Il meccanismo della polvere di ermiao nel trattamento della prostatite: uno studio basato sulla farmacologia di rete e sulla verifica sperimentale

Sommario

Utilizzando un approccio di farmacologia a rete, questo studio ha rivelato che la Polvere di Ermiao esercita i suoi effetti terapeutici contro la prostatite inibendo i fattori infiammatori e le vie di segnalazione associate. Esperimenti in vitro successivi hanno ulteriormente dimostrato che il suo estratto acquoso ha soppresso significativamente l'espressione di citochine infiammatorie chiave in un modello indotto da LPS di cellule epiteliali prostatiche.

Abstract

Questo protocollo presenta un approccio combinato di farmacologia di rete e validazione sperimentale per indagare il meccanismo d'azione della Polvere di Ermiao (EMP) nel trattamento della prostatite. Il flusso di lavoro segue un design a passi: (i) screening basato su database di composti e bersagli attivi, (ii) costruzione e analisi di reti di interazione, e (iii) validazione sperimentale in vitro . Innanzitutto, gli ingredienti attivi dell'EMP e i relativi target sono stati recuperati dal database TCMSP, mentre i target correlati alla prostatite sono stati ottenuti dal database GeneCards. L'intersezione tra bersagli EMP e bersagli per malattie è stata utilizzata per identificare i principali bersagli terapeutici. In secondo luogo, è stata costruita una rete "Farmaco–Principio Attivo–Malattia" utilizzando Cytoscape. Sono state effettuate analisi di interazione proteina-proteina (PPI) e arricchimento delle vie della Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) sui target chiave, rivelando che fattori infiammatori come IL6 e TNF fungevano da bersagli principali, e vie come PI3K/AKT e MAPK erano significativamente arricchite. Infine, la validazione in vitro è stata condotta utilizzando un modello infiammatorio indotto da LPS delle cellule epiteliali della prostata. Il trattamento con EMP ha ridotto significativamente il rilascio dei fattori pro-infiammatori IL-6 e TNF-α rispetto al gruppo trattato con LPS (p < 0,05), confermando l'efficacia antinfiammatoria dell'EMP. Questo approccio integrativo fornisce un quadro riproducibile che può essere adattato per indagare altri sistemi terapeutici multicomponenti. In conclusione, questo studio chiarisce preliminarmente che l'EMP esercita i suoi effetti anti-prostatite attraverso un meccanismo multi-componente, multi-bersaglio e multi-percorso, strettamente associato alla soppressione delle risposte infiammatorie, offrendo così una base scientifica per la sua applicazione clinica.

Introduzione

La prostatite, in particolare la prostatite cronica non batterica, rappresenta un disturbo urologico diffuso caratterizzato da un'eziologia complessa e da una mancanza di terapie altamente efficaci, imponendo un peso significativo sulla qualità della vita dei^{pazienti 1,2,3}. La gestione clinica attuale della prostatite adotta un approccio integrato che include antibiotici, bloccanti dei recettori α e farmaci antinfiammatori ^{non steroidei 4,5,6}. Le principali sfide includono l'assenza di terapie specifiche per l'eziologia e la complessa interazione tra fattori psicologici e sintomi fisici, che contribuiscono collettivamente a risultati terapeutici insoddisfacenti e a una frequente^recidiva. Negli ultimi anni, approcci di medicina integrativa, come l'agopuntura e la medicina erboristica, sono stati ampiamente applicati nella gestione della prostatite e hanno dimostrato una promettente efficacia. La sicurezza e l'efficacia di questi approcci terapeutici sono state dimostrate da una serie di evidenze di ricerca di alta qualità 8,9,10,11,12.

