Articolo metodologico

Generazione del modello murino con attivazione immunitaria materna gestazionale precoce per valutare l'infiammazione prenatale nello sviluppo neurologico

DOI:

10.3791/70352

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24 marzo 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, College of Medicine, University of Oklahoma, 2Graduate Program in Neuroscience, College of Medicine, University of Oklahoma

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'articolo fornisce un protocollo completo per generare un modello murino di attivazione immunitaria materna (MIA) per studiare gli effetti dell'infiammazione gestazionale precoce sul neurosviluppo, inclusi metriche chiave per garantire affidabilità e riproducibilità.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I disturbi neurosviluppali (NDD) nascono da complesse interazioni tra fattori di rischio genetici e ambientali, inclusa l'attivazione immunitaria prenatale. L'attivazione immunitaria materna (MIA) nei topi è un modello ampiamente utilizzato per studiare i contributi ambientali alle NDD; la variabilità negli esiti sperimentali limita la riproducibilità. Qui presentiamo un protocollo standardizzato per indurre MIA durante la gestazione precoce al giorno embrionale 9.5 (E9.5) nei topi, incorporando molteplici metriche di controllo qualità per valutare la risposta immunitaria e prevedere gli esiti della gravidanza. Dopo la somministrazione di acido poliinosinico:policitidico (poly(I:C)), le citochine serieche materne vengono quantificate per confermare un'attivazione immunitaria robusta, consentendo una metrica di esclusione per i rispondenti bassi. Le traiettorie del peso materno da E0.5 a E12.5 sono predittive della vitalità della cucciolata, con le dighe che hanno prodotto cucciolate che presentano caratteristici schemi di aumento di peso distinti da quelle che hanno perso una cucciolata. Abbiamo anche osservato che il venditore animale influenzava significativamente la risposta immunitaria materna e la vitalità della cucciolata, mentre la formulazione poli(I:C) non era un fattore significativo. Nel complesso, il protocollo fornisce strategie per migliorare la riproducibilità del modello MIA gestazionale precoce e la vitalità della prole, monitorando la risposta immunitaria materna e i cambiamenti di peso, e controllando i venditori animali, per studiare infine l'effetto dell'attivazione immunitaria prenatale sullo sviluppo neurologico.

Introduzione

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Gli attuali studi di associazione genomica hanno identificato centinaia di alleli di rischio, riarrangiamenti cromosomici e varianti del numero di copie che contribuiscono alla suscettibilità ai disturbi neurosviluppali (NDD) 1,2,3,4,5. Tuttavia, le alterazioni genetiche conferiscono solo un piccolo grado di rischio aumentato, e le varianti con numero elevato di copie e associazioni più forti alla malattia colpiscono solo una piccola percentuale deicasi 6. Inoltre, studi epidemiologici umani rivelano che gli stress precoce, come l'infiammazione prenatale, aumentano il rischio di diagnosi con NDD 7,8,9. Pertanto, è ben stabilito che i fattori ambientali agiscono in sinergia con i fattori di rischio genetici nell'eziologia delle NDD, e i modelli murini sono uno strumento importante per districare i contributi dei fattori di rischio genetici e ambientali nello sviluppo cerebrale e nel rischio di malattia. Sebbene i modelli animali che valutano i fattori di rischio genetici per le NDD siano ampiamente accettati per i loro risultati robusti e riproducibili, i modelli che valutano i rischi ambientali faticano a gestire una standardizzazione coerente e la variabilità dei fenotipi risultanti, come differenze comportamentali o neuroanatomiche nei discendentiMIA 10,11,12,13,14,15,16,17. Ad esempio, parametri sperimentali chiave, come il momento gestazionale della sfida immunitaria, la variabilità nel tipo e nella dosaggio dello stimolo immunitario, le risposte delle citochine materne e la variabilità della cucciolata, come la prole resiliente e suscettibile, influenzano sostanzialmente gli esiti sperimentali ma non sono sempre affrontati nelle descrizioni metodologiche. Qui è presentato un protocollo standardizzato per generare l'attivazione immunitaria materna (MIA) precoce gestazionale nei topi, includendo molteplici controlli di qualità per garantire rigore e riproducibilità nello studio di come lo stress immunitario precoce influenzi lo sviluppo neurologico e gli esiti di salute.

