Test standardizzato di citometria a flusso utilizzando pannelli di anticorpi ricombinanti secchi per la caratterizzazione delle cellule T CAR

Sommario

Questo protocollo dimostra come i pannelli di anticorpi ricombinanti secchi semplifichino la caratterizzazione delle cellule Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) riducendo la variabilità e semplificando i flussi di lavoro. Consente una valutazione riproducibile degli attributi critici della qualità, inclusa la quantificazione assoluta delle cellule T recettori dell'antigene chimerica, ed è compatibile tra diverse piattaforme di citometria a flusso.

Abstract

La citometria a flusso è comunemente utilizzata per valutare attributi critici di qualità delle cellule T del recettore Chimeric Antigen T (CAR T), inclusa vitalità, fenotipo ed efficienza di trasduzione. I flussi di lavoro convenzionali con reagenti liquidi richiedono molteplici fasi di preparazione, che possono introdurre variabilità e differenze nella gestione dipendente dall'operatore. I pannelli di anticorpi ricombinanti essiccati preformulati offrono un formato alternativo che combina la tecnologia degli anticorpi ricombinanti con una configurazione pronta all'uso. Gli anticorpi ricombinanti offrono una specificità definita e una variabilità ridotta da un lotto all'altro, mentre il formato essiccato riduce le fasi di preparazione e semplifica la gestione dei reagenti. Qui presentiamo un flusso di lavoro passo dopo passo per l'analisi delle cellule CAR T utilizzando pannelli di anticorpi ricombinanti essiccati. Il protocollo include la colorazione dei campioni, l'acquisizione e l'analisi dei dati, ed è accompagnato da una panoramica schematica del flusso di lavoro. Risultati rappresentativi di colorazione sono mostrati come un esempio dell'applicazione dei pannelli e vengono evidenziate differenze nel tempo di utilizzo pratico rispetto a un flusso di lavoro convenzionale con reagenti liquidi. Gli esempi forniti dimostrano come questi pannelli possano essere utilizzati per semplificare la caratterizzazione multiparametrica delle cellule T CAR. Nel complesso, questo lavoro fornisce un quadro pratico per l'implementazione di pannelli di anticorpi ricombinanti secchi nell'analisi delle cellule CAR T basate su citometria di flusso.

Introduzione

Le terapie con cellule CAR T sono emerse come un importante progresso nel trattamento del cancro, in particolare per le neoplasie ematologiche. Questo approccio utilizza il sistema immunitario del paziente modificando le cellule T per esprimere recettori antigenici chimerici (CAR) che riconoscono e colpiscono le cellule^{tumorali 1}. Tuttavia, l'infrastruttura altamente complessa e i processi produttivi ad alta intensità di lavoro necessari per produrre le cellule CAR T rendono essenziale una caratterizzazione rigorosa e standardizzata per garantire sia la qualità del prodotto che la sicurezza del paziente. Una parte sostanziale del costo complessivo della terapia CAR T deriva dall'ampio lavoro di laboratorio e dalle procedure di controllo qualità (QC), molte delle quali prevedono flussi di lavoro manuali e a più fasi. In questo contesto, parametri chiave di caratterizzazione—come l'efficienza della trasduzione e il test di identità—sono cruciali per valutare il potenziale terapeutico delle cellule^{modificate 2}. I metodi tradizionali di colorazione liquida nella citometria a flusso, comunemente utilizzati per queste valutazioni, presentano diverse sfide. La variabilità nel pipetaggio, problemi di stabilità dei reagenti e bias dell'operatore possono portare a incongruenze e inesattezze nei dati, compromettendo potenzialmente l'affidabilità dei^{risultati 3}.

