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Articolo metodologico

Analisi morfometriche della forma: il software di analisi per la quantificazione della forma craniofacciale nel pesce zebra

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DOI:

10.3791/70345

⸱

27 febbraio 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville, 2Department of Pediatrics, Section of Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare la forma della cartilagine craniofacciale utilizzando software liberi (tpsDigs2, MorphoJ e PAST) per misurare i cambiamenti nella struttura facciale nelle larve di pesce zebra.

Abstract

I disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD) sono caratterizzati da un vario insieme di disabilità fisiche, cognitive e comportamentali causate dall'esposizione prenatale all'etanolo, inclusi quelli che interessano lo scheletro facciale. I loci genetici sensibili all'etanolo contribuiscono a questo alto grado di variazione della FASD, che complica le analisi della forma del viso. Abbiamo già dimostrato di poter analizzare questi cambiamenti nella forma del viso derivanti dalle interazioni gene-etanolo nei pesci zebra. I pesci zebra sono un modello ideale per analizzare questa variazione per diversi motivi; (i) il 70% dei geni sono orologi tra umani e pesci zebra; (ii) la fecondazione esterna consente ai ricercatori di controllare il momento e il dosaggio dei trattamenti con etanolo; (iii) la struttura dello scheletrico facciale è conservata con i vertebrati; (iv) le larve traslucide permettono la visione diretta dei cambiamenti nella struttura scheletrica craniofacciale durante lo sviluppo. Tuttavia, analizzare la forma dello scheletro craniofacciale può essere difficile da valutare completamente con semplici misure lineari, poiché queste non catturano i cambiamenti complessivi di forma. Inoltre, i cambiamenti nella dimensione della testa possono complicare l'interpretazione dei dati. Per affrontare questo problema, abbiamo adottato un approccio morfometrico, analizzando la forma complessiva del volto attraverso analisi dei componenti principali tramite software freeware, tpsDigs2, MorphoJ e PAST. La combinazione di questo software permette il confronto a coppie della morfologia facciale complessiva. Qui, illustriamo il nostro approccio e l'analisi della forma del volto nei mutanti zebra trattati con etanolo, utilizzando questi programmi per condurre una serie di analisi statistiche multivariate complementari.

Introduzione

I Disturbi dello Spettro Alcolico Fetale (FASD) sono caratterizzati da un'ampia gamma di difetti dello sviluppo, tra cui comportamentali, neurologici efisici 1,2. Tra questi difetti fisici sono inclusi difetti craniofacciali, come l'ipoplasiamascellare 3,4,5,6. Sebbene il momento e il dosaggio dell'esposizione all'etanolo contribuiscano alla complessa eziologia del FASD, il contributo genetico gioca un ruolo significativo nell'eziologiadel FASD 6,7,8,9,10,11,12. Questa combinazione di fattori rende difficile studiare i difetti facciali nelle coorti umane. Per studiare l'impatto dell'esposizione prenatale all'etanolo sullo sviluppo, utilizziamo il modello del pesce zebra. I pesci zebra rappresentano un forte modello per la FASD, poiché condividono il 70% degli ortologhi genici con gli umani, l'82% dei geni noti che causanomalattie 13,14,15,16. Oltre alla conservazione genetica, i pesci zebra: (i) hanno un'elevata fecondite, permettendo la produzione di diverse larve contemporaneamente, (ii) subiscono fecondazione esterna, che consente lo studio diretto dei processi di sviluppo sensibili all'etanolo, (iii) hanno uno sviluppo craniofacciale vertebrato altamente conservato e stereotipato, e (iv) sono embrioni/larve traslucide che permettono la visualizzazione delle strutturescheletriche 17. Abbiamo già dimostrato che mutazioni in molti diversi geni del pesce zebra sensibilizzano gli embrioni ai difetti facciali indotti dall'etanolo, e questi difetti possono essere sottili e difficili da identificare a occhiostretto 10,18. Inoltre, abbiamo osservato che le larve di tipo selvatico trattate con etanolo presentano anche lievi cambiamenti nella regione craniofacciale rispetto alle larve di tipo selvatico non trattate, anche se anche queste variazioni sono difficili da identificare aocchio stretto 10. Sebbene questi cambiamenti passino inosservati dall'osservazione visiva, siamo riusciti a mostrare questi cambiamenti nella forma del viso indotti dall'etanolo utilizzando analisi morfometriche disponibili sulle immagini 2D del viscerocranio10.