In questo contesto, formulazioni di medicina tradizionale cinese (MTC) come la Polvere di Ermiao (EMP), nota per le loro proprietà antinfiammatorie e disintossicanti, offrono un promettente approccio terapeutico^alternativo 13,14,15. Tuttavia, i meccanismi farmacologici precisi alla base dell'efficacia dell'EMP contro la prostatite rimangono incompletamente chiariti, principalmente a causa della sua natura multicomponente. L'avvento della farmacologia delle reti fornisce uno strumento potente per decifrare la complessa modalità d'azione "multi-componente, multi-bersaglio, multi-percorso" caratteristica delle formule^{TCM 16,17}. La nostra strategia prevedeva l'identificazione dei componenti attivi dell'EMP e dei suoi potenziali obiettivi, seguita da un'analisi della rete per individuare obiettivi e percorsi chiave. Successivamente sono stati condotti esperimenti per convalidare biologicamente gli effetti antinfiammatori e i meccanismi fondamentali, con l'obiettivo di stabilire una base scientifica per l'applicazione dell'EMP. Questo studio introduce un quadro combinato di validazione farmacologica-sperimentale in rete che migliora l'interpretazione meccanicistica delle terapie multicomponente

Protocollo

Non era richiesta un'approvazione etica per questo studio, poiché non ha coinvolto partecipanti umani né campioni clinici. Tutte le procedure che coinvolgevano linee cellulari venivano condotte in conformità con le linee guida e le normative istituzionali sulla biosicurezza. La linea cellulare epiteliale prostatica utilizzata in questo studio è stata ottenuta da un fornitore commerciale certificato.

NOTA: Tutti i reagenti, strumenti e software utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali. Il diagramma di flusso di questo studio è presentato nella Figura 1.

1. Screening degli ingredienti attivi

1. Accedi al database TCMSP.
2. Seleziona "Nome dell'erba" nella casella di ricerca, inserisci "Huangbo" e clicca su "Cerca".
3. Clicca sul filtro "OB", imposta "≥30" e applica.
4. Clicca sul filtro "DL", imposta "≥0.18" e applica.
5. Copia i risultati filtrati in un foglio di calcolo Excel.
6. Applica lo stesso metodo di screening per ottenere gli ingredienti attivi del "Cangzhu".
7. Rimuovere i duplicati degli ingredienti attivi importando tutti i dataset in Microsoft Excel (versione 2019) e unendo le liste composte in formato Excel.
8. Rimuovere i duplicati degli ingredienti attivi standardizzando i nomi composti e identificando voci identiche. Quando più registrazioni corrispondevano allo stesso composto, veniva mantenuta una sola voce rappresentativa.
9. Stabilire associazioni tra "Huangbo", "Cangzhu" e ingredienti attivi.

2. Ottenere gli obiettivi corrispondenti agli ingredienti attivi

1. Accedi al database TCMSP.
2. Seleziona "Nome della sostanza chimica" nella casella di ricerca, inserisci gli ingredienti attivi e clicca su "Cerca".
3. Copia il nome target corrispondente a ogni ingrediente attivo.
4. Rimuovere i nomi duplicati dei Target e stabilire associazioni tra gli ingredienti attivi e i nomi dei Target.
5. Accedi al database UniProt (https://www.uniprot.org/)¹⁸, recupera i simboli genici ufficiali per ogni nome di Target e sostituiscili sistematicamente.

3. Acquisizione di bersagli per la malattia

1. Accedi al database GeneCards (https://www.genecards.org)¹⁹.
2. Inserisci "Prostatite" nel campo di ricerca e premi l'icona di ricerca per ottenere la lista genica corrispondente.
3. Ordina i geni in ordine decrescente per punteggio di rilevanza.
4. Esporta i geni rilevanti in formato Excel.
5. I bersagli con punteggio ≥1 sono stati selezionati come bersagli correlati alla prostatite.