La citometria a flusso è una tecnologia fondamentale per la caratterizzazione e il controllo di qualità delle cellule T CAR, consentendo un'analisi dettagliata di più parametri cellulari. Tuttavia, l'uso convenzionale di reagenti liquidi in questo processo è pieno di potenziali^{insidie 4,5}. La variabilità del pipettamento può introdurre errori significativi, specialmente quando si tratta di piccoli volumi e più reagenti. Inoltre, i reagenti liquidi sono suscettibili alla degradazione nel tempo, il che può comprometterne la stabilità e produrre colorazioni^{incoerenti 6}. Il bias dell'operatore, derivante dalla preparazione e gestione manuale, aggrava ulteriormente questi problemi, portando potenzialmente a variabilità nei risultati tra laboratori e persino all'interno delle sessioni nello stesso laboratorio. Attributi critici di qualità come la vitalità della cellula, la frequenza di trasduzione, il conteggio di CD3⁺ e l'identità sono essenziali per il rilascio sicuro dei prodotti CAR T. Garantire l'accuratezza e la coerenza di queste misurazioni è fondamentale, poiché influenzano direttamente l'efficacia terapeutica e la sicurezza delle cellule T^CAR. Ad esempio, una valutazione accurata della frequenza di trasduzione è fondamentale per determinare la proporzione di cellule T modificate con successo per esprimere il CAR, mentre il conteggio e la percentuale di CD3⁺ forniscono informazioni sulla composizione complessiva e la purezza della popolazione di cellule T.

I panel di anticorpi essiccati offrono una soluzione promettente a queste sfide, garantendo una somministrazione costante dei reagenti e riducendo i tempi di installazione e il rischio di errori. Questi pannelli sono composti da più anticorpi essiccati da cocktail premiscelati. Dopo l'asciugatura, questi pannelli sono stabili e pronti all'uso, eliminando la necessità di complesse fasi di preparazione e minimizzando il potenziale errore^{umano 6,7}. È importante sottolineare che non è necessario ricostituire questi pannelli essiccati prima dell'uso: le sospensioni cellulari possono essere aggiunte direttamente alla miscela di anticorpi essiccati. L'incorporazione di anticorpi ricombinanti in questi formati essiccati offre diversi vantaggi rispetto ai reagenti policlonali convenzionali o derivati da ibridoma. La loro struttura definita molecolarmente garantisce un'elevata coerenza e riproducibilità da lotto a lotto, riducendo la variabilità tra esperimenti e laboratori. Una regione Fc ingegnerizzata basata su IgG1 umano minimizza la reattività incrociata e la colorazione di fondo. Di conseguenza, il blocco Fc non è necessario, riducendo ulteriormente il tempo necessario per eseguire il test citometrico a flusso. Il formato essiccato protegge i reagenti dalla degradazione, mantenendone l'efficacia nel tempo e tra i lotti. Questa coerenza è fondamentale per ottenere risultati affidabili e riproducibili negli saghi di citometria a flusso⁸.

L'applicabilità dei formati di reagenti essiccati si estende a varie fasi dello sviluppo e del monitoraggio della terapia con cellule CAR T. Nel controllo qualità della produzione, i reagenti essiccati facilitano il campionamento in sistema chiuso, garantendo sterilità e coerenza. Questo è particolarmente importante in un contesto clinico, dove mantenere l'integrità del campione è fondamentale⁹. Per la caratterizzazione del prodotto, i reagenti essiccati permettono una valutazione accurata dei conteggi assoluti e dei sottoinsiemi immunitari, elementi cruciali per determinare la qualità terapeutica delle cellule T CAR. Inoltre, in ambito di ricerca, i reagenti essiccati sono preziosi per il monitoraggio longitudinale del paziente, permettendo un monitoraggio costante della persistenza delle cellule CAR T nel tempo, cosa fondamentale per comprendere l'efficacia e la sicurezza a lungo termine della terapia.

I vantaggi dell'uso di pannelli ad anticorpi secchi nella citometria a flusso sono molteplici, uno dei più importanti dei quali è la capacità di ridurre gli errori di pipetting fornendo un pannello completamente preconfigurato invece di richiedere la sospensione e la combinazione manuale dei singoli reagenti. A differenza degli anticorpi singoli essiccati—che devono ancora essere ricostituiti e pipettati e quindi offrono principalmente una durata di conservazione prolungata—i pannelli secchi preassemblati eliminano molteplici fasi manuali di preparazione. Questo semplifica il flusso di lavoro, riducendo significativamente le opportunità di variabilità dipendente dall'operatore. Di conseguenza, il processo complessivo diventa meno soggetto a errori, meno dispendioso in termini di tempo e meno dipendente da una formazione tecnica estesa, rendendolo accessibile a una gamma più ampia di laboratori¹⁰. Inoltre, il formato stabile e pronto all'uso dei panelli di anticorpi ricombinanti essiccati garantisce prestazioni coerenti e affidabili del test su operatori e^{località 9}.