I nostri obiettivi sono presentare un protocollo per 1) migliorare l'affidabilità del modello MIA e 2) caratterizzare variabili che possono contribuire all'eterogeneità sperimentale. Nei roditori, l'MIA è comunemente indotta dalla somministrazione sistemica di stimolanti immunitari come l'acido poliinosinico:policitidico (poly(I:C)), un mimetico virale, o lipopolisaccaride (LPS), un mimetico batterico, in vari momenti gestazionali, inclusi il giorno embrionale 9,5 (E9,5), E12,5, E15,5, E17,5 ealtri 18,19. Queste manipolazioni inducono una risposta citochine materna robusta che altera lo sviluppo neuronaturale fetale e porta a fenotipi comportamentali e molecolari indicanti delle NDD 20,21,22,23. Tuttavia, molti studi non valutano regolarmente la risposta immunitaria materna, rendendo difficile confermare la forza o la coerenza dell'induzione MIA negliesperimenti 12, 14 e 24. Per affrontare questo problema, abbiamo stabilito molteplici metriche di controllo qualità e fissato una soglia per la risposta materna MIA E9.5 basata sui livelli di citochine misurati nel siero materno dopo la stimolazione immunitaria poli(I:C). Il nostro approccio consente una dosaggio più precisa dello stimolante immunitario e l'identificazione ed esclusione di persone a basso o non rispondente, migliorando infine l'affidabilità e la robustezza del modello. Sebbene raramente discussa sul campo, la bassa vitalità della cuciolata è una limitazione nota del modello MIA, in particolare con l'induzione a E9.5. Sebbene l'induzione a metà gestazione (E12.5) possa migliorare la vitalità della cucciolata, puntiamo a stabilire punti di controllo durante l'induzione dell'MIA gestazionale precoce che possano aiutare a prevedere la vitalità della cucciolata e identificare anche variabili che migliorano il successo riproduttivo.

MIA è un modello prezioso per studiare gli effetti ambientali sul neurosviluppo perché, a differenza dei modelli in vitro che isolano le cellule dal loro ambiente, MIA utilizza l'ambiente in utero per studiare gli effetti sullo sviluppo neurologico della prole. Sebbene l'MIA venga spesso utilizzato da solo per modellare le NDD, può anche essere combinato con modelli genetici o altri fattori di stress precoce, offrendo una visione della complessa interazione tra geni e ambiente o di stress ambientali ripetuti. Gli studi hanno combinato MIA con roditori presenti di varianti genetiche di rischio NDD, come DISC1, CNTNAP2 e SHANK3, per dimostrare l'interazione sinergica tra ambiente egenetica 25,26,27,28,29. Inoltre, un modello "a due colpi" dello stress ambientale combinava l'absentezza con un secondo fattore di stress nella prima età, come lo stress psicologico o l'esposizione a droghe adolescenziale, portando postnatalmente all'insorgenza o all'esacerbazione dei fenotipi 30,31,32. Insieme, questi approcci evidenziano la versatilità del modello MIA, che può essere utilizzato da solo o in combinazione con altri fattori di rischio ambientali o genetici.

Questo articolo fornisce metodi passo dopo passo per indurre l'ACM nei topi al fine di studiare gli effetti dell'infiammazione prenatale sullo sviluppo neurologico. Include checkpoint per aumentare la riproducibilità e la comprensione dei vari fattori che influenzano l'efficienza MIA (Figura 1).

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Figura 1: Cronologia della generazione dei MIA. Le madri incinte cronometrate vengono somministrate poli(I:C) o soluzione salina a E9,5, seguite da un prelievo di sangue 3 ore dopo. I pesi materni vengono raccolti a E0.5, E9.5, E10.5, E11.5 ed E12.5 per monitorare la progressione della gravidanza dopo l'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida etiche presso l'Università dell'Oklahoma e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Gli animali venivano alloggiati in gabbie ventilate singolarmente su biancheria di cellulosa da 1/8 di pollice con accesso ad libitum a cibo e acqua, e arricchimenti nelle gabbie che includevano un nido e una capanna. La struttura di allevamento degli animali è mantenuta con un ciclo di luce acceso di 14 ore e 10 ore spento, in conformità con il Jackson Laboratory per riflettere il fotoperiodo della tarda primavera, una stagione di riproduzione di topi di picco.

Consulta la Tabella 1 per i campi dati specifici da raccogliere durante tutto il protocollo. Consulta la tabella delle statistiche supplementari (Tabella Supplementare 1) e GitHub (https://hayes-lab.github.io/2026_Camfield_JoVE/) per analisi statistiche dettagliate.

Tabella 1: Esempio di scheda di raccolta dati. Modello di dati importanti da raccogliere durante la generazione del modello MIA. Clicca qui per scaricare questa tabella.