4. Preparazione per la costruzione di una rete regolatoria di farmaci principio attivo-bersaglio-malattia

1. Ottenere l'intersezione tra i bersagli relativi ai principi attivi e quelli legati alla prostatite, e definirli come obiettivi dell'EMP per il trattamento della prostatite.
2. Stabilire l'associazione tra i principi attivi e i bersagli terapeutici dell'EMP per la prostatite.
3. Crea un file Excel chiamato "Network" con le prime tre colonne chiamate "Node1", "Node2" e "Net".
4. Incolla le associazioni tra EMP e farmaco nelle colonne "Node1" e "Node2", inserendo "droga" nella colonna "Net" per tutte le righe.
5. Incolla le associazioni tra ingredienti attivi e farmaci nelle colonne "Node1" e "Node2", inserendo "ingrediente" nella colonna "Net" per tutte le righe.
6. Popola le colonne "Node1" e "Node2" con le associazioni principio attivo-bersaglio per i bersagli di EMP per il trattamento della prostatite, inserendo "bersaglio" nella colonna "Net".
7. Incolla i target terapeutici dell'EMP per la prostatite nella colonna "Nodo1", inserendo "prostatite" nella colonna "Nodo2" e "malattia" nella colonna "Net" per tutte le righe.
8. Salva il file Excel "Rete" come file in formato txt.
9. Crea un file Excel chiamato "Type" con le prime due colonne chiamate "Node" e "Type".
10. Popola la colonna "Nodo" con "EMP", inserendo "formula" nella colonna "Type".
11. Inserisci "Huangbo" e "Cangzhu" nella colonna "Nodo"; inserisci "droga" nella colonna "Tipo" per tutte le righe.
12. Inserisci gli ingredienti attivi nella colonna "Nodo", mentre inserisci "ingrediente" nella colonna "Tipo" per tutte le righe corrispondenti.
13. Compila la colonna "Nodo" con i target terapeutici dell'EMP per la prostatite, inserendo "target" nella colonna "Tipo".
14. Inserisci i bersagli correlati alla prostatite nella colonna "Nodo", mentre inserisci "malattia" nella colonna "Tipo" per tutte le righe corrispondenti.
15. Salva il file Excel "Type" come file .txt formato.

5. Visualizzazione della rete regolatoria "Farmaco-Ingrediente Attivo-Malattia-Malattia" da parte di Cytoscape

1. Avvia Cytoscape.
2. Vai su "File > importa > rete dal File System" e apri il file "network.txt".
3. Apri il pannello "Stile". Seleziona "Forma", scegli "Tipo" dal menu a tendina "Column" e imposta "Mapping Type" su "Discrete Mapping".
4. Assegnare forme distinte dei nodi alle seguenti categorie: formula, farmaco, ingrediente, obiettivo, malattia.
5. Seleziona "Colore di riempimento", scegli "Tipo" dal menu a tendina "Column" e imposta "Tipo di mappatura" su "Mappatura discreta".
6. Assegnare colori distinti dei nodi alle seguenti categorie: formula, farmaco, ingrediente, obiettivo, malattia.
7. Seleziona "Altezza" e "Larghezza", scegli "Tipo" dal menu a tendina "Colonna" e imposta "Tipo di mappatura" su "Mappatura discreta".
8. Assegnare dimensioni distinte dei nodi alle seguenti categorie: formula, farmaco, ingrediente, bersaglio, malattia.
9. Seleziona "Etichetta Dimensione Font", scegli "Tipo" dal menu a tendina "Column" e imposta "Mapping Type" su "Discrete Mapping".
10. Assegnare dimensioni distinte di font per le etichette alle seguenti categorie: formula, farmaco, ingrediente, bersaglio, malattia.
11. Riposizionare manualmente i nodi per ottimizzare la disposizione della rete.
12. Vai su "File > esporta > immagine di rete in file" e salva la rete come immagine.

6. Analisi e visualizzazione della rete PPI

1. Accedi https://cn.string-db.org/ e vai al modulo "Multiple Proteins".
2. Inserisci la lista dei geni target nella casella di ricerca, seleziona "Homo sapiens" come organismo e clicca su "Cerca".
3. Dopo il caricamento dei risultati, clicca su "Continua".
4. Apri il pannello "Impostazioni", imposta "punteggio minimo richiesto di interazione" su "alta confidenza (0.700)" e seleziona "nascondi i nodi disconnessi nella rete".
5. Clicca su "Aggiornae", poi esporta i dati di associazione PPI in formato TSV tramite il menu "Esporta".
6. Avvia Cytoscape, vai al menu File e seleziona "Importa rete dal File System" per aprire il file TSV.
7. Naviga al menu "Tools", poi seleziona "NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Tratta la rete come non diretta".
8. Naviga al menu "File", seleziona il sistema "Esporta tabella al file" ed esporta i dati di rete.
9. Naviga nel pannello "Stile" e configura gli attributi "Forma", "Colore di riempimento", "Altezza e "Larghezza".
10. Regola la disposizione della rete PPI riposizionando i nodi.
11. Naviga nel menu "File", seleziona "Esporta immagine di rete in file" ed esporta la rete visualizzata come immagine.
12. Apri i dati di rete PPI esportati con WPS e ordinali in ordine decrescente per colonna "Degree".
13. Seleziona i primi 20 obiettivi ordinati, genera un grafico a barre e salva il grafico come immagine.