Per realizzare appieno il potenziale della tecnologia dei reagenti essiccati nella citometria a flusso, è essenziale sviluppare un protocollo passo dopo passo per il suo utilizzo. Ciò include linee guida per la tintura di pannelli essiccati, l'acquisizione e l'analisi automatizzata, garantendo che tutti gli aspetti del processo siano standardizzati e ottimizzati per accuratezza ed efficienza. Fornendo un protocollo chiaro e completo, i laboratori possono ottenere risultati coerenti e affidabili, facilitando il rilascio sicuro ed efficace dei prodotti a cellule^{CAR T 2}. Qui forniamo un protocollo che sfrutta i vantaggi dei panel di anticorpi essiccati per affrontare le limitazioni dei metodi tradizionali di colorazione liquida, migliorando così affidabilità, efficienza e riproducibilità — caratteristiche chiave per garantire terapie CAR T cellule sicure ed efficaci (Figura 1).

Protocollo

Tutti i campioni umani sono stati raccolti da volontari anonimi sani dopo aver ottenuto un consenso informato scritto. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ärztekammer Nordrhein (#2020272) e eseguite in conformità con le normative etiche e di biosicurezza richieste.

1. Raccolta e preparazione dei campioni

1. Raccogliere campioni di cellule Chimeric Antigen Recettore T (CAR T) in modo asetttico dalle buste di lavorazione per il controllo qualità della produzione.
2. Processare rapidamente i campioni per mantenere la vitalità cellulare. Conservare i campioni a 2–8 °C, protetti dalla luce, fino a quando non si colorano.
3. Determina il numero di celle di ciascun campione prima della colorazione.
4. Regolare ogni campione a una concentrazione fino a 10^{cellule 6} nucleate per 100 μL utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)/2 mM EDTA/0,5% BSA buffer, pH 7,2.
   1. Se necessario, centrifuga i campioni a 300 × g per 5 minuti. Aspira completamente il soprantantante.
   2. Risospendere le cellule alla concentrazione corretta.

2. Tintura del pannello essiccato

NOTA: Due pannelli di anticorpi essiccati preformulati sono utilizzati per colorare i campioni: il Cocktail di Composizione Cellulare Immunitaria (ICC) ricombinante secco, umano, e il Cocktail di Trasduzione CAR T ricombinante essiccato, umano. La colorazione CAR per il pannello di trasduzione CAR T è fondamentale. È necessaria una separazione affidabile tra cellule CAR-negative e CAR-positive per determinare accuratamente la frequenza di trasduzione. Il lavaggio può ridurre il recupero cellulare a causa della perdita cellulare durante centrifugazione e aspirazione. Pertanto, i protocolli no-wash sono generalmente preferiti quando è richiesta una concentrazione cellulare accurata.

1. ICC Cocktail (protocollo no-wash)
   1. Aggiungere 100 μL della sospensione cellulare preparata direttamente al tubo dell'anticorpo ICC essiccato. Mescola pipettando su e giù e/o brevemente un vortice per sciogliere completamente il pellet. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente (19–25 °C).
   2. Conferma che il pellet di anticorpi essiccato sia completamente sciolto. Procedere direttamente all'acquisizione senza un lavaggio.
2. Cocktail di trasduzione CAR T (protocollo di lavaggio)
   1. Aggiungere 100 μL della sospensione a celle preparate al tubo di trasduzione CAR T essiccato.
   2. Aggiungi il volume appropriato del reagente di rilevamento CAR (ad esempio, 2 μL). Mescola pipettando su e giù e/o brevemente un vortice per sciogliere completamente il pellet. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente (19–25 °C). Conferma che il pellet di anticorpi essiccato sia completamente sciolto.
   3. Lava le cellule aggiungendo 1 mL di tampone. Centrifuga a 300 × g per 5 minuti. Rimuovi completamente il soprantantante.
3. Colorazione secondaria (se necessario)
   1. Eseguire un secondo lavaggio (vedi passo 2.2.3) per i reagenti di rilevamento CAR marcati con biotina per rimuovere i reagenti coniugati con biotina libera e ridurre la macchia di fondo.
   2. Risospendere le cellule in 98 μL di buffer. Aggiungere 2 μL di anticorpo secondario marcato con ficoeritrina (PE). Vortice per un breve periodo di miscelazione. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente (19–25 °C).
   3. Lavare le cellule per rimuovere l'anticorpo secondario non legato (vedi passo 2.2.3).
4. Preparazione finale per l'acquisizione
   1. Regolare il volume di tutti i campioni colorati (CAR T Trasduction Cocktail e ICC Cocktail) a 300–500 μL con buffer. Proteggi i campioni dalla luce e manteni i valori tra 2 e 8 °C.
   2. Effettuare l'acquisizione entro 1 ora per mantenere la stabilità del fluoroforo e preservare la vitalità cellulare.

