Assay multiplo basato su perline per la profilazione funzionale delle cellule T CAR

Summary

Questo articolo introduce un saggio di citometria a flusso basato su bead multiplex per la quantificazione di fino a 12 citochine e molecole effettrici dai surnatanti derivati da cellule CAR-T (recettore antigene chimerico), consentendo un'analisi rapida e riproducibile della funzionalità delle cellule T ingegnerizzate con piccoli volumi di campione.

Abstract

Il profilaggio delle cellule CAR T presenta sfide a causa della loro eterogeneità, delle complesse risposte immunitarie e della disponibilità limitata di campioni. I test multiplex consentono la valutazione funzionale permettendo la rilevazione simultanea di un'ampia gamma di molecole efficaci, inclusi citochine, chemiochine e mediatori citotossici. Qui, descriviamo un test multiplex basato su sfere compatibile con la citometria a flusso per l'analisi della secrezione di molecole efficaci da parte delle cellule T chimeriche con recettore antigenico (CAR) umane. I surnatanti delle cellule CAR T vengono incubati con una miscela di sfere di cattura comprendente più popolazioni codificate in fluorescenza accoppiate ad anticorpi specifici per l'analita. Queste sfere legano i bersagli solubili nel campione, formando complessi sfera-analita che vengono successivamente rilevati utilizzando anticorpi di rilevamento marcati. Il test include un pannello di mediatori immunitari come interferone (IFN)-α, interleuchina (IL)-2, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, IL-6, IL-10, fattore di stimolazione delle colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e Granzima B. L'uso di standard predefiniti consente la misurazione quantitativa di molteplici analiti da un singolo campione. L'acquisizione e l'analisi dei dati possono essere eseguite utilizzando approcci di gating automatizzati forniti da strumenti software associati allo strumento o basati sul web, facilitando l'elaborazione dei dati. In conclusione, il test multiplex presentato consente l'analisi multiparametrica della funzionalità delle cellule CAR T e può essere applicato in contesti come la ricerca, i test di controllo qualità, gli studi meccanici e la caratterizzazione funzionale.

Introduction

La caratterizzazione funzionale è essenziale nei test delle cellule T con recettore immunitario chimerico (CAR) poiché fornisce informazioni sulla potenza, la sicurezza e i meccanismi d'azione di queste terapie. Comprendere le firme di citochine e mediatori citotossici aiuta a valutare l'efficacia terapeutica e i potenziali effetti avversi, garantendo lo sviluppo di trattamenti sicuri ed efficaci. I tradizionali saggi single-plex come gli enzimi-linked immunosorbent assay (ELISA) hanno dei limiti, come la necessità di volumi elevati di campione, tempi di elaborazione lunghi e corse separate per ogni analito, offrendo al contempo un intervallo dinamico limitato all'interno dei singoli campioni^1,2. Al contrario, i saggi multiplex basati su perline consentono la rilevazione simultanea di molteplici mediatori solubili, riducendo i tempi di elaborazione e i requisiti di campione aumentando al contempo l'intervallo dinamico^1,2. Questa efficienza e profondità di analisi rendono i saggi multiplex strumenti preziosi per far progredire la ricerca e lo sviluppo delle cellule T CAR^3,4,5.

Il saggio multiplex presentato in questo studio utilizza perline di cattura, che mostrano profili di fluorescenza definiti nei canali fluoresceina isotiocianato (FITC) e ficcoeritrina (PE) e sono rivestite con anticorpi specifici contro analiti solubili. Durante l'incubazione con un campione, queste perline legano selettivamente i loro analiti target dalla soluzione. Dopo la cattura degli analiti, vengono aggiunti anticorpi di rilevamento per formare complessi sandwich specifici per l'analito. Questi anticorpi sono direttamente coniugati all'allocianacina (APC) (rilevamento diretto) o alla biotina (rilevamento indiretto). Per il rilevamento indiretto, è necessaria una successiva incubazione con un anticorpo anti-biotina coniugato APC (Figura 1). I complessi risultanti – composti da perline di cattura, analiti e anticorpi di rilevamento – vengono analizzati mediante citometria a flusso per quantificare le concentrazioni degli analiti. Il saggio multiplex è una tecnologia basata su piastre, inclusa una serie di standard predefiniti utilizzati per generare curve standard specifiche per l'analito^1,2.

