Articolo metodologico

PCR sovrapposta a un solo passaggio per la sintesi rapida di modelli di DNA a guida singola per il sistema CRISPR

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DOI:

10.3791/70369

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24 aprile 2026

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1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

In questo articolo

Sommario

Un metodo PCR sovrapposto in un solo passaggio che utilizza quattro primer consente la generazione rapida e a basso costo di template di DNA per la trascrizione in vitro degli sgRNA. Un rapporto di primer ottimizzato (50:5:1:50) produce sgRNA di alta qualità entro 5 ore, con la validazione funzionale dimostrata tramite test in vitro e attività di editing nelle cellule HEK293T.

Abstract

Il sistema CRISPR–Cas ha rivoluzionato l'editing genomico; tuttavia, i metodi convenzionali per generare RNA a guida singola (sgRNA) spesso prevedono lunghi passaggi di clonaggio o costosi kit di sintesi commerciali. Viene presentata una strategia PCR sovrapposta ottimizzata a un solo passaggio per la sintesi rapida ed economica dei template di DNA per la trascrizione in vitro dello sgRNA. Utilizzando quattro primer parzialmente sovrapposti che coprono il promotore T7, la sequenza guida specifica per il bersaglio e l'impalcatura dello sgRNA, i modelli a tutta lunghezza vengono assemblati in una singola reazione PCR senza clonazione. L'ottimizzazione sperimentale sistematica ha stabilito un rapporto di primer ottimale (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), minimizzando sottoprodotti non specifici e massimizzando la resa del prodotto a tutta lunghezza, come confermato dall'elettroforesi su gel di agarosio. Questo approccio è stato esteso con successo per generare modelli per sgRNA Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9), dimostrando un'applicabilità cross-system oltre Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Sebbene la sintesi chimica diretta degli sgRNA offra vantaggi come alta purezza, modifiche chimiche per migliorare la stabilità e ridotti effetti fuori bersaglio, rimane proibitivamente costoso per applicazioni ad alto rendimento o screening su larga scala che richiedono numerosi sgRNA. I saggi di clivagatura in vitro hanno dimostrato che gli RNA guida generati con questo metodo raggiungono efficienze di editing comparabili a quelle ottenute tramite clonaggio convenzionale basato su plasmidi. Inoltre, i complessi ribonucleoproteici assemblati con questi sgRNA e immessi nelle cellule HEK293T tramite elettroporazione hanno portato alla formazione rilevabile di indel nel locus bersaglio, confermando la funzionalità in vivo. L'analisi dei costi indica che questo metodo riduce sostanzialmente i costi di preparazione dei modelli rispetto ai kit di sintesi commerciali, riducendo al contempo i tempi di risposta da giorni a ore, fornendo così un approccio accessibile e scalabile per i laboratori impegnati nella ricerca genetica.

Introduzione

Il sistema CRISPR–Cas, derivato da un meccanismo immunitario adattativo in batteri e archee, ha rivoluzionato l'ingegneria genetica consentendo una modifica genomica precisa su organismi diversi 1,2. Un componente chiave è l'RNA a guida singola (sgRNA), un RNA chimerico che indirizza le nucleasi Cas verso specifici loci genomici; il suo design modulare consente il retargeting tramite la modifica di una sequenza protospaziatrice di circa 20 nucleotidi3. Oltre a SpCas9, sono state ampiamente adottate altre nucleasi Cas con proprietà distinte. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) è più piccolo, facilitando la somministrazione del virus adenoassociato (AAV) e quindi ampliando le opzionidi somministrazione 4. Ogni sistema richiede architetture specifiche di RNA guida, rendendo un metodo di sintesi versatile altamentedesiderabile 3.

I metodi tradizionali per generare RNA guida funzionali includono la clonazione basata su plasmidi, kit commerciali di sintesi di sgRNA o sintesi commerciale diretta deglisgRNA 5,6. La clonazione basata su plasmidi richiede molteplici fasi laboriose—digestione restrizionale, legazione, trasformazione e screening delle colonie—che richiedono tipicamente oltre 48ore 2,4,6. I kit commerciali di sgRNA, pur offrendo un flusso di lavoro semplificato (<5 h), rimangono proibitivamente costosi per applicazioni ad alta produttività, con un costo tipico di 35–45$ per reazione. La sintesi chimica diretta degli sgRNA offre vantaggi come alta purezza, modifiche chimiche per migliorare la stabilità e effetti off-targetridotti 7; tuttavia, è proibitivamente costosa (tipicamente 200–280$ per sgRNA) per applicazioni ad alto rendimento o screening su larga scala che richiedono centinaia di sgRNA.

