Sono stati processati campioni di tessuto di endarterectomia coronarica per isolare singoli nuclei utilizzando un protocollo di dissociazione ottimizzato. L'integrità dei nuclei isolati è stata convalidata attraverso tre approcci complementari: colorazione di esclusione blu di tripano per valutare l'integrità della membrana, microscopia confocale basata su DAPI per confermare la morfologia nucleare e citometria a flusso per quantificare la resa e la purezza nucleare.
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Articolo metodologico
Isolamento a nucleo singolo dal tessuto endorerectomico coronarico di pazienti con bypass coronarico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'aterosclerosi è una condizione infiammatoria cronica e progressiva caratterizzata dall'accumulo di placca nelle pareti delle arterie. Durante la formazione della placca, alcune lesioni diventano instabili, chiamate placche ad alto rischio, e possono causare infarto miocardico (MI). Una placca aterosclerotica comprende cellule muscolari lisce, cellule endoteliali, cellule immunitarie, cellule adipose e cellule necrotiche, ognuna delle quali può causare la rottura della placca. È fondamentale studiare l'eterogeneità cellulare all'interno delle placche aterosclerotiche per comprendere meglio i meccanismi alla base dell'instabilità della placca. Presentiamo un protocollo facilmente riproducibile per isolare e convalidare nuclei da tessuto endorerectomico coronarico umano ottenuto da pazienti sottoposti a un intervento di bypass coronarico (CABG). Tutti i tessuti vengono conservati su ghiaccio umido nel mezzo del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) per preservare l'integrità cellulare prima del prelievo. I campioni di tessuto vengono finemente tritati e poi delicatamente interrotti con un micro pestello nel tampone di lisi per lisare le cellule e liberare i nuclei. I nuclei isolati vengono quindi valutati per integrità e resa utilizzando il saggio di esclusione tripan blu in un microscopio invertito composto. La colorazione DAPI consente la visualizzazione dei nuclei intatti tramite microscopia confocale, mentre la citometria a flusso fornisce una quantificazione basata sulla fluorescenza per valutare la resa dell'isolamento nucleare e convalidare la popolazione nucleare. A differenza dei metodi tradizionali di isolamento tramite dissociazione a singola cellula, l'isolamento nucleare riduce lo stress cellulare e mantiene l'ambiente trascrittomico nativo, prevenendo così cambiamenti nell'espressione genica. La preparazione nucleare di alta qualità ottenuta con questo metodo è compatibile con applicazioni a valle come il sequenziamento di RNA a nucleo singolo (snRNA-seq).
Introduzione
La malattia cardiovascolare aterosclerotica (ASCVD) è la principale causa mondiale di morte e disabilità e, nonostante i grandi progressi terapeutici, il suo carico rimaneintatto. L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica della parete arteriosa, guidata da interazioni complesse e dinamiche tra diverse popolazioni cellulari che insieme orchestrano la progressione silenziosa dalla malattia subclinica precoce agli eventi cardiovascolari (CV) che alterano lavita 2.
Nelle arterie medie e grandi, l'accumulo di depositi di colesterolo all'interno dei macrofagi è un segno distintivodell'aterosclerosi 3. La placca aterosclerotica è composta da acidi grassi, colesterolo, cellule infiammatorie, calcio, fibrina, cellule muscolari lisci, cellule endoteliali e detriti cellulari all'interno delsubendotelio 4. Le placche aterosclerotiche sono classificate in due tipi: a basso rischio e ad alto rischio. Le placche ad alto rischio sono identificate per la loro tendenza a scatenare un evento cardiovascolare successivo, tipicamente attraverso meccanismi come l'erosione o la rottura dellaplacca 5.
Le caratteristiche delle placche ad alto rischio includono grandi nuclei lipidici, diverse cellule infiammatorie, meno cellule muscolari lisce, un sottile cappuccio fibroso, microcalcificazione, emorragia intraplacca, neovasi e un nucleonecrotico 6. La rilevazione delle placche ad alto rischio viene eseguita clinicamente utilizzando modalità di imaging non invasive e invasive, ovvero la tomografia coronarica computerizzata (CCTA) e la tomografia di coerenza ottica (OCT),rispettivamente 7,8. Nonostante i numerosi progressi nell'imaging cardiovascolare, è ancora difficile prevedere la rottura della placca aterosclerotica che causa l'infarto miocardico (MI), e non è sempre utile in contesticlinici 9.