3. Acquisizione citometrica a flusso e analisi dei dati

1. Preparare e preparare il citometro a flusso, assicurandosi che la calibrazione e le impostazioni dello strumento siano ottimizzate.
2. Accendi i laser e risciacqua il sistema fluidico. Lascia almeno 30 minuti perché il banco ottico si scaldi.
3. Durante il riscaldamento, esegui un programma di pulizia con una soluzione di ipoclorito all'1%.
4. Usa le sfere di calibrazione per regolare le impostazioni del laser.
5. Prepara controlli a singola colorazione per la compensazione utilizzando set di anticorpi corrispondenti.
   1. Per le perline: aggiungi un volume appropriato di perline di controllo positivo e negativo.
   2. Per le celle: aggiungi 100 μL di sospensione cellulare.
   3. Per i reagenti coniugati con biotina: includere un tubo con 98 μL di tampone più 2 μL di anticorpo secondario marcato con PE.
   4. Verifica che i reagenti di compensazione corrispondano al cocktail di anticorpi (numeri di lotto).
6. Incubare i controlli per 10–20 secondi, il vortice per 5 secondi, poi incubare per 10 minuti al buio a 19–25 °C.
7. Diluire i campioni con 600 μL di tampone e mescolare accuratamente.
8. Imposta la compensazione usando controlli a singola colorazione.
9. Regolare le tensioni FSC e SSC e definire soglie per escludere i detriti.
10. Acquisire almeno 50.000–100.000 linfociti vivi per campione.
11. Eseguire gating per valutare la vitalità, l'espressione CD3 e l'espressione CAR.
12. Per la quantificazione assoluta, si determina la frazione di cellule T CAR-positive (f₍CAR T₎).
13. Definire i leucociti totali (N₍total₎) come ^CD45+ vitali, singole cellule dopo l'esclusione dei detriti.
14. Misurare il conteggio totale dei leucociti tramite conteggio diretto da campioni colorati in ICC, se supportato dallo strumento, oppure utilizzando sfere di conteggio o un analizzatore ematologico.
15. Calcola la concentrazione delle cellule CAR T:
    
    NOTA: Esempio di calcolo con valori tratti dalla Figura 2 e dalla Figura 3
    ​
    
16. Applica questo metodo per la quantificazione delle cellule T CAR su diversi strumenti e flussi di lavoro.

Risultati

Sono stati applicati pannelli di anticorpi ricombinanti essiccati su campioni di cellule CAR⁺ T per dimostrare i flussi di lavoro di colorazione della citometria a flusso. Come illustrato nella Figura 1, sostituire i flussi di lavoro convenzionali dei reagenti liquidi con pannelli di anticorpi essiccati preformulati elimina diversi passaggi di preparazione—tra cui l'etichettatura del tubo (per indicare la composizione degli anticorpi del panel; ogni tubo richiede comunque l'ID del campione appropriato), la combinazione dei reagenti e la miscelazione manuale—semplificando così il processo di colorazione. I tubi includono un'etichetta che può essere scansionata con citometri compatibili o letta manualmente, offrendo opzioni flessibili per l'identificazione del campione.

Esempi rappresentativi mostrano che il pannello di composizione delle cellule immunitarie secche consente l'identificazione dei sottoinsiemi chiave di leucociti (Figura 2), mentre il pannello di trasduzione CAR T essiccata consente la visualizzazione delle cellule T espresse CAR e la valutazione della trasduzione (Figura 3). Il blocco della Fc non è richiesto per questi pannelli e è necessario un solo controllo isotipo per tutti gli anticorpi presenti nel pannello. Questi esempi evidenziano l'applicazione dei pannelli essiccati per l'analisi multiparametrica delle cellule T CAR e dimostrano come il flusso di lavoro possa essere eseguito in modo efficiente con passaggi pratici ridotti. La composizione dei panel di anticorpi essiccati utilizzati in questo studio è fornita nella Tabella 1.