1. Generazione di gravidanze cronometrate

  1. Organizza due femmine di 8-10 settimane, C57BL/6, con maschi riproduttori C57BL/6 nel tardo pomeriggio o la sera. L'utilizzo di maschi esperti di età compresa tra 2 e 10 mesi, isolati prima della riproduzione, porta a gravidanze più rapide e affidabili.
  2. Valutare le femmine per eventuali tappi vaginali la mattina seguente e continuare a controllare una volta al giorno fino a quando non avviene il tappo. È importante notare che le candele sono temporanee e possono cadere entro il pomeriggio se non vengono controllate al mattino.
    NOTA: Per un protocollo dettagliato per il plug checking, si riferisce a Behringer et al. (2016)33.
  3. Dopo aver confermato il tappo vaginale, pesa la femmina e registra il peso per monitorare lo stato della gravidanza in base all'aumento di peso durante la gestazione.
  4. Separare le femmine collegate in gabbie individuali e mantenerle in condizioni abitative standard con accesso ad libitum a cibo e acqua. Designare le femmine come embrionale giorno 0,5 (E0,5). Annota la data del tappo per garantire un monitoraggio accurato dell'età gestazionale.

2. Preparazione dell'acido poliinosinico:policitilico (poli(I:C))

  1. Ricostituire il poli(I:C) liofilizzato in una soluzione di stock ad alta concentrazione (10-20 mg/mL) sciogliendola in soluzione salina sterile o in acqua sterile secondo le istruzioni del produttore, ottenendo così una soluzione trasparente. Fornitore di dischi, numero di catalogo e numero di lotto del poli (I:C).
    NOTA: Poly(I:C) è un rischio chimico; maneggiare in conformità con le linee guida istituzionali di biosicurezza e smaltire in appropriati contenitori per i rifiuti di biohazard utilizzando i DPI appropriati per minimizzare l'esposizione.
  2. Vortice e ulteriormente diluire in una soluzione di stocco a bassa concentrazione (4 mg/mL) in soluzione salina. Per evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo, si aggiungono i volumi monouso di materiale a bassa concentrazione (~125 μL) in tubi da 1,5 mL e conservati a -20 °C o -80 °C. Tieni il poliuretano ricostituito (I:C) sul ghiaccio durante la preparazione e la maneggiazione per minimizzare il degrado.
    NOTA: Per una revisione completa sulla variabilità del poly(I:C), si rifera a Mueller et al. (2019)14.
  3. Immediatamente prima dell'iniezione con E9.5, diluire il poli a bassa concentrazione (I:C) (4 mg/mL) alla concentrazione di lavoro desiderata (2 mg/mL) in soluzione salina sterile.
    NOTA: Le dosi tipiche di iniezione poli(I:C) nei topi variano tra ~5 e 20 mg/kg, ma la dose ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente da ciascun ricercatore.
  4. Riscaldare il materiale di lavoro (2 mg/mL) a 65 °C per 10 minuti per garantire un corretto ricottura della struttura a doppio filamento dell'RNA.
  5. Mescola tramite vortexing o pipettaggio per assicurarti che la soluzione sia omogenea prima dell'iniezione.

3. Iniezione di poli(I:C)

  1. La mattina di E9.5, pesa la diga per confermare la gravidanza e usa il peso per calcolare il volume di iniezione poli(I:C) per l'MIA e lo 0,9% del volume di iniezione salina per i controlli (CON). Nei risultati descritti, si ottiene una dose di 10 mg/kg utilizzando un volume di iniezione pari a 5× del peso corporeo dell'animale. Iniezioni con un peso superiore a 10 volte superiore all'animale dovrebbero essere evitate.
    Peso corporeo E9,5 * 5 = μL di poly(I:C) (a 2 mg/mL) o 0,9% di soluzione salina
    NOTA: Un aumento di peso tipico di 2-3 grammi è previsto tra E0,5 ed E9,5 per indicare una gravidanza vitale.
  2. Preleva il volume appropriato di soluzione di lavoro poli(I:C) preparata (2 mg/mL) o soluzione salina in una siringa sterile di calibro 27 o minore.
  3. Immobilizza correttamente la diga per garantire il minimo dolore e disagio. Iniettare il poli(I:C) o soluzione salina intraperitonealmente (IP) sul quadrante inferiore sinistro o destro appena sopra il livello dell'anca o al secondo set di capezzoli. Smaltire correttamente le siringhe in un contenitore apposito per articoli per la biosicurezza. Registra il lato iniezione per mantenere la coerenza tra le coorti.
  4. Riporta immediatamente la diga nella gabbia di casa e monitora eventuali segni di disagio. Integrare con idrogel per almeno 24 ore dopo l'iniezione per prevenire la disidratazione dovuta a comportamenti di malattia.
  5. Per garantire una documentazione approfondita, annota il dosaggio di poly(I:C), μL di poly(I:C) iniettato, data/ora di iniezione, età gestazionale e numero di lotto di poly(I:C) utilizzato (Tabella 1).