Al contrario, il metodo PCR sovrapposto a un solo passaggio descritto qui completa la sintesi del modello in meno di 5 ore utilizzando primer standard a un costo di circa 5–8 dollari per sgRNA, rappresentando una riduzione sostanziale sia del tempo che del costo materiale. Inoltre, gli sgRNA prodotti con questo metodo raggiungono efficienze di editing comparabili a quelle generate dalla clonazione basata su plasmidi, come confermato da sagaggi di clivagatura in vitro . Un confronto di questi approcci è illustrato nella Figura 1.

La PCR A ESTENSIONE DI SOVRAPPOSIZIONE (OE-PCR) fornisce una strategia rapida e indipendente dalla ligasi per assemblare frammenti di DNA8. Questo approccio è stato adattato per la sintesi di template sgRNA utilizzando primer sovrapposti. In una reazione a un solo passo usando quattro primer parzialmente sovrapposti, avviene un legame competitivo: gli innesco esterni (AF1 e Tracr-R) definiscono i confini di amplificazione, mentre gli innesco interni (AF2 e AF3) devono essere diluiti per garantire un'estensione ordinata da entrambe le estremità verso il centro. Nonostante questo quadro teorico, un parametro critico che influenza l'efficienza dell'assemblaggio—il rapporto ottimale degli innetti—non è stato sistematicamente studiato. Inoltre, la più ampia applicabilità di tali metodi OE-PCR tra diversi sistemi CRISPR rimane poco esplorata.

Per affrontare queste limitazioni, è stato progettato uno studio per ottimizzare e validare un metodo PCR sovrapposto a un solo passaggio per la sintesi del template sgRNA. Il rapporto di primer ottimale è stato stabilito tramite un disegno sperimentale strutturato, utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio per identificare condizioni che producono un singolo prodotto di dimensioni corrette. Dopo l'ottimizzazione, la versatilità del metodo è stata valutata su due sistemi CRISPR ampiamente utilizzati (SpCas9 e saCas9), con un'amplificazione efficace di entrambi i template. La validazione funzionale tramite saggi di clivagatura in vitro ha dimostrato che gli sgRNA generati con questo metodo raggiungono efficienze paragonabili a quelle ottenute tramite clonazione basata su plasmidi.

Per valutare ulteriormente la funzionalità in un contesto cellulare, lo sgRNA di SpCas9 è stato complesso con la proteina Cas9 per formare complessi ribonucleoproteici (RNP) e introdotto nelle HEK293T cellule tramite elettroporazione. L'editing genomico in un locus endogeno è stato valutato utilizzando un saggio di Endonucleasi T7 I (T7EI), con schemi di scoltura su gel di agarosio che indicano la formazione rilevabile di indel in vivo. Collettivamente, questi risultati dimostrano che questo metodo produce in modo affidabile modelli di sgRNA funzionali di alta qualità. Il protocollo seguente descrive la procedura dettagliata utilizzando SpCas9 come esempio rappresentativo, con template primer forniti per l'adattamento ad altre nucleasi Cas.

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Protocollo

L'uso della linea cellulare HEK293T disponibile in commercio (ATCC CRL-3216) è stato condotto in conformità con le linee guida del Comitato Etico del Primo Ospedale Popolare della città di Chenzhou, Università della Cina del Sud. I reagenti, il software e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Progettazione di sequenze target sgRNA

  1. Identificare la regione genomica target utilizzando strumenti online consolidati (ad esempio, CRISPRscan, CHOPCHOP o Broad Institute CRISPick)3.
  2. Accedi al server web CHOPCHOP al https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. Inserire le informazioni sul gene target e selezionare il sistema CRISPR/Cas appropriato (ad esempio, EGFR per CRISPR/Cas9) (Figura 2A).
  4. Esaminare la tabella di output, inclusi rank, sequenza target, localizzazione genomica, strand, contenuto GC (%), auto-complementarità, siti off-target previsti (MM0, MM1, MM2, MM3) e punteggio di efficienza (Figura 2B).
  5. Seleziona una sequenza RNA guida con alta efficienza sul bersaglio e bassa attività off-target prevista.
  6. Registra la sequenza finale del target sgRNA per la progettazione del primer (ad esempio, sequenza target EGFR: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (Figura 2B).