La faccia è una struttura 3D complessa che è difficile da misurare utilizzando misurazioni lineari convenzionali. Queste singole misure lineari non tengono conto della posizione relativa di ciascuna struttura misurata e del loro impatto sulle altre strutture misurate della faccia. Le analisi morfometriche affrontano queste carenze utilizzando configurazioni di forma tramite punti di riferimento che tengono conto della posizione relativa di tutte le strutture misurate, controllando anche le differenze complessive didimensione 18, 19, 20. Questo approccio produce dati più accurati, con maggiore risoluzione e molto più facili da visualizzare, il che può produrre risultati che potrebbero non essere osservati con misurazioni lineariconvenzionali 18,19,20. Inoltre, gli approcci morfometrici possono effettuare confronti diretti tra e all'interno dei gruppi utilizzando metodi statistici multivariati. Qui descriviamo l'uso del software morfometrico freeware tpsUtil, tpsDigs221, MorphoJ20 e Paleontological Statistics (PAST)22, in combinazione con immagini 2D del viscerocranio in un tipo selvatico e larvale non trattato e trattato con etanolo eterozigote per il gene della Proteina Morfogenetica Ossea (Bmp) bmp7a. Sebbene questi programmi siano stati utilizzati principalmente in campi focalizzati sulla paleontologia e sull'ecologia, quando combinati forniscono un'analisi approfondita della forma del volto. In definitiva, in questo protocollo, mostriamo come utilizzare queste applicazioni software liberamente disponibili per quantificare i cambiamenti di forma della cartilagine craniofacciale nel modello zebra.

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Protocollo

Tutte le larve di pesce zebra utilizzate in questa procedura sono state allevate e riprodotte seguendo i protocolli IACUC consolidati approvati dall'Università diLouisville 23.

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati il ceppo di pesci zebra bmp7aty68a24 e i fratelli di tipo selvatico (tutti sullo sfondo AB), con pesci adulti mantenuti a 28,5 °C con un ciclo chiaro/buio di 14/10 ore. Utilizzare le linee appropriate in base ai risultati sperimentali desiderati. Usa acqua sterilizzata tramite osmosi inversa. Il sesso come variabile biologica non si applica alle fasi di sviluppo studiate, poiché il sesso è rilevabile per la prima volta nei pesci zebra intorno a 20-25 giorni dalla fecondazione (dpf)25, dopo tutte le analisi.

1. Trattamento con etanolo

  1. Raccogliere uova da incroci eterozigoti e stadiare gli embrioni morfologicamente comedescritto 23.
  2. Ordinare gli embrioni in gruppi campioni da 100 e allevare a 28,5 °C secondo i punti di sviluppo desiderati. Incubare tutti i gruppi nei mezzi embrionali (EM)10,18.
  3. A 6 ore dalla feconditazione (hpf), cambia EM con EM fresco o EM contenente etanolo (v/v) all'1%. A 24 hpf, lavare EM contenente etanolo con tre cambi freschi diEM 10,18.

2. Colorazioni facciali e imaging

  1. Fissare le larve di pesce zebra a 5 dpf e colorare con Alcian Blue, marcando la cartilagine (Figura 1) come descrittoin precedenza 26.
  2. Prendiamo immagini dell'intera montatura, vista ventrale, campo chiaro del viscerocranio, montando le larve come descrittoin precedenza 27.
  3. In breve, monta i pesci, superficie ventrale verso l'alto, nella soluzione al 50% di glicerolo dalla fine della colorazione Alcian Blue.
    NOTA: Le impostazioni sui microscopi composti possono variare; Usa impostazioni adatte alle strutture dell'immagine desiderate. In questo studio è stato utilizzato un microscopio composto Olympus BX53 per generare tutte le immagini analizzate. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 10x.