Nonostante decenni di ricerca, mancano ancora biomarcatori circolanti affidabili che possano identificare specificamente i fenotipi delle placche ad alto rischio, lasciando una lacuna critica nella nostra gestione clinica dell'aterosclerosi. Questo sottolinea la necessità di strategie molecolari in grado di caratterizzare queste placche a un livello biologico piùfondamentale 7,10. In questo contesto, i marcatori basati sull'RNA hanno attirato notevole attenzione, poiché possono catturare l'intricata attività trascrizionale che avviene all'interno del microambiente dellaplacca 11. Gli sviluppi recenti nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) si sono dimostrati particolarmente potenti, offrendo una risoluzione senza precedenti per profilare singole cellule all'interno delle placche aterosclerotiche e scoprire popolazioni cellulari distinte, modelli di espressione genica e vie molecolari alla base della vulnerabilitàalla placca 12,13. Nonostante questi sviluppi, esistono poche conoscenze sui processi regolatori, sulle interazioni e sull'importanza funzionale dei vari tipi cellulari implicati nello sviluppo dell'aterosclerosi14.
Quando il carico aterosclerotico è grave e diffuso, la rivascolarizzazione chirurgica diventa la strategia terapeutica definitiva. L'endarterectomia coronarica (EC) è un complemento chirurgico al bypass coronarico (CABG) in cui la placca aterosclerotica viene rimossa meccanicamente dalle arterie coronarie diffusamente malate per consentire l'innesto bypass e ottenere una completa rivascolarizzazionemiocardica 15,16. Le placche aterosclerotiche e i campioni di endarterectomia sono particolarmente difficili da lavorare perché contengono abbondante tessuto necrotico, depositi lipidici, fibrina e calcificazioni. Quando questi tessuti vengono scomposti per l'analisi, generano detriti consistenti che ostruiscono filtri e sistemi microfluidici, rendendo estremamente difficile l'isolamento di singole cellulevitali 17,18. Infatti, uno studio sulla placca carotide ha rilevato che le cellule vitali rappresentavano meno dell'1% di tutte le particelle dopo l'elaborazione del tessuto; il resto era semplicemente detrito diplacca 18.
A complicare ulteriormente questa sfida, le placche aterosclerotiche esistono in uno stato di stress metabolico e ossidativo cronico, in cui le cellule sottoposte ad apoptosi, senescenza e altri processi degenerativi rendono le membrane cellulari sempre più fragili e suscettibili a disturbi, rendendo estremamente difficile l'isolamento di singole cellulevitali 18,19,20 . La digestione meccanica ed enzimatica necessaria per preparare i campioni per lo scRNA-seq spesso danneggia queste cellule già compromesse, riducendo ulteriormente la vitalità e portando a bassi tassi di cattura cellulare. Questo processo tende anche a perdere selettivamente popolazioni cellulari fragili o rare, introducendo un bias significativo sia nei dati trascritomici sia nei tipi cellulari rappresentati nei risultati finali. Questo problema diventa ancora più evidente nelle placche calcificate o fortemente malate, dove le dure condizioni di elaborazione necessarie per degradare il tessuto causano ulteriori danni alla vitalitàcellulare 18,21,22.
Al contrario, il nucleo rimane strutturalmente intatto anche in queste condizioniavverse 23. Ciò è dovuto principalmente all'involucro nucleare, un doppio strato lipidico rinforzato da lamine nucleari (Lamin A/C e Lamin B), che fornisce rigidità meccanica e resistenza agli stress osmotici, enzimatici, fisici che che disturbano facilmente la membranaplasmatica 24,25. La lamina nucleare preserva anche la morfologia nucleare anche quando il citoplasma circostante è gravementecompromesso 26. Questo rende il sequenziamento a nucleo singolo dell'RNA (snRNA-seq) un'alternativa più pratica e affidabile al sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) per il profilo del tessuto aterosclerotico27. Catturando informazioni trascrizionali da nuclei intatti anziché da cellule intere, snRNA-seq aggira le limitazioni imposte dalla scarsa vitalità cellulare e dall'alto contenuto di detriti, consentendo una profilazione trascrittomica più accurata e completa del microambiente dellaplacca 18.