7. Analisi dell'arricchimento del percorso KEGG

1. Apri un terminale o un prompt dei comandi, digita R e premi Invio.
2. Nella console R, esegui i seguenti comandi uno per uno:
   install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
   BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
3. Converti i simboli genici dei target dell'EMP per il trattamento della prostatite in ID Entrez usando org. Hs.eg.db.
4. Leggi gli ID Entrez ed esegui l'analisi di arricchimento KEGG usando il package clusterProfiler con parametri: organism = "has", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05.
5. Dopo aver rimosso le vie umane legate alle malattie e al metabolismo dai risultati ottenuti dall'analisi di arricchimento KEGG, si ordinano le vie rimanenti in base al conteggio dei geni arricchiti.
6. Stabilire l'associazione tra i primi 15 percorsi di segnalazione e i bersagli.
7. Prepara un file a due colonne con le associazioni "pathway" e "target", poi importalo in Cytoscape tramite "File > Import > Network from File".
8. Imposta forme e colori dei nodi per distinguere i percorsi dai bersagli usando il pannello "Stile".
9. Regola manualmente il layout ed esporta la rete come immagine.

8. Preparazione farmaceutica

NOTA: La formulazione EMP è composta da 15 g di corteccia di Phellodendri Chinensis (Huangbo) e 15 g di rizoma Atractylodis (Cangzhu). Il metodo di estrazione dell'acqua e precipitazione dell'alcol è stato impiegato per ottenere l'estratto per i successivi esperimenti^{cellulari 20}.

1. Immergi il farmaco in una massa d'acqua di 10 volte per 1 ora.
2. Decocca per 1 ora, poi filtra attraverso la garza per ottenere il decotto.
3. Aggiungi di nuovo una massa di acqua di 10 volte al farmaco, decocchi per 30 minuti e filtra attraverso una garza per ottenere il decott.
4. Aggiungi di nuovo una massa d'acqua di 10 volte al farmaco, decocta per 30 minuti e filtra attraverso la garza per ottenere il decotto.
5. Unisci i tre decottion filtrati, poi filtra la miscela attraverso carta filtrante.
6. Concentrare il decotto a pressione ridotta al 10% del suo volume originale.
7. Raffreddare il concentrato, aggiungere lentamente etanolo al 75% mescolando, seguito da sigillare e conservare a 4 °C per 12 ore.
8. Centrifuga la miscela e raccogli il soprandante.
9. Continua con la distillazione a pressione ridotta.
10. Infine, liofilizza il prodotto utilizzando un liofilizzatore sottovuoto.
    NOTA: La polvere liofilizzata può essere conservata a –20ºC per un massimo di 3 mesi, che rappresenta un punto di pausa sicuro. Per riprendere, ricostituisci la polvere in un solvente appropriato secondo necessità.

9. Scongelamento e coltura cellulare

NOTA: Le celle acquistate sono state consegnate al laboratorio su ghiaccio secco. Prima dell'inizio dell'esperimento, il Mezzo Libero Sierico di Ceratinociti (K-SFM) è stato preparato in anticipo integrandolo con fattore di crescita epidermica ricombinante umano (rEGF) fino a una concentrazione finale di 5 ng/mL, estratto ipofisario bovino fino a una concentrazione finale di 50 μg/mL e 1% di Penicillina-Streptomicina.