3. Genotipizzazione

  1. Rimuovere le code da 5 larve di dpf dopo la colorazione della cartilagine Alcian Blue come descrittoin precedenza 18.
  2. Separare teste e code delle larve. Tieni le teste al 50% di glicerolo per le immagini successive.
  3. Fai la coda di lisi con 5 μL di proteinasi K (10 mg/mL) per estrarre il gDNA.
  4. Esegui la PCR sul gDNA di ogni campione utilizzando primer che mirano al gene di interesse per amplificare le regioni contenenti l'SNP.
  5. Digerire il prodotto PCR utilizzando la digestione del DNA basata su endonucleasi di restrizione per differenziare alleli mutanti da quelli selvatici basandosi sull'SNP e identificare l'SNP. Dividere i campioni per genotipo in gruppi aggregati e immagini per l'analisi.
    NOTA: Per questo lavoro, l'SNP è stato amplificato in bmp7a e genotipizzato usando BslI (NEB).

4. Software utilizzato per analisi di forma

  1. Utilizzare tpsUtil e tpsDig221, e MorphoJ20 (https://sbmorphometrics.org) per l'analisi morfometrica delle larve colorate da alci, e il software di analisi MorphoJ e Paleontological Statistics Package for Education and Data Analysis (https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/) () per tutte le analisi statistiche.
    NOTA: Il software tpsUtil si trova sotto il link "Utility programs", il software tpsDig2 si trova sotto il link "data acquisition" e MorphoJ sotto il link "Comprehensive programs" su https://sbmorphometrics.org. La risoluzione dei problemi per ogni software è facilmente disponibile sia online, su più piattaforme che all'interno del software. L'Analisi a Componente Principale (PCA), l'Analisi Canonica delle Variazioni (CVA), l'ANOVA di Procrustes e i grafici wireframe della variazione facciale sono stati generati utilizzando MorphoJ, mentre un test multivariato di normalità e un'analisi multivariata della varianza (MANOVA) sono stati eseguiti utilizzando PAST.

5. Visualizzare coerentemente lo scheletro facciale per tutti i campioni da analizzare

  1. Assicurati che le immagini dello scheletro facciale siano scattate con impostazioni identiche al microscopio e salvate come file .tif.
    NOTA: Le impostazioni del microscopio variano a seconda della configurazione e della funzionalità del microscopio e dei campioni/tessuti da fotografare. La chiave è un allestimento costante del microscopio e la preparazione del campione.
  2. Salva i file in una singola cartella etichettata per identificare completamente l'esperimento.

6. Preparazione delle immagini con il software tps

  1. Apri Notepad e seleziona Salva come. Da qui, clicca su tutti i file in fondo. Salva il file come "experiment-name.tps" e salvalo nella cartella contenente tutte le immagini da analizzare.

7. Inserimento di immagini nel software tps

  1. Apri il software tpsUtil. Poi, tira verso il basso Operazione e seleziona il file Build tps dalla scheda immagini .
  2. Da questa scheda, clicca su input e apri il file contenente le immagini. Clicca sulla prima immagine nel file e seleziona Apri.
  3. Seleziona la scheda di output , seguita dal file del blocco note tps, e salva. Quando ti viene chiesto di sostituire il file, seleziona sì.
  4. Poi, clicca sulla scheda di configurazione e crea. Vai al file per vedere se le immagini sono state aggiunte.