4. Prelievo di sangue

  1. Tre ore dopo l'iniezione, i topi sono stati osservati individualmente per 1 minuto. La presenza di uno qualsiasi dei seguenti comportamenti, come ridotta attività, postura curva, smorfie facciali o feci acquose, è stata registrata su una scala a tre punti (senza fenotipo, lieve, prominente), e i topi che mostravano uno o più comportamenti sono stati classificati come comportamenti di malessere acuto.
    NOTA: Non dovrebbero essere osservati comportamenti di malattia nelle dighe CON.
  2. Inoltre, raccogliere con cura il sangue materno dalle madri iniettate utilizzando un metodo minimamente invasivo, come il sanguinamento della coda, e riportarlo nella gabbia di casa. Punta a raccogliere circa 50 μL di sangue per la quantificazione delle citochine infiammatorie.
    NOTA: Tutti i materiali che entrano in contatto con il sangue devono essere considerati biopericolosi e smaltiti utilizzando DPI appropriati e in conformità con le linee guida istituzionali sulla biosicurezza.
  3. Lascia coagulare il sangue per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 °C). Centrifuga a 2.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per separare il siero dal coagulo. Lo strato superiore trasparente rappresenta il siero, mentre il pellet scuro in fondo contiene il coagulo. Raccogli con cura il siero senza disturbare o aspirare alcuna parte del coagulo. Il siero può essere conservato a -20 °C fino a essere pronto per l'analisi delle citochine a valle.

5. Monitoraggio delle dighe iniettate

  1. Pesa le dig quotidianamente per tre giorni dopo l'iniezione (E10.5, E11.5 ed E12.5) per monitorare la loro risposta al poly(I:C). È comune osservare una perdita di peso fino a 1 g il giorno dopo l'iniezione di poly(I:C) (E10.5), seguita da un recupero graduale, con il peso che tipicamente supera la base di E9.5 di E12.5.
    NOTA: La perdita di peso superiore a 1 g o il mancato recupero di peso entro E12.5 sono tipicamente un segno di una cucciolata persa.
  2. Per il resto della gestazione, assicurarsi che le dighe abbiano accesso continuo a cibo, acqua e materiali per la nidificazione. Inoltre, limita la manipolazione degli animali o lo spostamento delle gabbie, poiché ciò può causare ulteriore stress e contribuire a una diminuzione della vitalità della cucciolata.
  3. Il giorno del parto previsto (E19,5), registra i risultati della cucciolata come la dimensione della cucciolata, la vitalità del cucciolo o la mancanza, indicando una gravidanza fallita. Rimuovere prontamente i cuccioli deceduti e smaltirli secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza e le linee guida per lo smaltimento delle carcasse animali approvate dall'IACUC.
    NOTA: I MIA possono avere cucciolate più piccole e possono subire complicazioni nel parto, portando a un ritardo con E20.5.

6. Validazione della risposta immunitaria

  1. Utilizzando il siero materno raccolto dopo iniezioni MIA e CON, quantificare le citochine infiammatorie, come IL-6 o TNF-α, utilizzando test immunosorbenti legati a enzimi (ELISA) o test multiplex secondo le istruzioni del produttore. Le diluizioni tipiche del siero sono 1:100 per il siero MIA e 1:25 per il siero CON.
  2. Dopo la quantificazione, si utilizzano i risultati per stabilire una soglia rappresentativa per la risposta MIA. La soglia MIA è definita come una risposta IL-6 sieroica materna superiore a 1.000 pg/mL (circa il 25% inferiore alla risposta media del gruppo MIA), e qualsiasi diga MIA con risposte inferiori a questa soglia viene esclusa dal dataset come bassa o non rispondente.
    NOTA: Le dighe CON dovrebbero avere livelli di citochine molto bassi o non rilevabili; qualsiasi diga CON con livelli di citochine superiori al 25% della media del gruppo CON (ovvero soglia di 250 pg/mL) deve essere esclusa.

