Test di citometria multiplex basata su perle per profilazione funzionale delle cellule T CAR

Sommario

Questo articolo introduce un saggio multiplex di citometria a flusso basato su perle per quantificare fino a 12 citochine e molecole effettrici da supernatanti derivati dalle cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)-T, consentendo un'analisi rapida e riproducibile della funzionalità ingegnerizzata delle cellule T con piccoli volumi di campioni.

Abstract

Il profilaggio delle cellule CAR T presenta sfide a causa della loro eterogeneità, delle risposte immunitarie complesse e della limitata disponibilità di campioni. I saggi multiplex consentono la valutazione funzionale consentendo la rilevazione simultanea di un'ampia gamma di molecole effettori, inclusi citochine, chemichine e mediatori citotossici. Qui descriviamo un saggio multiplex basato su perle compatibile con la citometria a flusso per l'analisi della secrezione di molecole di effettore da parte delle cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)-T umano. I supernatanti delle cellule T CAR sono incubati con una miscela di sfere di cattura che comprendono più popolazioni codificate per fluorescenza accoppiate ad anticorpi specifici per analiti. Queste sfere legano bersagli solubili nel campione, formando complessi perla-analite che vengono successivamente rilevati tramite anticorpi di rilevamento marcati. Il test include un pannello di mediatori immunitari come interferone (IFN)-γ, interleucina (IL)-2, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, IL-6, IL-10, fattore stimolante della colonia granulocita-macrofagi (GM-CSF) e Granzyme B. L'uso di standard predefiniti consente la misurazione quantitativa di più analiti da un singolo campione. L'acquisizione e l'analisi dei dati possono essere effettuate utilizzando approcci di gate automatizzati forniti da strumenti software associati a strumenti o basati sul web, facilitando l'elaborazione dei dati. In conclusione, il test multiplex presentato consente un'analisi multiparametrica della funzionalità delle cellule CAR T e può essere applicato in contesti come ricerca, test di controllo qualità, studi meccanicistici e caratterizzazione funzionale.

Introduzione

La caratterizzazione funzionale è essenziale nel test delle cellule T del Recettore dell'Antigene Chimerico (CAR) poiché fornisce informazioni sulla potenza, sicurezza e meccanismi d'azione di queste terapie. Comprendere citochine e firme mediatori citotossici aiuta a valutare l'efficacia terapeutica e i potenziali effetti avversi, garantendo lo sviluppo di trattamenti sicuri ed efficaci. I tradizionali saggi a plex singolo come gli saggi immunosorbenti legati a enzimi (ELISA) presentano limitazioni, come la necessità di alti volumi di campioni, tempi di elaborazione lunghi e esecuzioni separate per ogni analita, offrendo al contempo un intervallo dinamico limitato all'interno dei singoli^{campioni 1,2}. Al contrario, gli saggi basati su perle multiplex permettono il rilevamento simultaneo di più mediatori solubili, riducendo i tempi di elaborazione e i requisiti di campione aumentando al contempo il range^{dinamico 1,2}. Questa efficienza e profondità di analisi rendono i saghi multiplex strumenti preziosi per promuovere la ricerca e lo sviluppo delle cellule^{CAR T 3,4,5}.

Il test multiplex presentato in questo studio utilizza perle di cattura, che presentano profili di fluorescenza definiti nei canali fluoresceina isotiocianato (FITC) e ficoeritrina (PE) e sono rivestiti con anticorpi specifici contro analiti solubili. Durante l'incubazione con un campione, queste sfere legano selettivamente i loro analiti target dalla soluzione. Dopo la cattura dell'analito, vengono aggiunti anticorpi di rilevamento per formare complessi sandwich specifici per l'analite. Questi anticorpi sono direttamente coniugati alloficocianina (APC) (rilevamento diretto) o alla biotina (rilevamento indiretto). Per la rilevazione indiretta, è necessaria un'incubazione successiva con un anticorpo antibiotina coniugato con APC (Figura 1). I complessi risultanti – comprendenti perle di cattura, analiti e anticorpi di rilevamento – vengono analizzati tramite citometria a flusso per quantificare le concentrazioni degli analiti. Il test multiplex è una tecnologia basata su lastre, che include standard predefiniti utilizzati per generare curve standard specifiche per^{l'analita 1,2}.