Figura 1: Principio della tecnologia delle citochine e flusso di lavoro del saggio. Il saggio si basa su 12 popolazioni di perline di cattura codificate per fluorescenza accoppiate ad anticorpi specifici per l'analito. Dopo l'incubazione del campione, si formano complessi perlina-analito che possono essere rilevati mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi di rilevamento specifici. Il flusso di lavoro del saggio include 1) la preparazione degli standard degli analiti e dei campioni di interesse su una piastra filtro, 2) l'incubazione con le perline di cattura, 3) l'incubazione con anticorpi anti-analito biotinilati per formare complessi sandwich, 4) l'incubazione con anticorpi anti-biotina etichettati APC, 5) la sospensione in buffer per la misurazione e 6) l'acquisizione del campione. Fai clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il saggio multiplex descritto in questo studio è compatibile con citometri a flusso standard dotati di un laser blu (ad esempio, 488 nm; canali FITC e PE) e un laser rosso (ad esempio, 635 nm; canale APC). Poiché i citometri a flusso sono ampiamente disponibili nei laboratori di ricerca, ambienti clinici e contesti di controllo qualità, questa compatibilità facilita l'implementazione senza richiedere strumentazione specializzata aggiuntiva⁵. Nel contesto dei test di funzionalità delle cellule T CAR, questo approccio consente una valutazione multiparametrica delle risposte funzionali all'interno dei flussi di lavoro analitici comunemente disponibili⁶. Il saggio offre vantaggi significativi per la ricerca sulle cellule T CAR consentendo la quantificazione simultanea di analiti chiave, tra cui GM-CSF, Granzima B, interferone (IFN)-γ, interleuchina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, proteina chemoattrattica monocitica-1 (MCP-1), Perforina e fattore necrosi tumorale (TNF)-α (pannello di citotossicità umana). Questi mediatori sono fondamentali per comprendere l'attivazione delle cellule T CAR, la funzione efectore e il rilascio di citochine legate alla sicurezza^4,5,7,8.

Il flusso di lavoro del saggio include opzioni per il gating automatizzato e l'analisi dei dati utilizzando software associati allo strumento e strumenti di analisi basati sul web indipendenti dallo strumento⁵. Queste funzionalità supportano l'elaborazione semplificata dei dati di profilazione delle molecole efectore delle cellule T CAR riducendo l'entità dell'intervento manuale. L'uso dell'analisi automatizzata può contribuire a migliorare la coerenza nella gestione dei dati e facilitare una valutazione più efficiente dei risultati funzionali⁸.

Il presente protocollo delinea un metodo multiplex riproducibile e scalabile per il profilaggio dei mediatori immunitari delle cellule T CAR. Misurando 12 analiti diversi in un singolo campione, l'approccio è particolarmente rilevante per indagini meccanicistiche, ricerche in fase iniziale e studi concomitanti. Nelle fasi successive della terapia con cellule T CAR, può essere vantaggioso ridurre il numero di citochine misurate, in particolare in un ambiente di controllo qualità (QC) regolamentato e sensibile al tempo per i test di rilascio dei farmaci. A questo scopo, 1-7 citochine dal pannello presentato possono essere assemblate per progettare un saggio citochinico personalizzato che può essere convalidato per l'analisi delle cellule T ingegnerizzate. Ciò rende il protocollo descritto idealmente adatto per diverse applicazioni sia in ambito di ricerca che di controllo qualità sia nelle prime che nelle ultime fasi della terapia con cellule T CAR^3,4,5,9.

Protocol

Tutti i campioni umani sono stati raccolti da volontari anonimi sani dopo aver ottenuto il consenso informato scritto. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ärztekammer Nordrhein (#2020272) e eseguite in conformità con le necessarie normative etiche e di biosicurezza.

1. Co-coltura di cellule CAR T

1. Preparare una coltura cellulare di cellule CAR T ingegnerizzate in assenza e in presenza di antigene cognitivo, ad esempio, cellule tumorali presentanti l'antigene in un rapporto di 2,5:1 (cellule effettrici : cellule bersaglio).
2. Definire uno o più punti temporali per la raccolta del surnatante per analizzare i citochine secreti una volta o la cinetica dei citochine in un intervallo di tempo definito, ad esempio, a 4, 8, 16, 24 e 48 h.
   NOTA: I surnatanti possono essere utilizzati direttamente o possono essere congelati per un uso successivo.