La Figura 4 illustra la riduzione del tempo di preparazione per un esperimento rappresentativo quando si utilizzano pannelli essiccati sia per utenti meno esperti che per quelli più esperti. Il formato essiccato semplifica le procedure di colorazione, minimizza la gestione manuale e fornisce indicazioni pratiche per l'implementazione e la formazione del flusso di lavoro. È importante sottolineare che l'uso di cocktail di anticorpi essiccati ha prodotto frequenze di sottoinsiemi di cellule immunitarie comparabili a quelle ottenute con i cocktail liquidi convenzionali (Figura 5). Inoltre, i pannelli di anticorpi essiccati sono stabili a temperatura ambiente e possono essere conservati in condizioni ambientali per tutta la loro durata di conservazione di un anno, a differenza degli anticorpi liquidi convenzionali, che tipicamente richiedono conservazione a freddo. Questa stabilità supporta un uso ripetuto, studi a lungo termine e una gestione semplificata dell'inventario.

In conclusione, gli esempi forniti dimostrano come i pannelli di anticorpi ricombinanti essiccati possano essere utilizzati per semplificare la caratterizzazione multiparametrica delle cellule T CAR. Nel complesso, questo lavoro offre un approccio pratico per l'implementazione dei pannelli ad anticorpi essiccati nell'analisi delle cellule CAR T basate su citometria di flusso, con una gestione semplificata, passaggi di preparazione ridotti e configurazioni di panel adattabili.

Figura 1: Confronto tra il flusso di lavoro di colorazione manuale e i pannelli di anticorpi ricombinanti secchi. Il flusso di lavoro manuale tradizionale (in alto) prevede molteplici fasi di preparazione, tra cui l'etichettatura dei tubi, la combinazione e la miscelazione dei reagenti, e l'aggiunta di campioni, che possono aumentare lo sforzo manuale. Al contrario, il flusso di lavoro del pannello di anticorpi ricombinanti secchi (in fondo) utilizza pannelli premessi e secchi che richiedono solo l'aggiunta del campione. Questo approccio semplificato riduce i passaggi manuali e semplifica il processo di colorazione, illustrando l'efficienza del flusso di lavoro e l'implementazione pratica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi citometrica a flusso di un campione di leucaforesi colorato con il pannello di anticorpi ricombinanti secchi "Immune Cell Composition Cocktail". (A) I detriti sono stati esclusi tramite gating su FSC rispetto a SSC per includere tutte le cellule. (B) I doppietti venivano rimossi usando una porta FSC-A contro FSC-H. (C) I leucociti sono stati identificati tramite gating su cellule CD45⁺ , permettendo l'esclusione degli eritrociti residui. (D) Le cellule morte sono state escluse tramite colorazione 7-AAD. (E,F) Le cellule CD3⁺ sono state identificate e ulteriormente classificate in cellule (E) T e (F) cellule NKT sulla base dell'espressione di CD56. (G) Le cellule T sono state successivamente separate in sottoinsiemi CD4⁺ e CD8⁺ . (H) All'interno della popolazione CD3^– , i monociti erano definiti dall'espressione del CD14 e le cellule B dall'espressione del CD19. (I) Le restanti cellule CD14^–/CD19^– sono state suddivise in eosinofili SSC alto/^CD16, neutrofili SSC alto/CD16⁺ e cellule SSC basse/CD56⁺/CD16⁺ . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi citometrica a flusso delle cellule CAR T CD19 (FMC63) colorate con il pannello di anticorpi ricombinanti essiccati "CAR T Transduction Cocktail". (A) I detriti sono stati esclusi tramite gating su FSC rispetto a SSC per includere tutte le cellule. (B) I doppietti venivano rimossi usando una porta FSC-A contro FSC-H. (C) I leucociti sono stati identificati tramite gating su cellule CD45⁺ . (D) Le cellule morte sono state escluse sulla base della colorazione con 7-AAD⁻ . (E,F) Le cellule CD3⁺ sono state identificate e successivamente separate in popolazioni ^CAR+ e ^CAR− . (G) Le cellule ^CAR+ e (H) CAR⁻ sono state ulteriormente suddivise in sottoinsiemi di cellule T CD4⁺ e CD8⁺ . (I) All'interno della popolazione CD3⁻ , i monociti residui sono stati definiti dall'espressione di CD14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risparmi di tempo ottenuti con pannelli di anticorpi essiccati in vari livelli di esperienza. Per gli utenti non esperti (a sinistra) e quelli esperti (a destra), è stato valutato il tempo necessario per impostare un esperimento citometrico a flusso (pannello di anticorpi ricombinanti secchi "Immune Cell Composition Cocktail", triplicati tecnici) dall'inizio dell'esperimento fino all'inizio dell'incubazione, includendo la gestione dei reagenti, la pipettura e la documentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi della citometria a flusso del sangue intero lisato, sovrapposizione di un campione colorato con il pannello di anticorpi ricombinanti secchi "Immune Cell Composition Cocktail" (blu) e un campione colorato con gli stessi anticorpi in formato liquido (arancione). (A) I detriti sono stati esclusi tramite gating tra FSC e SSC per includere tutte le cellule. (B) I doppietti venivano rimossi usando una porta FSC-A contro FSC-H. (C) I leucociti sono stati identificati tramite gating su cellule CD45⁺ , escludendo così gli eritrociti residui. (D) Le cellule morte sono state escluse tramite colorazione 7-AAD. (E) Sono state identificate cellule CD3⁺ . (F) Queste cellule sono state poi classificate in cellule T e cellule NKT basate sull'espressione del CD56. (G) Le cellule T sono state successivamente separate in sottoinsiemi CD4⁺ e CD8⁺ . (H) All'interno della popolazione CD3^– , i monociti erano definiti dall'espressione del CD14 e le cellule B dall'espressione del CD19. (I) Le restanti cellule CD14^–/CD19^– sono state suddivise in eosinofili SSC alto/^CD16, neutrofili SSC alto/CD16⁺ e cellule SSC basse/CD56⁺/CD16⁺ . (J) Sono state confrontate le frequenze ottenute con anticorpi liquidi e pannelli di reagenti essiccati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Scopo	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
Determinazione della vitalità cellulare e della composizione delle cellule immunitarie	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
Determinazione dell'efficienza di trasduzione delle cellule T CAR	CD45	CD4	CD3	Reagente per il rilevamento CAR	7-AAD	/	CD14	CD8