Pertanto, in questo studio, presentiamo un protocollo ottimizzato di isolamento dei nuclei sviluppato specificamente per il tessuto di endarterectomia coronarica, incorporando la lisi non ionica a base di detersivo e la durata della lisi empiricamente regolata in base al grado di calcificazione tissutale, per ottenere costantemente nuclei di alta qualità con integrità strutturale e RNA preservata, adatte all'analisi successiva dello snRNA-seq.
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Protocollo
Il presente studio è stato condotto con approvazione e in conformità con le linee guida del Comitato Etico Umano dell'Istituto di Cardiologia e Centro di Ricerca U. N. Mehta (EC/Approvazione/26/Cardio/14/12/2024) e della Gujarat Biotechnology University (GBU_IHEC/2023/006). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima della raccolta del campione. I pazienti sottoposti a un bypass coronarico con endarterectomia coronarica sono stati selezionati per il presente studio. Dopo la rimozione chirurgica, il tessuto endarterectomico veniva immediatamente inserito in un mezzo RPMI senza siero, mantenuto a 4 °C e trasportato in laboratorio entro circa 12 ore tramite un crioviale. Consulta la Tabella dei Materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati nel seguente protocollo.
1. Isolamento dei nuclei
NOTA: Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio e usa materiali sterili. Prepara tutti i buffer con freschezza.
- Lava il fazzoletto una o due volte con un medium RPMI senza siero per rimuovere macchie e frammenti di sangue. Usando una pinza sterile, trasferisci il tessuto su una piastra di Petri sterile e registra il peso.
- Utilizzando una lama chirurgica (n. 10), trita il tessuto in piccoli pezzi di dimensioni ∼1mm 3 .
- Prepara un tampone di lisi di 1 mL combinando 10 mM di Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM di NaCl, 3 mM di MgCl2 (utilizzando soluzioni standard di 1 M per ogni componente), 0,1% (v/v) Nonidet P-40 in acqua priva di nucleasi. Aggiungi i componenti in ordine sequenziale nel seguente ordine: prima acqua priva di nucleasi, poi Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ e NP-40 infine, per evitare la schiuma.
NOTA: Il tampone di lisi deve essere preparato fresco il giorno dell'uso e tenuto sempre freddo sul ghiaccio. Non congelare. - Aggiungi un tampone di lisi raffreddato da 1 mL al tessuto in un tubo microcentrifuga da 5 mL.
- Lisa il tessuto sul ghiaccio usando un micropestello applicando una forza delicata e costante e facendo roteare il micropestello alternativamente in senso orario e antiorario. Continuare la lisi per circa 30 minuti, assicurandoti che il campione rimanga freddo per tutta la durata.
NOTA: Lisa il tessuto finché non diventa torbido. Usa una punta da 1000 μL per mescolare delicatamente con pipetta. - Filtrare la soluzione con un colino di dimensioni porose da 100 μm in un tubo centrifuga da 15 mL per rimuovere detriti e pezzi di tessuto.
NOTA: Il filtrato dovrebbe apparire meno torbido con detriti visibili trattenuti sul colino. - Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante a secchio.
NOTA: Un pellet visibile dovrebbe formarsi sul fondo del tubo. - Rimuovi il surnante usando una punta di pipetta a canna normale senza disturbare il pellet.
- Prepara il lavaggio dei nuclei e il tamponaggio di risospensione combinando albumina sirica bovina (BSA) all'1% (usando il 10% della soluzione stock), inibitore RNase a 0,2 U/μL (usando soluzione stock da 20 U/μL) in 1X soluzione tampone fosfato Dulbecco (DPBS). Aggiungi i componenti in sequenza nel seguente ordine: prima DPBS, poi BSA e infine inibitore RNasi.
NOTA: Il buffer deve essere preparato fresco il giorno dell'uso e tenuto sempre freddo sul ghiaccio. Non congelare. - Risospendi il pellet con lavaggio dei nuclei e tamponamento di risospensione. Raffredda il buffer sul ghiaccio prima di usarlo.
