoluzione basate su immagini (...

Discussion

In questo lavoro, presentiamo un protocollo dettagliato per preparare blocchi FFPE di teste embrionali di topo ottimizzati per l'uso con piattaforme di imaging spaziale ad alta risoluzione dell'RNA, inclusi trascrittomica spaziale basata su sequenziamento e imaging. Un obiettivo chiave di questo protocollo è preservare sia la morfologia tissutale sia l'integrità degli acidi nucleici su sezioni intere della testa, con particolare attenzione alla regione craniofacciale in sviluppo. Garanti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  per eseguire lavaggi durante il flusso di lavoro
Tubi conici da 50 mL (Ambion) senza RNAsi	Thermo Fischer	AM12502	Usare per conservare campioni in diverse soluzioni
Oscillatore orbitale avanzato	VWR	6683-470	Da usare per scuotere i tessuti in soluzione di fissazione durante l'incubazione
Alcol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Usalo per pulire e disinfettare tutto lo spazio di lavoro
Processore automatico di tessuti a vuoto	Leica Biosystems	ASP300S	Uso per eliminare, disidratazione, reidratazione e infiltrazione di cera dei campioni
Spessore vetro di copertura 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Utilizzo per il montaggio di slide nel flusso di lavoro Visium HD
Buffer di bluing Dako, pronto all'uso	Agilant Technologies	CS70230-2	Uso per H& Colorazione E
Eosina-Y con flossina	Fisher Scientific	22050198	Uso per H& Colorazione E
Ematossilina, Mayer, Soluzione acquosa pronta all'uso	Agilant Technologies	S330930-2	Uso per H& Colorazione E
Bagno d'acqua HistoCore	Leica Biosystems	HIS2326	Usare per far galleggiare le sezioni a 40-43 °C; C per rimuovere le rughe dalle sezioni FFPE
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Uso per analizzare i dati Visium HD
Lame usa e getta a profilo basso DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Usare per sezionare i blocchi FFPE
Formalina tamponata neutra 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Usato per sistemare i tessuti
Soluzione di decontaminazione RNase RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Uso per pulire e rimuovere RNase
Microtomo rotatorio semi-automatizzato	Leica Biosystems	RM2245	Usa per sezionare i blocchi FFPE come riportato nelle linee guida.
Scaldalleve con copertura	Premiere	XH2004	Utilizzo per l'incubazione di vetri a diverse temperature
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Uso per collegare sezioni per Vsium HD
Lama chirurgica n. 11	Integra Miltex	4-311	Uso per la puntatura dei tessuti FFPE
Paraplasto Chirurgico	Leica Biosystems	39601006	Uso per effettuare l'infiltrazione dei tessuti e l'inserimento dei tessuti
TISsue DISH CULTURE 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Uso per raccogliere e dissezionare campioni in 1x PBS
Glicerolo UltraPure	Thermo Fischer	15514011	Uso per il montaggio a slitta Visium HD del coverglass prima di CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Uso per esperimenti di workflow Visium HD
Visium HD Sequenziamento Spaziale dell'RNA	10X Genomics, Inc.	1000676	Uso per eseguire esperimenti trasscrittomici spaziali
Localizzazione in situ dell'RNA Xenium 5K	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Uso per eseguire esperimenti trasscrittomici spaziali
Analizzatore di Xeno	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Utilizzare l'imaging di Xenium e Xenium 5K RNA
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Uso per analizzare i dati Xenium
Localizzazione in situ dell'RNA dello xeno	10X Genomics, Inc.	1000672	Uso per eseguire esperimenti trasscrittomici spaziali