Tabella 1: Composizione dei pannelli di anticorpi ricombinanti essiccati utilizzati per l'analisi delle cellule CAR T. Questa tabella elenca gli anticorpi inclusi in ogni pannello essiccato, specificando l'antigene bersaglio, il clone, il fluorocromo e la quantità tipica per provetta. Sono mostrati due pannelli: il pannello "Composizione delle Cellule Immunitarie" per l'identificazione dei principali sottoinsiemi di leucociti, e il pannello "CAR T Transduction" per la rilevazione dell'espressione CAR e la caratterizzazione dei sottoinsiemi delle cellule T. Le informazioni forniscono un riferimento per l'implementazione del flusso di lavoro e l'adattamento opzionale con anticorpi coniugati liquidi aggiuntivi.

Discussione

I pannelli di anticorpi ricombinanti essiccati forniscono un flusso di lavoro snello e pratico per la caratterizzazione delle cellule CAR T in laboratorio. Il formato preformulato riduce i passaggi di preparazione e semplifica la gestazione, aiutando a limitare la variabilità dipendente dall'operatore e a supportare l'esecuzione coerente delle procedure di citometria a flusso^{multiparametrico 8}. Esempi rappresentativi illustrano l'uso di questi pannelli per identificare sottoinsiemi di leucociti, rilevare l'espressione di CAR e valutare sottoinsiemi di cellule T. I panel possono anche essere integrati con anticorpi coniugati liquidi aggiuntivi per includere marcatori aggiuntivi o sottoinsiemi immunitari, consentendo un adattamento flessibile a specifiche esigenze sperimentali o analisi a parametri più alti.