- Valutare l'efficienza della lisi e la vitalità cellulare colorando con 5 μL di blu di tripano e contando con un emocitometro.
NOTA: Se sono ancora presenti celle vitali, centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, poi ripetere le sezioni 3-10. - Filtrare la soluzione utilizzando un filtro di poro da 30 μm in un tubo centrifuga da 15 mL per rimuovere detriti e grumi.
- Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante a secchio.
- Rimuovere il sovrandante usando una punta di pipetta a canna normale, poi risospendere il pellet in 1 mL di lavaggio dei nuclei e tamponatore di risospensione.
2. Caratterizzazione dei nuclei isolati
- Colorazione blu di tripano per valutare l'integrità dei nuclei.
- Prendere 15 μL della sospensione dei nuclei isolati in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungi 5 μL di colorante blu trypan (0,4% w/v) e mescola delicatamente pipettando.
- Incuba a temperatura ambiente per 5 minuti per permettere una verniciatura corretta.
- Carica 10 μL della miscela colorata su un emocitometro.
- Osservare al microscopio rovesciato composto per esaminare la morfologia e contare il numero di nuclei.
- Analisi della citometria a flusso della sospensione a nuclei singoli
- Prendi 1 mL di sospensione a nuclei isolati e centrifuga la sospensione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C usando un rotore a secchio oscillante.
- Rimuovere il sovrantantante usando una punta di pipetta a calibro normale e risospendere il pellet in un tampone FACS da 200 μL (1X PBS e 1% BSA).
- Dividere 200 μL di nuclei risospesos in due aliquote: mantenere 100 μL come controllo non colorato e utilizzare 100 μL come campione colorato.
- Aggiungere 1 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 mg/mL) al campione colorato per ottenere una concentrazione finale di 10 μg/mL. Mescola delicatamente e incuba a temperatura ambiente al buio per 5 minuti prima dell'analisi citometrica del flusso.
- Nel citometro di flusso utilizzato per questo studio, si utilizza il laser viola a 405 nm e si rileva usando 448/45 nm. Esegui prima il campione di controllo non colorato e acquisisci un minimo di 10.000 eventi della popolazione totale.
- Imposta la tensione a 183 V per la diffusione diretta (FSC), 300 V per la diffusione laterale (SSC) e 400 V per V450 (laser DAPI). Imposta la soglia a 10.000 per FSC.
NOTA: Tutte le impostazioni di tensione e guadagno degli strumenti sono costanti tra i campioni per mantenere la coerenza. - Tracciare l'area di scatter in avanti (FSC-A) rispetto all'altezza di scatter in avanti (FSC-H) per distinguere i singoletti dai doppietti e aggregati. Disegna una porta attorno a eventi che mostrano una relazione lineare per mantenere solo i nuclei singolo.
- Generare un grafico bivariato di FSC-A rispetto all'area di dispersione laterale (SSC-A). Si applica una porta ampia che copre l'intera popolazione scatter, poiché i nuclei isolati tipicamente mostrano un profilo scatter eterogeneo senza sottopopolazioni distinte.
- Crea un grafico di densità 2D (pseudo colore) di SSC-A rispetto all'area violetta di 450 nm (V450-A). Usa il controllo non colorato per definire la fluorescenza di fondo e guidare la posizione precisa delle gate. Identifica e porta la popolazione DAPI⁺ distinta corrispondente ai nuclei intatti.
NOTA: Poiché viene utilizzato un singolo fluorocromo (DAPI), non è necessaria la compensazione della fluorescenza.
- Imaging dei nuclei isolati tramite microscopia confocale
- Prendere 50 μL di sospensione dei nuclei e aggiungere 1 μL di DAPI (1 mg/mL) al campione colorato per ottenere una concentrazione finale di 10 μg/mL, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti al buio prima dell'imaging confocale.
- Montare 5 μL di sospensione dei nuclei colorati su una vetrata di vetro pulita e coprirla con un slip di copertura.
NOTA: Evitare la fissazione per preservare la morfologia nucleare. - Visualizza i nuclei usando un microscopio confocale invertito. Apri il software del microscopio confocale e osserva prima in campo luminoso 10X, poi passa al campo luminoso 40X.