8. Aggiunta di punti di riferimento alle immagini

  1. Apri tpsDigs2 e apri le seguenti schede in ordine: sorgente di input, file, poi il file salvo di tps Notepad.
  2. Successivamente, clicca sulle opzioni per visualizzare l'opzione Strumenti Immagine . Qui, assicurati di impostare la lunghezza di riferimento a 100 μm. Premi imposta scala.
    NOTA: Non scalare rispetto alla scala sull'immagine.
  3. Quando imposti la scala, premi ok per impostare i parametri, poi esci dagli strumenti di immagine.
  4. A questo punto, aggiungi punti di riferimento a ogni immagine da analizzare per una corretta analisi morfologica cliccando sul simbolo di mira.
  5. Assicurati che i punti di riferimento siano posizionati nello stesso ordine per ogni immagine. Sono stati posti punti di riferimento sulle seguenti giunture tra gli elementi cartilaginei (vedi Figura 1E, E'):
    1. Articolazione mediana tra le cartilagini di Meckel (Punto di riferimento #1, Figura 1E, E').
    2. Le articolazioni bilaterali tra le cartilagini di Meckel e le cartilagini palatoquadrate (Punti di riferimento #2, Figura 1E, E').
    3. Articolazione mediana tra le cartilagini ceratoiale (Punto di riferimento #3, Figura 1E, E').
    4. Le articolazioni bilaterali tra le cartilagini palatoquadrate e ceratoiale (Punti di riferimento #4, Figura 1E, E').
    5. L'estremità distale delle cartilagini iomandibolari (Punti di riferimento #5, Figura 1E, E').
  6. Dopo aver posizionato i punti di riferimento su un'immagine, clicca su file per il menu a tendina. Segui questo percorso per salvare i dati e poi sovrascrivere.
  7. Esci da tpsDigs2.

9. Utilizzo di MorphoJ per analizzare la forma tramite Procrustes ANOVA

  1. Apri il software MorphoJ.
  2. Sotto le preliminari, crea e dà un nome al dataset. Seleziona crea nuovo dataset e nomina il dataset. Poi, clicca su tps e seleziona il blocco note con i nuovi dati aggiunti dal passo 8.4. Crea il dataset.
  3. Le immagini sono pronte per essere visualizzate statisticamente usando l'adattamento di Procruste. Seleziona la scheda che legge l'albero del progetto e clicca sul dataset. Seleziona i seguenti pulsanti in questo percorso: preliminari, nuovo adattamento di Procruste, Allineazione per assi principali e Esegui l'adattamento di Procruste.
  4. Seleziona genera matrice di covarianza sotto preliminari; il software indicherà le coordinate di Procruste. Esegui la funzione quando ti viene richiesto.
  5. Seleziona crea o modifica wireframe sotto preliminari e collega i punti sulle immagini. Poi seleziona i punti di collegamento e accetta o crea l'immagine. Modifica i classificatori.
  6. Apri un foglio di calcolo mantenendo aperto MorphoJ. Aggiungi tutte le informazioni necessarie, ad esempio: Genotipo, Trattamento, Genotipo e Trattamento, Esperimento, ecc. Salva il foglio di calcolo come file CSV.
  7. In MorphoJ, clicca su file e importa le variabili del classificatore per selezionare il file CSV. Dopo aver aperto il file, torna all'albero del progetto e clicca sul dataset.
  8. Una volta aperto il dataset, clicca su preliminari e modifica i classificatori. Questo garantirà che tutte le immagini vengano aggiunte.
  9. Poi, clicca su albero del progetto, Covmatrix, poi su Variazione in alto.
  10. Seleziona Analisi dei Componenti Principali per vedere i punteggi PC. Clicca su punteggi PC per vedere il grafico generato.
  11. Per aggiungere colori al grafico, clicca con il tasto destro e premi ellissi di fiducia per aggiungere il classificatore desiderato. Premi i dati di colore per aggiungere i colori, e ok per accettare queste modifiche.
    NOTA: Una volta chiusa e riaperta la scheda punteggio del PC seguendo le istruzioni del passo 9.10, i colori dovrebbero essere aggiornati.
  12. Per cambiare i colori del wireframe, vai su Preliminari. Clicca su imposta opzioni per il grafico delle forme, situato in basso sullo schermo. Seleziona grafici wireframe per cambiare i colori della forma target, della forma iniziale e dei numeri.
  13. Seleziona Variazione, poi Procrustes ANOVA.
  14. Esporta i risultati dell'ANOVA di Procrustes nel file del foglio di calcolo dal passo 9.7.