1. Attiva il bagno d'acqua e regola la temperatura a 37 °C.
2. Rimuovi le cellule dal ghiaccio secco e agitale immediatamente nel bagno d'acqua fino a scongelarle completamente.
3. Aggiungi 5 mL di K-SFM alle celle. Mescola delicatamente, poi centrifuga la miscela (4 °C, 500 × g, 5 minuti).
4. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet in completamente K-SFM.
5. Trasferire le cellule in una fiaschetta T-25 e metterle in un incubatore di colture cellulari.
   NOTA: I parametri ambientali dell'incubatore di colture cellulari sono stati mantenuti a 37 °C, 5% CO₂ e ≥ 95% di umidità relativa.

10. Sottocultura cellulare

NOTA: La subcultura è stata effettuata quando le cellule hanno raggiunto l'80–90% di confluenza, con un rapporto di sottocultura di 1:2 a 1:3.

1. Aspirare il supernadante del mezzo di coltura, seguito da due lavaggi delle cellule con PBS senza calcio e magnesio.
2. Introduci 2 mL di tripsina-EDTA e lascia riposare le cellule per 3 minuti per la dissociazione enzimatica.
   ATTENZIONE: Questo protocollo prevede l'uso di reagenti pericolosi, tra cui lipopolisaccaridi (LPS), cloroformio, etanolo e reagente TRIzol. Tutte le procedure che coinvolgono sostanze chimiche pericolose devono essere eseguite in una cappa chimica certificata, indossando l'attrezzatura di protezione personale adeguata (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi). I materiali biologici devono essere gestiti in conformità con le linee guida istituzionali sulla biosicurezza.
3. Aggiungere un mezzo K-SFM integrato con siero bovino fetale al 10% per interrompere la digestione.
4. Trasferire la miscela della cella in un tubo centrifugo da 15 mL, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e rimuovere il soprantantante.
5. Il pellet cellulare è stato risospeso in K-SFM completo e successivamente trasferito in nuove fiaschette di coltura.

11. Determinazione della concentrazione massima di trattamento farmacologico tramite test MTS

NOTA: Ogni concentrazione di farmaco è stata testata con 5 repliche tecniche.

1. Digerire le cellule RWPE-1 nella fase di crescita logaritmica.
2. Risospendere le cellule in un mezzo K-SFM completo, poi determinare la concentrazione cellulare contando.
3. Regolare la sospensione delle celle a una densità di 1 × 10⁵ celle/mL con mezzo K-SFM completo.
4. Distribuire la sospensione della cella in una piastra da 96 pozzi con 100 μL per pozzo.
5. La piastra da 96 pozzi fu collocata in un incubatore di colture cellulari per la coltivazione.
6. Dopo 24 ore, una volta che le cellule avevano aderito completamente, il mezzo di coltura veniva aspirato e scartato.
7. Sostituire il mezzo con un mezzo completo K-SFM contenente diverse concentrazioni di soluzione EMP.
8. Rimettere la piastra nell'incubatore di colture cellulari per altre 24 ore di incubazione.
9. Aspira il mezzo, poi risciacqua le cellule due volte usando PBS.
10. Aggiungere 100 μL di mezzo K-SFM completo a ciascun pozzo, poi incubare la piastra nell'incubatore di colture cellulari per altre 4 ore.
11. Somministrare 10 μL di soluzione MTS in ogni pozzo e determinare il diametro esterno a 490 nm dopo un'incubazione di 1 ora.
12. Utilizzando il gruppo di controllo a vuoto (cellule coltivate in mezzo completo senza stimolazione LPS o trattamento farmacologico) come base, è stata calcolata la proliferazione cellulare sotto ogni concentrazione di trattamento.
    NOTA: La concentrazione più alta che non mostrava effetti significativi sulla proliferazione cellulare è stata definita come il trattamento ad alta dose, seguita dalla sua metà concentrazione come trattamento a dosi medie e dalla concentrazione a un quarto come trattamento a bassa dose.