- Acquisire immagini confocali utilizzando un microscopio confocale a scansione laser equipaggiato con un rivelatore spettrale e obiettivi PLAN APO λD 40X (NA 0,95, RI 1,0). Eccitare DAPI usando un laser da 405 nm e raccogliere l'emissione tra 429 e 474 nm.
- I parametri di imaging erano i seguenti:
- Modalità rivelatore: Multi-canale (GaAsP)
- Scanner: Galvano unidirezionale
- Modalità scansione: Banda
- Media linea: 2X
- Risoluzione: 1024 × 1024 pixel
- Tempo di sosta: 2,0 μs
- Dimensione del foro stenopeico: 47,7 μm
- Potenza laser: 0,1-9,3% (a seconda dell'intensità del campo)
- Guadagno del rivelatore: 37,8-45,9%
- Zoom: 1.0X
- Calibrazione: 0,43-0,58 μm/pixel
- Acquisire tutte le immagini con la fotocamera AX con modalità di diafonia minima sotto configurazioni ottiche identiche, e il sistema di messa a fuoco perfetto (PFS) dovrebbe essere attivo durante l'imaging per mantenere la stabilità del piano z.
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Risultati
Il tessuto endarterectomico coronarico umano è stato raccolto da pazienti sottoposti a interventi di chirurgia CABG. Il tessuto è stato pesato e processato per l'isolamento dei nuclei, e ulteriori nuclei isolati sono stati confermati tramite citometria a flusso e microscopia confocale (Figura 1).
Valutazione della qualità dell'isolamento dei nuclei con il blu di tripano
Il tessuto tenuto in mezzo RPMI è stato pesato e ha misurato 247,8 mg. Il t...
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Discussione
Un flusso di lavoro ottimizzato per l'isolamento dei nuclei dal tessuto endarterectomico coronarico umano è descritto nell'attuale protocollo. Il protocollo di isolamento nucleare descritto qui è stato specificamente progettato per superare le limitazioni critiche nell'ottenere cellule vitali e intatte da placche aterosclerotiche coronariche avanzate. A differenza degli approcci convenzionali scRNA-seq che si basano su una digestione enzimatica aggressiva e su dissociazione
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interessi da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'Indian Council of Medical Research (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) e dalla collaborazione dell'Istituto di Cardiologia e Centro di Ricerca Mehta delle Nazioni Unite di Ahmedabad. Khushi Jani ringrazia la University Grant Commission (UGC) e il Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Governo dell'India, per aver conferito la qualifica congiunta CSIR-UGC NET (NTA Reference No.: 241620143543).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100 & mu; Filtro m | Miltenyi Biotech | 130-098-463 | |
| 30 & mu; Filtro m | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | |
| Albumina Sirica Bovina | HiMedia | TC546-25G | |
| Centrifuga | MPW | NA | https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r |
| Microscopio composto | Nikon | NA | Microscopio rovesciato Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2) |
| Microscopio Confocale | Nikon | NA | Microscopio confocale rovesciato Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series) |
| Copertine | HiMedia | BG011C | |
| Fiala di campione CRYOCHIL a bocca larga | Tarsons | 883191 | |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | |
| DPBS | Gibco (termofischer) | 10010-023 | |
| Tubo centrifuga (15 mL) | Tarsons | 546021 | |
| Citometro a flusso | BD in Biologia | 663029 | BD FACSLyric (3L12C Instrument CEIVD) |
| Emocitometro | Axibio | CCB 100 | |
| Tubo microcentrifuga (1,5 mL) | Tarsons | 500010C | |
| Tubo microcentrifugo (5 mL) | Tarsons | 500050 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028-100ML | |
| Micro pelistino | Tarsons | 160020 | |
| NaCl | Sigma | S9888-500G | |
| NP-40 | HiMedia | MB143-100ML | |
| Acqua priva di nucleasi | Gibco (termofischer) | W4502-1L | |
| Inibitore RNasi | Sigma | 333540201 | |
| RPMI 1640 | Gibco (termofischer) | 11875093 | |
| Diapositiva | Riviera | 72910135 | |
| Tris-HCl | Sigma | T2194-100ML | |
| Trippan blu & nbsp; | Sigma | 302643-25G |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