Una rilevazione accurata della CAR è fondamentale per la determinazione affidabile della frequenza^{di trasduzione 1}. La separazione chiara delle popolazioni CAR-negative e CAR-positive dipende da condizioni di colorazione adeguatamente ottimizzate, in particolare quando i livelli di espressione CAR variano. Controlli come i campioni di fluorescenza meno uno (FMO) possono supportare una gating accurata. In alcuni casi, i passaggi di lavaggio possono migliorare la discriminazione rimuovendo gli anticorpi non legati; tuttavia, questi passaggi possono ridurre il recupero cellulare a causa della perdita cellulare durante centrifugazione e aspirazione. Pertanto, possono essere preferiti flussi di lavoro senza lavaggio quando è richiesta una quantificazione accurata delle cellule.

Sebbene l'approccio utilizzi idealmente un reagente di rilevamento specifico per il CAR che riconosca il dominio extracellulare del CAR ingegnerizzato, possono essere impiegati anche reagenti alternativi, come gli anticorpi che mirano alle regioni di collegamento conservato tra i domini di legame degli antigeni e di segnalazione. Queste alternative consentono il rilevamento delle celle che esprimono CAR e possono essere incorporate nei flussi di lavoro in cui i reagenti specifici per CAR non sono disponibili, con l'ottimizzazione appropriata.

L'integrazione con sistemi automatizzati di acquisizione e analisi, inclusa Express Mode, può semplificare ulteriormente la raccolta e l'analisi dei dati, riducendo il tempo di interazione pratica e consentendo un'esecuzione coerente dei flussi di lavoro tra gli operatori.

Sebbene questo lavoro illustri il metodo, non è stata effettuata una validazione formale del saggio per la produzione regolamentata o i test di rilascio. La validazione multicentrica non è ancora stata condotta, quindi la riproducibilità tra i laboratori deve ancora essere^{confermata 5}. L'approccio si basa su pannelli preformulati, il che può limitare la flessibilità per applicazioni altamente specializzate. Tuttavia, le opzioni di pannelli essiccati su misura possono essere progettate per includere marcatori o combinazioni specifiche, permettendo flussi di lavoro su misura e superando i limiti dei pannelli standard. Le considerazioni di costo sono in gran parte bilanciate da una riduzione del tempo di lavoro pratico e da procedure semplificate, che possono essere particolarmente vantaggiose in flussi di lavoro ad alta produttività.

I lavori futuri potrebbero concentrarsi su valutazioni quantitative delle prestazioni, validazione formale per l'uso regolamentato e espansione a studi multicentrici per valutare la coerenza dei flussi di lavoro tra i laboratorio. La progettazione personalizzata dei pannelli rappresenta una via pratica per ampliare la copertura dei marker, affrontare domande sperimentali uniche o adattarsi a studi di immunomonitoraggio longitudinale.

In sintesi, i pannelli di anticorpi ricombinanti essiccati forniscono una piattaforma flessibile e pratica per la citometria di flusso delle cellule CAR T. Riducono i passaggi di preparazione, semplificano i flussi di lavoro e supportano un design sperimentale flessibile, incluse configurazioni personalizzate di pannelli.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(Opzionale) Biotin Antibody, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Solo se viene utilizzato un reagente di rilevamento CAR coniugato con Biotina.
(Opzionale) CAR T Cell Express Mode Package	Miltenyi Biotec	160-002-376	Add-on software per analizzatori MACSQuant; consente l'automatizzazione del gating e dell'analisi dei dati, anche se è possibile un'analisi manuale.
Reagente di rilevamento CAR di scelta rilevabile nel canale PE, ad esempio, CD19 CAR Reagente di Rilevamento, umano, Biotina	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Opzioni alternative: CD19 CAR FMC63 Idiotype Antibody, PE, REAfinity (130-127-342); CD22 CAR Reagente di Rilevamento, umano, Biotina (130-126-727); BCMA CAR Reagente di Rilevamento, umano, PE (130-133-888)
Citofluometro, ad esempio, MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	I tubi StainExpress sono compatibili con tutti i citofluometri standard.
StainExpress CAR T Transduction Cocktail, umano	Miltenyi Biotec	130-127-638	Le configurazioni personalizzate del pannello di anticorpi secchi possono essere richieste tramite il rappresentante Miltenyi Biotec locale o il team di supporto tecnico.
StainExpress Immune Cell Composition Cocktail, umano	Miltenyi Biotec	130-127-637	Le configurazioni personalizzate del pannello di anticorpi secchi possono essere richieste tramite il rappresentante Miltenyi Biotec locale o il team di supporto tecnico.