2. Preparazione di standard e campioni

1. Riconstituire lo standard dell'analita aggiungendo 200 μL di buffer o di mezzo di coltura cellulare al pellet e mescolando delicatamente. Preparare sei tubi reagente ed eseguire una serie di diluizioni 1:5 dello standard riconstituido, fino a 3,2 pg/mL o 0,6 pg/mL (a seconda dell'analita), e preparare un vuoto.
2. Raccogliere i surnatanti della co-coltura CAR T, ad esempio, a 16 h o 24 h dopo la co-coltura. Opzionalmente, raccogliere le cellule CAR T per un fenotipizzazione parallela utilizzando la citometria a flusso.
3. Centrifugare i campioni a 10.000 × g per 10 min a 4 °C. Utilizzare i surnatanti puri o diluirli per adattarli alla gamma della curva standard.

3. Flusso di lavoro dell'assay

1. Vorticare il mix di perline di cattura per risospenderlo completamente. Aggiungere 50 μL dello standard o del campione, insieme a 20 μL di perline pre-diluite, nei pozzetti di una piastra filtrante a 96 pozzetti.
2. Incubare per 2 h a temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, al buio. Lavare i pozzetti due volte con 200 μL di buffer utilizzando un manifold a vuoto o una centrifuga.
3. Aggiungere 100 μL di reagente di rilevamento 1 pre-diluito 1:50 (in buffer). Incubare per 1 h a temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, al buio. Lavare due volte.
4. Aggiungere 100 μL di reagente di rilevamento 2 pre-diluito 1:50 (in buffer). Incubare per 30 min a temperatura ambiente, agitando a 450 rpm, al buio. Lavare una volta.
5. Per l'acquisizione, risospendere i campioni in 200 μL di buffer. Una panoramica del flusso di lavoro dell'assay è mostrata in Figura 1.

4. Acquisizione e analisi dei dati

1. Acquistare i dati su un citofluometro dotato di laser blu e rossi (sono richiesti i canali PE, FITC e APC). Quando si lavora con citofluometri MACSQuant, utilizzare i modelli Express Mode per il gating e l'analisi dei dati completamente automatizzati.
2. In alternativa, caricare i file di dati FSC o MQD nello strumento InspectoR basato sul web, che esegue la misurazione quantitativa automatizzata dei citochine e fornisce risultati pronti per l'esportazione indipendentemente dallo strumento utilizzato.
3. Assicurarsi di verificare la corretta separazione delle 12 diverse popolazioni di perline di cattura nel canale FITC rispetto al PE.
4. Applicare la curva standard per calcolare le concentrazioni dei citochine ed esportare e visualizzare i risultati.
5. Per l'acquisizione dei dati su un citofluometro MACSQuant, utilizzare il codice a barre 2D del vialetto delle perline di cattura, che contiene tutte le impostazioni di acquisizione rilevanti.
   1. Dopo aver effettuato l'accesso al software, selezionare il MACSPlex Filter Plate come rack del campione e fare clic sul pulsante Codice a barre sulla barra degli strumenti per attivare il lettore di codici 2D.
   2. Presentare il vialetto al lettore, assicurandosi che il codice sia rivolto verso la luce lampeggiante a una distanza ottimale di 0,5–2,5 cm.
   3. Nella scheda Autolabel, assegnare le Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) e NoLabel. Per le diluizioni seriali dello standard di cellule T/NK citolitiche, definire le posizioni del gruppo e, nella scheda Impostazioni, selezionare Express Mode con Tipo: Analisi e Modalità: MACSPlex_Standard, applicando una miscelazione delicata se necessario.
   4. I campioni sconosciuti sono assegnati in modo simile, con le loro posizioni definite, raggruppamento opzionale e selezione di Express Mode, Tipo: Analisi e Modalità: MACSPlex_Sample nella scheda Impostazioni, inclusi gli ID e le descrizioni dei campioni opzionali.
   5. Verificare che le definizioni del rack siano corrette nella tabella Esperimento, assicurarsi che i livelli di liquido siano corretti nei pozzetti della piastra filtrante e quindi avviare la misurazione.