Figura 1: Principio della tecnologia delle citochine e flusso di lavoro del saggio. Il test si basa su 12 popolazioni di perle di cattura codificate in fluorescenza, accoppiate ad anticorpi specifici per analiti. All'incubazione del campione, si formano complessi perla-analite che possono essere rilevati tramite citometria a flusso utilizzando specifici anticorpi di rilevamento. Il flusso di lavoro del saggio include 1) la preparazione di standard analiti e campioni di interesse su una piastra filtrante, 2) incubazione con perle di cattura, 3) incubazione con anticorpi antianaliti marcati con biotina per formare complessi sandwich, 4) incubazione con anticorpi antibiotinici marcati con APC, 5) risospensione in tampone per la misurazione e 6) acquisizione di campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il test multiplex descritto in questo studio è compatibile con i citometri di flusso standard dotati di un blu (ad esempio, 488 nm; canali FITC e PE) e un laser rosso (ad esempio, 635 nm; APC). Poiché i citometri di flusso sono ampiamente disponibili nei laboratori di ricerca, nei contesti clinici e negli ambienti di controllo qualità, questa compatibilità facilita l'implementazione senza richiedere strumenti specializzati aggiuntivi⁵. Nel contesto del test di funzionalità delle cellule CAR T, questo approccio consente la valutazione multiparametrica delle risposte funzionali all'interno dei flussi di lavoro analitici^{comunemente disponibili 6}. Il saggio offre vantaggi significativi per la ricerca sulle cellule CAR T, consentendo la quantificazione simultanea di analiti chiave, tra cui GM-CSF, Granzyme B, interferone (IFN)-γ, interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, proteina chemoattrattrante monocita-1 (MCP-1), perforina e fattore di necrosi tumorale (TNF)-α (pannello di citotossicità umana). Questi mediatori sono fondamentali per comprendere l'attivazione delle cellule CAR T, la funzione degli effettori e il rilascio di citochine correlate alla^sicurezza 4,5,7,8.

Il flusso di lavoro del saggio include opzioni per il gating automatizzato e l'analisi dei dati utilizzando software associato allo strumento, oltre a strumenti di analisi web indipendenti^{dallo strumento 5}. Queste caratteristiche supportano un'elaborazione snellita dei dati di profilazione delle molecole effettori delle cellule CAR T riducendo l'entità dell'intervento manuale. L'uso dell'analisi automatizzata può contribuire a una maggiore coerenza nella gestione dei dati e facilitare una valutazione più efficiente delle letture^{funzionali 8}.

Il protocollo attuale delinea un metodo multiplex riproducibile e scalabile per il profiling dei mediatori immunitari delle cellule CAR T. Misurando 12 analiti diversi in un singolo campione, l'approccio è particolarmente rilevante per indagini meccanicistiche, ricerche in fase iniziale e studi concomitanti. Nelle fasi avanzate della terapia con cellule CAR T, può essere vantaggioso ridurre il numero di citochine misurate, specialmente in un ambiente di controllo qualità (QC) regolamentato e sensibile al tempo per i test di rilascio del farmaco. A tal fine, da 1 a 7 citochine dal pannello presentato possono essere assemblate per progettare un saggio sulle citochine personalizzato che possa essere validato per l'analisi ingegnerizzata delle cellule T. Questo rende il protocollo descritto ideale per applicazioni diverse sia nella ricerca che in quelle di QC, sia nelle fasi iniziali che avanzate della terapia con cellule^{CAR T} 3,4,5,9.

Protocollo

Tutti i campioni umani sono stati raccolti da volontari anonimi sani dopo aver ottenuto un consenso informato scritto. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ärztekammer Nordrhein (#2020272) e eseguite in conformità con le normative etiche e di biosicurezza richieste.

1. Co-coltura delle cellule CAR T

1. Preparare una coltura cellulare di cellule CAR CAR umane ingegnerizzate in assenza e in presenza di antigene affini, ad esempio cellule tumorali presentanti antigene, in un rapporto di 2,5:1 (effettore: cellule bersaglio).
2. Definire uno o più punti temporali per la raccolta di sovrantanti per analizzare le citochine secrete una volta, o la cinetica delle citochine su un arco di tempo definito, ad esempio a 4, 8, 16, 24 e 48 ore.
   NOTA: I soprantativi possono essere usati direttamente o possono essere congelati per un uso successivo.