12. Intervento cellulare

1. Digerire le cellule RWPE-1 nella fase di crescita logaritmica.
2. Le cellule sono state risospese in un mezzo K-SFM completo, e la concentrazione cellulare è stata determinata tramite il conteggio cellulare.
3. La sospensione delle celle è stata regolata a una densità di 5 × 10^{celle da 5} mL utilizzando un mezzo completo K-SFM.
4. La sospensione a celle è stata inserita in una piastra a 6 pozzi a 2 mL per pozzo.
5. La piastra è stata posta in un incubatore di coltura e incubata per 12 ore per consentire l'adesione cellulare.
6. Le cellule sono state trattate rispettivamente con concentrazioni EMP basse (150 μg/mL), medie (300 μg/mL) e alte dosi (600 μg/mL).
7. Dopo 1 ora, al mezzo di coltura veniva aggiunta una soluzione di LPS da 10 μg/mL.
8. Dopo 24 ore di trattamento, il soprantantante è stato raccolto per ELISA e le cellule sono state prelevate per l'analisi RT-PCR.
   NOTA: L'LPS è stato selezionato per indurre una risposta infiammatoria grazie alla sua ben affermata capacità di attivare vie di segnalazione pro-infiammatorie nelle cellule epiteliali della prostata; la concentrazione (10 μg/mL) è stata scelta sulla base di studi precedenti che dimostravano un'induzione robusta delle citochine.

13. Isolamento dell'RNA totale

NOTA: Per prevenire la degradazione dell'RNA, sono stati indossati guanti e maschere durante tutta la procedura sperimentale, e sono state utilizzate punte di pipetta senza RNasi e tubi centrifughe.

1. Dopo l'intervento, risciacquare le cellule due volte con PBS.
2. Aggiungi 1 mL di reagente Trizol alle celle e mescolalo ripetutamente con una pipetta per garantire l'omogeneizzazione.
   ATTENZIONE: Eseguire tutte le procedure in una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata.
3. Trasferisci il lisato in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e lascialo incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
4. Successivamente, aggiungere 0,2 mL di cloroformio e far scorrere vigorosamente il campione.
5. Dopo averlo lasciato a temperatura ambiente per 5 minuti, centrifuga il campione a 10.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
6. Dopo la centrifugazione, trasferire con cura la fase acquosa superiore incolore in un tubo nuovo per microcentrifuga.
7. Introduci un volume uguale di isopropanolo pre-raffreddato, mescola accuratamente, poi incuba a temperatura ambiente per 10 minuti.
8. Centrifugare nuovamente il campione (4 °C, 10.000 × g, 10 min), poi scartare la fase liquida e trattenere il precipitato.
9. Risciacquare il pellet con 1 mL di etanolo pre-raffreddato al 75% e risospendere delicatamente tramite pipetta.
10. Eseguire una centrifugazione finale a 4 °C e 7.500 × g per 10 minuti, poi rimuovere il soprantantante e lasciare asciugare il pellet di RNA all'aria in un armadietto di biosicurezza.
11. Sciogliere l'RNA purificato in 50 μL di acqua trattata con DEPC.
12. Determinare la concentrazione di RNA, il rapporto A260/A280 e il rapporto A260/A230 utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop per valutare la purezza dell'RNA e garantire una contaminazione minima da proteine e solventi prima delle analisi a valle.

14. RT-PCR

1. Utilizzare 1 μg di RNA totale per preparare un sistema di reazione di trascrizione inversa da 20 μL.
2. Incubare il sistema di reazione a 42 °C per 15 minuti, seguito da 95 °C per 5 minuti, quindi raffreddare a 4 °C.
3. Diluire il cDNA risultante di 10 volte usando acqua distillata.
4. Prepara un sistema di reazione PCR da 20 μL utilizzando il cDNA diluito.
5. Programma il termociclatore e imposta una pausa iniziale a 95 °C per 60 secondi, seguita da 40 cicli a 95 °C per 15 secondi e 60 °C per 60 secondi.
6. Eseguire un'analisi della curva di fusione e registrare i valori CT di tutti i geni target e dei geni di riferimento dopo il completamento.
7. Utilizzare il metodo 2^(-ΔΔCT) per determinare i livelli di espressione normalizzati dei geni target.

15. Saggio ELISA

NOTA: Prendi il kit ELISA dal deposito e lascialo in equilibrio a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.