Results

Identificazione delle popolazioni di perle di cattura rappresentative che codificano per 12 analiti solubili

Le popolazioni di perle di cattura sono state identificate utilizzando i canali FITC e PE del citometro a flusso. Cluster distinti di perle che rappresentano singoli analiti sono stati chiaramente risolti nel grafico biassile, inclusi IL-10, Granzima B, MCP-1, IL-17A, Perforina, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 e GM-CSF (Figura 2). Ogni popolazione ha mostrato una firma di fluorescenza unica, confermando il rilevamento multiplex di successo e una chiara differenziazione dei citochine e delle molecole effettrici misurate.

Figura 2: Rilevamento di rappresentative popolazioni di perle di cattura multiplex. Le perle di cattura contengono intensità di fluorescenza intrinseche che possono essere utilizzate per distinguere le diverse popolazioni specifiche degli analiti. Il grafico a dispersione mostra la separazione dei segnali specifici degli analiti in base all'intensità della fluorescenza nei canali FITC (B1) e PE (B2). L'immagine mostra un profilo rappresentativo delle 12 popolazioni di perle di cattura che codificano per GM-CSF, Granzima B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforina e TNF-α. Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Profilo di concentrazione rappresentativo di citochine delle cellule CAR T dopo la co-coltura con cellule tumorali

Dopo la co-coltura delle cellule CAR T con cellule bersaglio tumorali, le concentrazioni delle citochine sono state quantificate utilizzando il pannello di citotossicità umana del test multiplex (Figura 3). Le cellule CAR T hanno secreto alti livelli di Granzima B (49.950,2 pg/mL), IFN-γ (48.367,8 pg/mL), TNF-α (7.055,2 pg/mL) e GM-CSF (6.653,5 pg/mL), indicando una potente attivazione e funzione effettrice citotossica in risposta all'interazione con il tumore. I livelli di IL-2 hanno superato il limite di rilevamento superiore (>10.000 pg/mL), coerentemente con un forte segnale proliferativo. Il campione non è stato ulteriormente diluito o ri-misurato. Al contrario, le citochine associate alle risposte regolatorie o alle risposte alternative delle cellule T helper, inclusi IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 e MCP-1, erano presenti a livelli bassi o quasi non rilevabili. Questi risultati suggeriscono che le cellule CAR T hanno montato una risposta immunitaria prevalentemente di tipo 1 (Th1/citotossica) caratterizzata da un'alta attività effettrice e una limitata produzione di citochine immunosoppressive.

Figura 3: Profilo rappresentativo delle citochine delle cellule CAR T dopo la co-coltura con cellule tumorali. Le cellule T a Ricettore Antigene Chimerico (CAR) ingegnerizzate sono state co-coltivate durante la notte con cellule tumorali JeKo-1. I surnatanti dei colture cellulari sono stati raccolti dopo 16 ore di incubazione e centrifugati per rimuovere le particelle. I campioni diluiti sono stati analizzati utilizzando il pannello di citotossicità umana del test multiplex. Sono state effettuate due curve standard e sono state determinate le concentrazioni di tutti i 12 analiti. È mostrata un'uscita di dati rappresentativa per l'analisi e il calcolo delle concentrazioni specifiche degli analiti utilizzando la modalità Express del citometro a flusso. Il grafico a barre e la tabella di accompagnamento mostrano i livelli calcolati (picogrammi/millilitro) delle 12 molecole effettrici. Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Kinetica di secrezione delle citochine delle cellule CAR T dopo la stimolazione specifica dell'antigene