2. Sintesi e preparazione di quattro primer sovrapposti

  1. Progetta quattro primer oligonucleotidici (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) con regioni sovrapposte come segue (Figura 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [obiettivo seq] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    NOTA: Sostituire [target seq] nell'innesco AF1 con la sequenza ottenuta nel passaggio 1.6.
  2. Sintetizza gli innesco su scala di 25 nmol con purificazione standard per desalinizzazione.
  3. Risospendere i primer essiccati in acqua priva di nucleasi a una concentrazione di stocco di 100 μM. Centrifugare a 5000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente.

3. Ottimizzazione della concentrazione dei primer e PCR sovrapposta a un solo passo per la sintesi del template sgRNA

  1. Prepara le miscele di primer con concentrazioni variabili di AF2 e AF3 secondo la Tabella 1. Mantieni AF1 e Tracr-R a 10 μM.
  2. Preparare le reazioni PCR in tubi senza nucleasi da 0,2 mL secondo la Tabella 2. Utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà.
  3. Mescola delicatamente pipettando cinque volte. Non vortice. Centrifuga a 5000 × g per 1 minuto.
  4. Esegui la PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 3.

4. Elettroforesi e recupero di template di DNA

  1. Prepara un gel di agarosio al 2% sciogliendo 2 g di agarosio in 100 mL di tampone 1× TAE. Raffredda a 50–60 °C, aggiungi 5 μL di colorazione di acido nucleico e fondi il gel.
  2. Lascia solidificare il gel per 30 minuti a temperatura ambiente.
  3. Carica un prodotto PCR da 10 μL miscelato con 2 μL di buffer di carico 6×. Include una scala di DNA da 100 bp.
  4. Esegui l'elettroforesi a 100 V per 30–40 minuti.
  5. Visualizza sotto illuminazione UV. Conferma che la Condizione 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) produce una singola banda di ~120 bp (Figura 4A).
  6. Utilizzare concentrazioni di innesco ottimizzate: AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0,2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. Elimina la fascia bersaglio usando un bisturi sterile. Limita l'esposizione ai raggi UV a ≤30 secondi.
    NOTA: conservare le fette di gel a −20 °C per un massimo di una settimana o procedere immediatamente.

5. Purificazione dei modelli di DNA

  1. Purificare il DNA usando un kit di estrazione gel secondo le istruzioni del produttore10.
  2. DNA eluto in 20–30 μL acqua preriscaldata (60 °C) priva di nucleasi.
  3. Misurare la concentrazione di DNA. Resa tipica: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1,8–2,0.
    NOTA: Conservare il DNA purificato a −20 °C per un massimo di 1 anno.

6. Trascrizione in vitro e purificazione dello sgRNA

  1. Assemblare la reazione di trascrizione utilizzando un kit di sintesi per RNA T7 (Tabella 4). Preparare sulghiaccio 11.
    NOTA: Utilizzare materiali privi di RNasi e decontaminare tutte le superfici.
  2. Incubare a 37 °C per 16 ore.
  3. Aggiungi 1 μL di DNasi I e incuba a 37 °C per 15 minuti.
  4. Purificare sgRNA usando un kit di puliziaRNA 12.
  5. Eluto in acqua priva di nucleasi da 30–50 μL.
  6. Quantificare sgRNA. Resa attesa: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1,9–2,1.
    NOTA: Conservare lo sgRNA a −80 °C per un massimo di 1 anno.

7. Test di spacco in vitro per verificare l'attività dello sgRNA

  1. Preparare e purificare il DNA bersaglio. Regolare la concentrazione a 60 ng/μL13.
  2. Assemblare la reazione di scindimento (Tabella 5)—pre-incubare senza DNA a 25 °C per 30 minuti. Includere un controllo negativo.
  3. Aggiungi 1 μL di DNA bersaglio.
  4. Incubare a 37 °C per 2 ore.
  5. Aggiungi 4 μL di buffer di carico a 6× per fermare la reazione.
  6. Fai funzionare i prodotti su un gel di agarosio al 2% a 100 V per 30–40 minuti.
  7. Visualizza sotto luce UV. Conferma la clivatura (ad esempio, 617 bp → 414 bp + 203 bp) (Figura 4C).