2. Preparazione standard e del campione

1. Ricostituire lo standard dell'analita aggiungendo 200 μL di tampone o materiale di coltura cellulare al pellet e mescolarlo delicatamente. Preparare sei tubi di reagente ed eseguire una serie di diluizione 1:5 dello standard ricostituito, fino a 3,2 pg/mL o 0,6 pg/mL (a seconda dell'analite), e preparare un blank.
2. Raccogliere supernanti di co-cultura CAR T, ad esempio 16 ore o 24 ore dopo la co-coltura. Opzionalmente, si prelevano le cellule CAR T per fenotipizzazione parallela utilizzando la citometria a flusso.
3. Centrifugare i campioni a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Usa i soprannatanti ordinati o diluiscili per adattarli alla gamma standard di curve.

3. Flusso di lavoro del saggio

1. Vortice il mix per perle di cattura per sospenderlo completamente. Aggiungere 50 μL dello standard o campione, insieme a 20 μL di perle pre-diluite, ai pozzi di una piastra filtrante da 96 pozzi.
2. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente, scuotendo a 450 giri/min, al buio. Lavare i pozzi due volte con 200 μL di tampone utilizzando un collettore a vuoto o una centrifuga.
3. Aggiungere 100 μL di reagente di rilevamento 1:50 pre-diluito 1:50 (nel tampon). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, scuotendo a 450 giri/min, al buio. Lava due volte.
4. Aggiungere 100 μL di reagente di rilevamento pre-diluito 1:50 2 (nel tampon). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, scuotendo a 450 giri/min, al buio. Lava una volta.
5. Per l'acquisizione, si risospendono i campioni in 200 μL di tampon. Una panoramica del flusso di lavoro del saggio è mostrata nella Figura 1.

4. Acquisizione e analisi dei dati

1. Acquisire dati su un citometro di flusso dotato di laser blu e rossi (sono necessari canali PE, FITC e APC). Quando si lavora con i citometri di flusso MACSQuant, si utilizzano i template Express Mode per il gating e l'analisi dei dati completamente automatizzati.
2. In alternativa, carica i file dati FSC o MQD sullo strumento web InspectoR, che effettua la misurazione automatica quantitativa delle citochine e fornisce risultati pronti all'esportazione indipendentemente dallo strumento utilizzato.
3. Assicurati di verificare la corretta separazione delle 12 diverse popolazioni di perle di cattura nel canale FITC rispetto a quello PE.
4. Applica la curva standard per calcolare le concentrazioni di citochine, esporta ed visualizza i risultati.
5. Per l'acquisizione dati su un citometro di flusso MACSQuant, si utilizza il codice a barre 2D della fiala delle perle di cattura, che contiene tutte le impostazioni di acquisizione rilevanti.
   1. Dopo aver effettuato l'accesso al software, seleziona la Placa Filtro MACSPlex come rack campioni e clicca sul pulsante Codice a barre nella barra per attivare il lettore di codici 2D.
   2. Presentare la fiala al lettore, assicurandosi che il codice sia rivolto verso la luce intermittente a una distanza ottimale di 0,5–2,5 cm.
   3. Nella scheda Autolabel , assegna le Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) e NoLabel. Per le diluizioni seriali dello standard citotossico delle cellule T/NK, definisci le posizioni dei gruppi e, nella scheda Impostazioni , seleziona Modalità Espressa con Tipo: Analisi e Modalità: MACSPlex_Standard, applicando una miscelazione delicata secondo necessità.
   4. I campioni sconosciuti sono assegnati in modo simile, con le loro posizioni definite, raggruppamento opzionale e selezione di Modalità Espresso, Tipo: Analisi e Modalità: MACSPlex_Sample nella scheda Impostazioni , inclusi ID e descrizioni opzionali per i campioni.
   5. Verifica che le definizioni dei rack siano corrette nella tabella degli esperimenti , verifica i livelli corretti di liquido nei pozzi delle piastre di filtraggio e poi inizia la misurazione.