1. Preparare la soluzione standard secondo le istruzioni del produttore ed eseguire le diluizioni appropriate per standard, anticorpi biotinilati, coniugati enzimatici, e tampone di lavaggio.
2. Centrifugare il soprantantante raccolto in coltura cellulare (4 °C, 10.000 × g, 10 minuti) e raccogliere il soprandante.
3. Trasferire 100 μL delle diluizioni standard e dei campioni di prova ai pozzi pre-rivestiti.
4. Sigilla i pozzi con una striscia adesiva e incuba la piastra a 37 °C per 90 minuti.
5. Scartare il liquido dai pozzi e lavare la piastra usando una lavatrice automatica.
   NOTA: Imposta i parametri della lavatrice automatica a: 350 μL di tampone di lavaggio per pozzo, tempo di ammollo di 15 secondi tra la dispensazione e l'aspirazione, 5 cicli completi.
6. Dispensare 100 μL di soluzione attiva di anticorpi biotinilati in ciascun pozzo. Lascia incubare a 37 °C per 60 minuti.
7. Scartare la soluzione e lavare il piatto come descritto nella 15.5.
8. Pipetta 100 μL di soluzione di lavoro coniugata enzimatica per pozzo, poi incuba a 37 °C per 60 minuti.
9. Scartare la soluzione e lavare il piatto come descritto nella 15.5.
10. A ogni pozzo, aggiungi 100 μL di substrato cromogenico. Mantieni a 37 °C per 15 minuti proteggendo dalla luce.
11. Pipetta 100 μL di soluzione di stop per pozzo, poi mescola delicatamente.
12. Misura immediatamente la densità ottica (OD) a 450 nm.
13. Stabilire una curva standard tracciando i valori medi di OD rispetto alle concentrazioni standard usando il software Curve Expert.
14. Determinare la concentrazione di ciascun campione tramite interpolazione dalla curva standard usando il suo valore OD.

16. Analisi statistica

1. Utilizzare il software SPSS (Versione 20.0).
2. Importare il dataset in SPSS Statistics e definire le variabili in modo appropriato. Usa Analizza > Statistiche Descrittive> Esplora per calcolare la media e la deviazione standard (SD).
3. Usa le medie Analizza > Confronta > ANOVA unidirezionale per confronti tra gruppi multipli.
4. Ottieni i valori p direttamente dalle tabelle di output di test e riportali di conseguenza.
5. Presentare tutti i risultati come media ± SD e considerare differenze statisticamente significative quando p < 0,05.

Risultati

Identificazione di composti attivi e previsione dei bersagli

Questi risultati dimostrano l'efficacia della nostra farmacologia integrata di rete e dell'approccio in vitro per identificare e convalidare i target terapeutici dell'EMP nella prostatite. Una ricerca nel database TCMSP ha identificato 46 componenti bioattivi provenienti dalle erbe costituenti dell'EMP, corrispondenti a 178 potenziali bersagli. Dal database Genecards sono st...

Discussione

Questo protocollo integra la farmacologia di rete con la validazione sperimentale per fornire un quadro sistematico per l'indagine dei meccanismi terapeutici multicomponente. I passaggi critici includono uno screening accurato dei composti attivi utilizzando soglie definite (OB ≥ 30%, DL ≥ 0,18), costruzione affidabile della rete e selezione appropriata di modelli sperimentali di validazione. Una selezione attenta dei parametri nelle analisi bioinformatiche e un controllo rigoroso delle ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
KIT IL-6 ELISA UMANO	4Abio	CHE0009
TNF-e alfa umano; ELISA KIT	4Abio	CHE0019
Supplementi K-SFM	Procell	CM-0200
Lipopolisaccaridi	Solarbio	L8880
MTS	Promega	G1111
Sistema di trascrizione inversa	Promega	A3500
RWPE-1	Procell	CL-0200	RRID:CVCL_EQ24
Mezzo Completo per celle RWPE-1	Procell	CM-0200
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo	QPK-201
Reagente Trizol	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	15596026
tripsina-EDTA	Gibco (Thermo Fisher)	25200072