7. Analisi statistica

  1. Esegui tutte le analisi statistiche utilizzando il software statistico R. Considera la diga come unità biologica in tutte le analisi. Definisci la significanza statistica come p < 0,05. I dati presenti come diagrammi a scatola che rappresentano l'intervallo mediano e interquartile (IQR; percentile 25°-75°), i baffi si estendono fino a 1,5 × IQR, e i punti rappresentano le singole dighe.
  2. Valutare la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk per guidare la selezione di analisi parametriche o non parametriche. Effettuare confronti tra due gruppi indipendenti utilizzando test t a due facce non accoppiati (normali) o test di somma dei rangi di Wilcoxon (non normali) secondo opportunità. Analizzare le misurazioni accoppiate all'interno degli stessi animali (cioè i pesi) utilizzando test t accoppiati (normali) o test Wilcoxon con rango firmato (non normali). Effettuare test su un campione contro una media di zero quando si valuta l'aumento di peso relativo tra i giorni embrionali.
  3. Valutare la relazione tra i livelli di IL-6 e TNF-α sierici materni utilizzando la correlazione di rango di Spearman. Usa il test esatto di Fisher per confrontare la proporzione di cucciolate di successo tra fornitori e formulazioni poli(I:C). Consulta il riepilogo statistico dettagliato fornito nella Tabella Supplementare 1 e il codice di analisi su GitHub (https://hayes-lab.github.io/2026_Camfield_JoVE/).

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Risultati

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Dopo la somministrazione di poli(I:C) o soluzione salina a E9.5, sono state valutate le citochine seroniche materne per valutare l'efficienza e la robustezza dell'induzione MIA (Figura 2). Le dighe MIA hanno mostrato livelli significativamente aumentati di interleucina-6 (IL-6) rispetto alle dighe CON (Figura 2A). Inoltre, la valutazione dei livelli di IL-6 ha permesso l'esclusione delle dighe MIA che non raggiungevano la soglia...

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Discussione

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In questo protocollo, abbiamo stabilito checkpoint per aumentare l'efficienza, la robustezza e la riproducibilità del modello di attivazione immunitaria materna (MIA) gestazionale precoce, concentrandoci sulle risposte delle citochine materne, sulle traiettorie del peso e sulle variabili sperimentali che influenzano gli esiti della gravidanza. I nostri risultati dimostrano che l'MIA induce risposte immunitarie materne variabili, con IL-6 che funge da biomarcatore affidabile per identific...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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La ricerca è stata generosamente finanziata da un K01 del NIH (K01AG087810), da una borsa di studio per l'iniziativa di gravidanza Next Gen del Burroughs Wellcome Fund (1266845) e da un progetto pilota COBRE (P20GM134973). La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bilancia per animaliKent ScientificSCL-4000Per pesare i topi
Seringhe per insulina BD Lo-Dose U-100 - 28GFisher Scientific14-826-79Per PIC, iniezione intraperitoneale
Topi femmine C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664Femmine vergini di 10-12 settimane
Topi maschi C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664Maschi riproduttivi
Topi femmine C57BL/6NCrlCharles River Laboratories027Femmine vergini di 10-12 settimane
Centrifugatrice (standard da laboratorio da 24 posti)Eppendorf5425 RCentrifuga per raccogliere il siero
Piattaforma di documentazione datiAirtable, Microsoft Excel, ecc.Conservare i registri di dati importanti, come pesi, ora dell'iniezione, ecc. (Tabella 1)
Bagno secco digitale - Un bloccoMedicus Health5277M1Usato per riscaldare PIC prima dell'iniezione
Eppendorf tubi - 1,5 mLEppendorf30123611Usare per diluire PIC a concentrazioni di stock e di lavoro
Spugne di garza FisherbrandFisher ScientificMSD-1400250Usare per fermare il sanguinamento della coda dopo la raccolta del sangue
Sonda mall Fisherbrand da 6 polliciFisher Scientific13-820-026Usato per il controllo del tappo
HydroGelClear H2070-01-5022Supplemento dopo le iniezioni
Kit ELISA non rivestito per IL-6 di topoThermo Fisher Scientific88-7064-88Quantificare i livelli di IL-6 nel siero materno
Bicchieri in polipropilene Griffin a forma bassa NalgeneThermo Fisher Scientific1201-1000PKMettere i topi nel bicchiere durante la pesatura
Poly(I:C) (LMW)Invivogentlrl-picwPIC (LMW) per l'iniezione MIA
Sale sodico dell'acido poliinosinico-policitidilicoSigmaP9582PIC (Sigma) per l'iniezione MIA
Lamelle per bisturi, #22, confezione da 10Home Science ToolsDE-SC22BLDUsare per tagliare l'estremità della coda per la raccolta del sangue
Cloruro di sodio 0,9% (soluzione salina normale), USP, Grado sterile, Cytiva HycloneCytivaZ1376Iniettare per la generazione di topi di controllo
Piattaforma per il taglio della codaBraintree Scientific, Inc.IL-200Ferma correttamente i topi durante le ematofobie
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc.SI-0236Vortex PIC dopo la diluizione

Riferimenti

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