Risultati

Identificazione di popolazioni rappresentative di perle di cattura che codificano per 12 analiti solubili

Le popolazioni di perle di cattura sono state identificate utilizzando i canali FITC e PE del citometro a flusso. Nel grafico biaxiale sono stati chiaramente risolti cluster di perle distinte che rappresentano singoli analitis, inclusi IL-10, Granzyme B, MCP-1, IL-17A, Perforin, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 e GM-CSF (Figura 2). Ogni popolazione ha mostrato una firma di fluorescenza unica, confermando il successo della rilevazione multiplex e la chiara differenziazione delle citochine e delle molecole effettrici misurate.

Figura 2: Rilevamento di popolazioni rappresentative di perle di cattura multiplex. Le sfere di cattura contengono intensità di fluorescenza intrinseche che possono essere utilizzate per distinguere le diverse popolazioni specifiche degli analiti. Il diagramma a scatter mostra la separazione dei segnali specifici dell'analita in base all'intensità di fluorescenza nei canali FITC (B1) e PE (B2). L'immagine mostra un profilo rappresentativo delle 12 popolazioni di perle di cattura che codificano per GM-CSF, Granzyme B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforin e TNF-α. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Profilo rappresentativo della concentrazione di citochine delle cellule CAR T dopo la co-coltura con cellule tumorali

Dopo la co-coltura di cellule CAR T con cellule tumorali bersaglio, le concentrazioni di citochine sono state quantificate utilizzando il pannello di citotossicità umana del test multiplex (Figura 3). Le cellule CAR T hanno secreto alti livelli di Granzyme B (49.950,2 pg/mL), IFN-γ (48.367,8 pg/mL), TNF-α (7.055,2 pg/mL) e GM-CSF (6.653,5 pg/mL), indicando una potente attivazione e una funzione degli effettori citotossici in risposta all'ingaggio del tumore. I livelli di IL-2 hanno superato il limite superiore di rilevamento (>10.000 pg/mL), coerente con una forte segnalazione proliferativa. Il campione non è stato ulteriormente diluito né rimisurato. Al contrario, le citochine associate a risposte regolatorie o alternative delle cellule T helper, tra cui IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 e MCP-1, erano presenti a livelli bassi o quasi non rilevabili. Questi risultati suggeriscono che le cellule T CAR presentassero una risposta immunitaria prevalentemente di tipo 1 (Th1/citotossica) caratterizzata da un'elevata attività degli effettori e una produzione limitata di citochine immunosoppressive.

Figura 3: Profilo rappresentativo delle citochine delle cellule CAR T dopo la co-coltura con le cellule tumorali. Le cellule T del Recettore dell'Antigene Chimerico (CAR) ingegnerizzate sono state co-coltivate durante la notte con le cellule tumorali JeKo-1. I soprantativi delle colture cellulari venivano prelevati dopo 16 ore di incubazione e centrifugati per rimuovere i particellati. I campioni diluiti sono stati analizzati utilizzando il pannello di citotossicità umana del saggio multiplex. Sono state eseguite due curve standard e sono state determinate le concentrazioni di tutti i 12 analites. Viene mostrato un dato rappresentativo per l'analisi e il calcolo delle concentrazioni specifiche dell'analita utilizzando la modalità Express del citometro a flusso. Il grafico a barre e la tabella allegata mostrano i livelli calcolati (picogrammo/millilitro) delle 12 molecole effettrice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Cinetica della secrezione delle citochine delle cellule CAR T su stimolazione specifica per antigene

Dopo la co-coltura di cellule CAR T con cellule bersaglio che esprimono (Antigene⁺) o mancano (Antigene⁻) dell'antigene affine, la secrezione di citochine è stata monitorata nel tempo utilizzando il pannello di citotossicità umana del multisaggio. Le cellule CAR T hanno mostrato un rilascio rapido e robusto di citochine al riconoscimento dei bersagli Antigen⁺, con una forte regolazione all'alto di Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF e IL-2 entro 8–24 ore, raggiungendo i livelli massimi entro 48 ore (Figura 4). Questo schema indica una potente attivazione e una funzione degli effettori citotossici dopo l'ingaggio dell'antigene. Sono stati osservati anche aumenti moderati di IL-6, IL-17A e IL-21, mentre IL-4, IL-10, MCP-1 e Perforin sono rimasti bassi o moderatamente elevati. Al contrario, le co-colture con bersagli Antigen⁻ hanno mostrato un'induzione minima di citochine in tutti gli analiti (Figura 4). Insieme, questi dati dimostrano che l'attivazione delle cellule T CAR e la produzione di citochine effettrici avvengono specificamente in risposta al riconoscimento degli antigeni e si intensificano nel tempo.