10. Analisi delle variabili canoniche del dataset

  1. In MorphoJ, seleziona il dataset o progetto originale. Per iniziare l'Analisi Canonica delle Variate (CVA), seleziona Confronto seguito da Analisi Canonica delle Variate. Seleziona la/le variabile classificatrice/i - seleziona Genotipo & Trattamento ed esegui la funzione.
  2. Per esportare CVA, clicca sulla scheda risultati e clicca con il tasto destro sulla pagina dei risultati ora aperta. Seleziona Esporta in File e salva le informazioni.
  3. Clicca su Albero Progetti e seleziona CVA, poi Punteggi. In alto a sinistra della pagina, seleziona File. Una volta aperta la scheda File, scegli Esporta Dataset e seleziona il tipo di dato e Genotipo & Trattamento. Salva i punteggi CVA come file .txt.
  4. Per preparare il file al software PAST, apri i punteggi CVA salvati in Notepad o in un software equivalente. Cambia l'ID nell'angolo in alto a sinistra in Etichetta per non confondere il software PASSATO. Salva i punteggi CVA modificati o equivalenti.

11. MANOVA nel software PAST

  1. Per importare i punteggi CVA in PAST, seleziona File, poi Apri per accedere ai punteggi CVA salvati da Notepad o equivalente. Quando si apre la finestra Importa file di testo , seleziona Nomi, Dati per riga e colonna, e tab per un separatore. Seleziona Importa.
  2. Nella scheda Mostra , seleziona Attributi Colonna. Accanto al pulsante Type , apri il menu a tendina e seleziona Gruppo per la prima colonna che dovrebbe contenere la variabile o le variabili classificatorie.
  3. Evidenzia i dati del PC o dei CV. Seleziona Multivariate, Test e Multivariate Normality per eseguire il test di normalità. Esegui questo test su PC e CV separatamente.
  4. Clicca sulla cella grigia vuota nell'angolo in alto a sinistra, sopra il tipo, per selezionare l'intero dataset. Seleziona Multivariate, Test e MANOVA per elaborare il MANOVA. Esporta i risultati MANOVA nel file di foglio di calcolo dal passo 9.7.
    NOTA: Sia i risultati Sommario che quelli A Coppie saranno forniti dal software. Esporta o salva entrambi.

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Risultati

Per identificare i cambiamenti della forma facciale indotti dall'etanolo nei pesci zebra, abbiamo combinato applicazioni software liberamente disponibili per generare e quantificare dati morfologici dello scheletro facciale. Embrioni di pesci portatori adulti eterozigoti di bmp7a sono stati generati e trattati con etanolo da 6 a 24 hpf. Le larve di questi incroci erano fissate a 5 dpf e le cartilagini facciali erano colorate di Alcian Blue. Sono state prese immagini del visceroc...

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Discussione

Il FASD è caratterizzato da una vasta gamma di difetti dello sviluppo, inclusi difetti craniofaciali come l'ipoplasia della mandibola. I pesci zebra sono un modello forte per la FASD grazie alla loro conservazione genetica con l'uomo, all'elevata feconditudine, alle larve traslucide e alla fecondazione esterna. I pesci zebra sono stati utilizzati per decenni per studiare sia la formazione dello scheletro craniofacciale sia l'impatto dell'etanolo sullo sviluppo

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

La ricerca presentata in questo articolo è stata supportata da una sovvenzione dei National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R01AA031043 a C.B.L.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
tpsUtil, tpsDig2, MorphoJhttps://sbmorphometrics.orgSoftware gratuito - potrebbe richiedere permessi amministrativi per il download
PASSATOhttps://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/Software gratuito - potrebbe richiedere permessi amministrativi per il download
Microscopio composto a campo chiaroOlympusBX53

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