Dopo la co-coltura delle cellule CAR T con cellule bersaglio che esprimono (Antigene⁺) o che non esprimono (Antigene⁻) l'antigene cognitivo, la secrezione delle citochine è stata monitorata nel tempo utilizzando il pannello di citotossicità umana del test multiplex. Le cellule CAR T hanno mostrato un rilascio rapido e robusto di citochine al riconoscimento degli obiettivi Antigene⁺, con una forte sovraregolazione di Granzima B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF e IL-2 entro 8-24 h, raggiungendo livelli di picco a 48 h (Figura 4). Questo modello indica una potente attivazione e funzione effettrice citotossica dopo l'interazione con l'antigene. Sono stati osservati anche aumenti moderati di IL-6, IL-17A e IL-21, mentre IL-4, IL-10, MCP-1 e Perforina sono rimasti bassi o modestamente elevati. Al contrario, le co-colture con obiettivi Antigene⁻ hanno mostrato una minima induzione di citochine per tutti gli analiti (Figura 4). Insieme, questi dati dimostrano che l'attivazione delle cellule CAR T e la produzione di citochine effettrici si verificano specificamente in risposta al riconoscimento dell'antigene e si intensificano nel tempo.

Figura 4: Kinetica di secrezione delle molecole effettrici delle cellule CAR T co-coltivate con cellule bersaglio positive o negative per l'antigene​. Le cellule T a Ricettore Antigene Chimerico (CAR) ingegnerizzate sono state co-coltivate con cellule bersaglio che esprimono (Antigene⁺) o che non esprimono (Antigene⁻) l'antigene cognitivo delle cellule T CAR per 4, 8, 16, 24 e 48 h. Ad ogni punto temporale, i surnatanti dei colture sono stati raccolti e analizzati utilizzando il pannello di citotossicità umana del test multiplex per

Discussion

Il saggio multiplex è stato utilizzato per profilare le risposte dei mediatori immuni solubili nelle co-colture di cellule CAR T. Le cellule CAR T co-coltivate con cellule bersaglio positive per l'antigene hanno mostrato un aumento della secrezione di IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzima B e IL-2, coerentemente con l'attivazione degli effectori e la funzione citotossica^4,5,8. Al contrario, i controlli negativi per l'antigene hanno mostrato una bassa produzione di citochine, dimostrando la capacità del saggio di discriminare le risposte antigene-specifiche nelle condizioni testate^5,8. Questi risultati supportano l'applicabilità del saggio per valutare la funzionalità delle cellule CAR T, incluso l'uso in analisi relative alla potenza, profilazione associata alla sicurezza e indagini meccanicistiche.

Mentre il pannello fisso a 12 analiti fornisce una panoramica ampia dell'attività immunitaria delle cellule CAR T, potrebbe non essere pratico catturare l'intera gamma di analiti in tutte le applicazioni. Per flussi di lavoro focalizzati come la validazione del saggio o il controllo di qualità (QC) dei prodotti con cellule CAR T, il pannello può essere ridotto a un sottogruppo (ad es. IL-2, IFN-γ e TNF-α) per semplificare l'analisi mantenendo la sensibilità funzionale^1,2.

I passaggi critici nel protocollo includono la progettazione della co-coltura delle cellule CAR T e la selezione appropriata delle condizioni di campionamento. In particolare, la durata della co-coltura e il numero di cellule effectori (rapporto E:T) determinano direttamente la magnitudine delle citochine e dovrebbero essere definiti durante la configurazione del saggio^5,6. Inoltre, la diluizione del campione dovrebbe essere regolata per garantire che le concentrazioni degli analiti cadano entro l'intervallo dinamico del saggio^1,2. La risoluzione dei problemi dovrebbe quindi concentrarsi sulla verifica delle prestazioni della curva standard e sull'adeguamento delle condizioni di co-coltura o dei fattori di diluizione se i segnali cadono al di fuori dell'intervallo quantificabile^1,2.