Figura 4: Cinetica della secrezione delle molecole effettrici delle cellule T CAR co-colte con cellule bersaglio antigeni-positive o antigeni-negative. Le cellule T del Recettore Chimerico Antigene (CAR) ingegnerizzate sono state co-colte con cellule bersaglio che esprimevano (Antigene⁺) o mancavano (Antigene⁻) dell'antigene affine CAR T per 4, 8, 16, 24 e 48 ore. In ogni momento, i supernatanti delle colture sono stati raccolti e analizzati utilizzando il pannello di citotossicità umana del test multiplex per quantificare nel tempo un ampio panel di analiti efettori solubili. Vengono mostrate le cinetiche delle citochine per 12 analiti (picogrammo/millilitro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il saggio multiplex è stato utilizzato per profilare risposte mediatrici immunitarie solubili nelle cocolture di cellule T CAR. Le cellule CAR T co-colte con cellule bersaglio antigeni-positive hanno mostrato un aumento della secrezione di IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzyme B e IL-2, coerente con attivazione degli effettori e funzione ^{citotossica 4,5,8}. Al contrario, i controlli antigeni negativi hanno mostrato una bassa produzione di citochine, dimostrando la capacità del saggio di discriminare risposte specifiche dell'antigene nelle condizioni testate ^5,8. Questi risultati supportano l'applicabilità del saggio per la valutazione della funzionalità delle cellule CAR T, incluso l'uso in analisi relative alla potenza, profilazione associata alla sicurezza e indagini meccanicistiche.

Sebbene il pannello fisso a 12 analiti offra una panoramica ampia dell'attività immunitaria CAR T, potrebbe non essere pratico cogliere l'intera gamma di analiti in tutte le applicazioni. Per flussi di lavoro focalizzati come la validazione dei sami o il controllo qualità (QC) dei prodotti a cellule CAR T, il pannello può essere ridimensionato a un sottoinsieme ridotto (ad esempio IL-2, IFN-γ e TNF-α) per semplificare l'analisi mantenendo la sensibilità^{funzionale 1,2}.

I passaggi critici del protocollo includono la progettazione della co-coltura delle cellule CAR T e la selezione appropriata delle condizioni di campionamento. In particolare, la durata della co-coltura e il numero di cellule effettori (rapporto E:T) determinano direttamente la magnitudine delle citochine e dovrebbero essere definiti durante la configurazione del test ^5,6. Inoltre, la diluizione del campione dovrebbe essere regolata per garantire che le concentrazioni di analiti rientrino nell'intervallo^{dinamico 1,2} del saggio. La risoluzione dei problemi dovrebbe quindi concentrarsi sulla verifica delle prestazioni della curva standard e sull'adeguamento delle condizioni di co-cultura o dei fattori di diluizione se i segnali si ritrovano fuori dall'intervallo^{quantificabile 1,2}.

Rispetto alle tradizionali ELISA single-plex, la piattaforma multiplex basata su citometria a flusso genera dataset multi-analitici ad alta densità a partire da volumi di campione minimi. Consentendo la misurazione simultanea di più analiti all'interno di un singolo campione, il multiplexing può ridurre il consumo complessivo di reagenti, aumentare la capacità del campione e ridurre i tempi di analisi rispetto all'esecuzione di più saggi a plex^{singolo 1,2}. Le opzioni di acquisizione automatizzate e analisi standardizzate possono potenzialmente ridurre la variabilità dipendente dall'utente e supportare riproducibilità e scalabilità in contesti sperimentali o^{produttivi 5,8}. La sensibilità standard di rilevamento ELISA varia tipicamente da 16 a 2000 pg/mL (può essere inferiore per kit ad alta sensibilità⁾⁷. All'interno della piattaforma presentata in questo studio, le concentrazioni rilevabili più basse variano da 0,05 pg/mL per gli analiti più sensibili a circa 93,8 pg/mL per coloro con sensibilità intrinsecamente inferiore al saggio. Nelle valutazioni interne, oltre il 74% degli analiti misurati ha mostrato limiti di rilevamento inferiori a 5 pg/mL, e il 38% è stato rilevabile sotto 1 pg/mL, sottolineando la sensibilità complessiva del sistema. Poiché la sensibilità al multiplex può variare a seconda delle citochine, la potenziale competizione degli epitopi rimane una considerazione importante. Per minimizzare tali interferenze, il saggio impiega epitopi non sovrapposti per la cattura e la rilevazione di ciascun analite, riducendo così il bias legato alla competizione e migliorando l'affidabilità delle misurazioni in condizioni multiplexate.