8. Validazione cellulare dell'editing Cas9 guidato da sgRNA

  1. Preparare il complesso ribonucleoproteico (RNP) mescolando proteina Cas9 e sgRNA a un rapporto molare di 1:2. Combinare 10 μL di Cas9 (4 mg/mL), 280 μL di sgRNA (60 ng/μL) e 200 μL di DMEM. Incubare per 15 minuti.
  2. Coltivare HEK293T cellule fino a ~80% di confluenza. Prelevare e regolare a 3 × 106 cellule per campione.
  3. Combina il complesso RNP con le cellule e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Trasferire su una cuvetta elettroporativa da 2 mm. Elettroporare a 115 V, 4 ms, un impulso (575 V/cm). Aggiungere immediatamente 10 mL di mezzo completo e trasferire su una piastra a 6 pozzi.
  5. Incubare a 37 °C con 5% di CO2 per 48 ore.
  6. Estrarre il DNA genomico dalle cellule trattate e di controllo. Misurare la concentrazione.
    NOTA: Conservare il DNA a −20 °C per un massimo di 6 mesi.
  7. Amplificare il luogo del bersaglio tramite PCR (Tabella 6 e Tabella 7).
    NOTA: Dimensione prevista del prodotto: 617 punti base per l'EGFR.
  8. Verifica i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2%. Purifica la fascia corretta e quantifica il DNA.
  9. Eseguire la formazione eteroduplex (Tabella 8 e Tabella 9).
  10. Aggiungi 1 μL di T7 Endonucleasi I e incuba a 37 °C per 15 minuti. Inattiva a 85 °C per 10 minuti.
  11. Aggiungi il buffer di carico e usa un gel di agarosio al 2%.
  12. Visualizza sotto luce UV. Conferma la formazione dell'indel (617 pb→ 414 pbb 203 pb) (Figura 4D).

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Risultati

L'applicazione con successo del protocollo PCR sovrapposto a un solo passaggio produce una singola banda di DNA affilata della dimensione attesa quando analizzata tramite elettroforesi su gel di agarosio.

Rapporti subottimali degli innelli, in particolare quelli con concentrazioni eccessive di inneschi interni (AF2 e AF3), producono bande aggiuntive maggiori rispetto al prodotto atteso, indicando un'amplificazione non specifica o formazione di innesco-dimero, ...

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Discussione

Viene descritto un protocollo snello ed economico per la sintesi dei template di DNA sgRNA tramite una strategia PCR sovrapposta in un solo passaggio. Questo metodo elimina la necessità di costruzione e clonaggio dei plasmidi, riducendo il tempo di preparazione del modello da diversi giorni a circa 5 ore. Un aspetto chiave di questo approccio è l'ottimizzazione sistematica del rapporto di innesco, determinato come 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R), corrispondente a concentrazioni ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Progetto di Ricerca Sanitaria della Commissione Sanitaria Provinciale di Hunan (grant numero W20243264), dalla Natural Science Foundation della Provincia di Hunan (grant number 2023JJ50368), dal Key Research Project del Dipartimento dell'Istruzione della provincia di Hunan (grant numero 24A0607) e dal Innovative Team Project del First People's Hospital di Chenzhou (grant numero CX202103).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100 bp DNA LadderTIANGENMD109Marcatore di dimensione del DNA per elettroforesi
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MReagente di amplificazione PCR
50 bp DNA LadderTIANGENMD108Marcatore di dimensione del DNA per piccoli frammenti
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Buffer di caricamento del campione per elettroforesi
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219Purificazione del DNA dal gel di agarosio
Agarose I Thermo Scientific 17850Preparazione del gel di agarosio
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicStrumento di progettazione sgRNA
CentrifugeHENGNUO2-16RCentrifugazione del campione
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023ASupplemento per coltura cellulare
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682Reagenti per la preparazione della soluzione tampone TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/Strumento di progettazione sgRNA
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Incubazione di colture cellulari di mammiferi
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/Strumento di progettazione sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Medium per coltura cellulare
dsDNaseThermo Scientific EN0771Rimozione del modello di DNA dopo la trascrizione
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Elettroporazione delle cellule
EDTA Na2BioSharpBS108Reagenti per la preparazione della soluzione tampone TAE
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Incubazione a temperatura controllata
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNElettroforesi su gel di agarosio
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Visualizzazione e imaging del gel
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Nucleasi Cas9 per l'editing del genoma
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Isolamento del DNA genomico
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040STrascrizioni in vitro di sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834Amplificazione PCR
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cQuantificazione degli acidi nucleici
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211Visualizzazione del DNA nel gel di agarosio
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Amplificazione PCR ad alta fedeltà
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptOligonucleotidi per l'assemblaggio del modello di sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083Reagenti per la preparazione della soluzione tampone TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01Purificazione dell'RNA

Riferimenti

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