Rispetto agli ELISA singoli tradizionali, la piattaforma multiplex basata sulla citometria a flusso genera set di dati ad alta densità e multi-analito da volumi di campione minimi. Consentendo la misurazione simultanea di più analiti all'interno di un singolo campione, il multiplexing può ridurre il consumo complessivo di reagenti, aumentare la produttività del campione e ridurre il tempo del saggio rispetto all'esecuzione di molteplici saggi singoli^1,2. Le opzioni di acquisizione automatizzata e analisi standardizzate possono potenzialmente ridurre la variabilità dipendente dall'utente e supportare la riproducibilità e la scalabilità in contesti sperimentali o di produzione^5,8. La sensibilità di rilevamento ELISA standard tipicamente varia da 16 a 2000 pg/mL (può essere inferiore per i kit ad alta sensibilità)⁷. All'interno della piattaforma presentata in questo studio, le concentrazioni più basse rilevabili vanno da 0,05 pg/mL per gli analiti più sensibili a circa 93,8 pg/mL per quelli con una sensibilità di saggio intrinsecamente inferiore. Nelle valutazioni interne, più del 74% degli analiti misurati ha mostrato limiti di rilevamento inferiori a 5 pg/mL e il 38% era rilevabile al di sotto di 1 pg/mL, sottolineando la sensibilità complessiva del sistema. Poiché la sensibilità multiplex può variare per citochina, la potenziale competizione degli epitopi rimane una considerazione importante. Per minimizzare tale interferenza, il saggio impiega epitopi non sovrapposti per il catturamento e il rilevamento di ciascun analito, riducendo così il pregiudizio legato alla competizione e migliorando l'affidabilità della misurazione in condizioni multiplex.

Le prestazioni del saggio multiplex possono variare tra gli analiti a seconda della sensibilità del saggio e del contesto biologico e, in determinate condizioni, le concentrazioni degli analiti possono avvicinarsi al limite superiore di rilevamento e dovrebbero quindi essere valutate durante la configurazione del saggio. Al contrario, alcuni analiti (ad es. MCP-1 e IL-4 in questo studio) potrebbero rimanere non rilevabili a seconda delle condizioni sperimentali. Inoltre, fattori pre-analitici come la manipolazione del campione possono influenzare le misurazioni delle citochine e dovrebbero essere mantenute condizioni di elaborazione coerenti per garantire la comparabilità.

Nel complesso, questo approccio multiplex consente una caratterizzazione efficiente e quantitativa della funzionalità delle cellule CAR T. Rispetto alla maggior parte delle piattaforme di rilevamento dei citochini multiplex esistenti, il saggio è compatibile con i citometri a flusso standard e include uno strumento software associato allo strumento che facilita l'acquisizione e l'analisi dei dati. Mentre il rilevamento multiplex dei citochini è stato utilizzato in altri contesti immunitari, il presente lavoro dimostra la sua applicazione al profilaggio funzionale delle cellule CAR T all'interno di un flusso di lavoro standardizzato. Il formato basato su bead consente il rilevamento simultaneo di più analiti, supportando una produttività superiore rispetto ai metodi singoli. Le potenziali applicazioni includono la valutazione funzionale del prodotto farmaco, come la valutazione del legante CAR, l'ottimizzazione del vettore e lo sviluppo del processo. La scalabilità del saggio e le capacità di analisi automatizzate supportano anche i test di potenza, la profilazione della sicurezza e gli studi meccanicistici volti a comprendere il comportamento e la funzionalità delle cellule CAR T^5,7,8.

Sebbene i profili di secrezione dei citochini forniscano preziose informazioni sull'attivazione delle cellule CAR T e sulla potenza funzionale in vitro, non possono replicare completamente la biologia complessa che determina l'efficacia terapeutica nei pazienti. Fattori come l'ambiente tumorale, la densità dell'antigene, la regolazione immunitaria e la persistenza in vivo influenzano le prestazioni delle cellule CAR T oltre ciò che può essere misurato in saggi controllati^6,8,10. Ciononostante, stabilire saggi funzionali robusti e standardizzati come il profilaggio multiplex dei citochini rappresenta un passo importante verso la caratterizzazione funzionale del prodotto farmaco^3,4. I modelli di citochina non sono solo indicativi dell'attività delle cellule CAR T, ma sono anche strettamente associati a fenomeni di tossicità, tra cui la sindrome da rilascio di citochine (CRS) e la neurotossicità associata alle cellule immunitarie effectori (ICANS)^3,6,7. Att

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Test multiplex basato su microsfere per citometria a flusso
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Strumento basato sul web per il gating automatico e l'analisi dei dati MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Strumento di citometria a flusso per la misurazione di dati multiplex
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Strumento di citometria a flusso per la misurazione di dati multiplex
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Software per il gating automatico e l'analisi
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Mezzo di coltura cellulare privo di siero ottimizzato sviluppato per la coltivazione e l'espansione di cellule T umane e di topo