Le prestazioni del test multiplex possono variare tra gli analiti a seconda della sensibilità al test e del contesto biologico e, in determinate condizioni, le concentrazioni degli analiti possono avvicinarsi al limite superiore di rilevamento e dovrebbero quindi essere valutate durante la preparazione del saggio. Al contrario, alcuni analiti (ad esempio, MCP-1 e IL-4 in questo studio) possono rimanere non rilevabili a seconda delle condizioni sperimentali. Inoltre, fattori pre-analitici come la gestione del campione possono influenzare le misurazioni delle citochine, e dovrebbero essere mantenute condizioni di elaborazione coerenti per garantire la comparabilità.

Nel complesso, questo approccio multiplex consente una caratterizzazione efficiente e quantitativa della funzionalità delle cellule CAR T. Rispetto alla maggior parte delle piattaforme esistenti di rilevamento delle citochine multiplex, il saggio è compatibile con i citometri a flusso standard e include uno strumento software associato allo strumento che facilita l'acquisizione e l'analisi dei dati semplificate. Sebbene la rilevazione multiplex delle citochine sia stata utilizzata in altri contesti immunitari, il presente lavoro ne dimostra l'applicazione al profiling funzionale delle cellule CAR T all'interno di un flusso di lavoro standardizzato. Il formato basato su perle consente il rilevamento simultaneo di più aliti, supportando una maggiore capacità rispetto ai metodi single-plex. Le potenziali applicazioni includono la valutazione funzionale del prodotto farmaceutico, come la valutazione del legante CAR, l'ottimizzazione dei vettori e lo sviluppo di processi. La scalabilità e le capacità di analisi automatizzata dell'assay supportano anche test di potenza, profilazione di sicurezza e studi meccanicistici volti a comprendere il comportamento e la funzionalità delle cellule^{CAR T 5,7,8}.

Sebbene i profili di secrezione delle citochine forniscano preziose informazioni sull'attivazione delle cellule CAR T e sulla potenza funzionale in vitro, essi non possono replicare pienamente la complessa biologia che determina l'efficacia terapeutica nei pazienti. Fattori come il microambiente tumorale, la densità antigenica, la regolazione immunitaria e la persistenza in vivo influenzano tutti le prestazioni delle cellule CAR T oltre quanto misurabile nei test^{controllati 6,8,10}. Tuttavia, stabilire saggi funzionali robusti e standardizzati come il multiplex cytochine profiling rappresenta un passo importante verso la caratterizzazione funzionale del prodotto^{farmaceutico 3,4}. I pattern delle citochine non sono solo indicanti dell'attività delle cellule CAR T, ma sono anche strettamente associati a fenomeni di tossicità, tra cui la sindrome da rilascio delle citochine (CRS) e la sindrome da neurotossicità associata alle cellule degli effettori immunitari (ICANS^)3,6,7. Attualmente, la variabilità nei metodi di misurazione e nella segnalazione limita la comparabilità tra studi, evidenziando la necessità di una profilazione standardizzata e riproducibile del mediatore ^{immunitario 1,2,3}. Man mano che le tecnologie analitiche e i dataset clinici continuano a progredire, l'obiettivo finale è definire firme predittive di secrezione che riflettano in modo affidabile sia il potenziale terapeutico sia la sicurezza del paziente, colmando il divario tra i saggi di potenza preclinica e l'efficacia clinica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Assaggio multiplo di citochine basato su perline per citometria a flusso
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Strumento basato sul web per il gating e l'analisi automatizzati dei dati MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Strumento di citometria a flusso per la misurazione dei dati multiplo
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Strumento di citometria a flusso per la misurazione dei dati multiplo
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Software per il gating e l'analisi automatizzati
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Medium per coltura cellulare privo di siero ottimizzato sviluppato per la coltivazione e l'espansione di cellule T umane e murine