Articolo di ricerca
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La profilazione multi-omica del Buti Huatan Tang (BTHTT) nella broncopneumopatia cronica ostruttiva rivela il suo potenziale di modulare l'asse metabolico dell'ormone tiroideo IL-1R2/IL-1β. Questo lavoro fornisce un quadro per ulteriori validazioni meccanicistiche dei componenti bioattivi del BTHTT, stabilendo una base per futuri studi di intervento causale necessari a confermare questo asse.
Questo studio ha utilizzato un quadro multi-omico e biologico computazionale per indagare il potenziale terapeutico della formula della Medicina Tradizionale Cinese (MTC) Buti Huatan Tang (BTHTT) contro la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Sono stati osservati miglioramenti fisiologici significativi in un modello di ratto dopo l'intervento BTHTT. L'analisi istologica ha mostrato un'inversione del danno patologico polmonare, mentre saghi biochimici e trascrittomica hanno confermato la normalizzazione dei livelli di IL-1β e IL-1R2 . Inoltre, il profiling metabolico ha rivelato che il BTHTT correggeva le interruzioni nei livelli di ormoni tiroidei T3 e T4. È stata osservata una correlazione negativa tra l'asse IL-1β/IL-1R2 e questi ormoni tiroidei, indicando che la loro regolazione è associata all'effetto terapeutico della formula. Oltre alle misurazioni dirette, algoritmi di machine learning hanno identificato dieci geni signature della BPCO provenienti da database clinici. L'analisi dell'arricchimento delle vie suggerisce che il BTHTT possa agire attraverso interazioni citochina-citochina-recettore e vie di sintesi dell'ormone tiroideo. Inoltre, sebbene siano stati identificati in vivo 283 componenti, composti come tanshinone IIA e cryptotanshinone sono attualmente considerati sostanze candidate attive. Il loro ruolo di motori principali è supportato da un modello in cui si legano stabilmente a IL-1R2; questa inferenza si basa su simulazioni di aggancio molecolare e dinamica molecolare (MD) piuttosto che su isolamento sperimentale diretto. Nel complesso, i dati supportano un modello in cui il BTHTT esercita un effetto multi-bersaglio sulla BPCO modulando l'infiammazione e l'omeostasi metabolica. Questo approccio integrato fornisce una base scientifica raffinata per l'applicazione clinica del BTHTT e mette in evidenza percorsi specifici per future convalidazioni sperimentali.
La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), una delle malattie respiratorie più comuni nella pratica clinica, è diventata la terza causa di morte a livello globale grazie al suo tasso di disabilità estremamente elevato e alle risacerbazioni acutericorrenti 1. La BPCO fu un fattore significativo che portò alla perdita di capacità lavorativa nella popolazione e a un forte aumento dei costi di assistenza familiare, con perdite sociali ed economiche che superarono di gran lunga quelle della maggior parte delle malattiecroniche 2. Nell'"Iniziativa Healthy China 2030", la BPCO è stata elencata come una malattia chiave per la prevenzione e il trattamento. A causa di una comprensione incompleta dei meccanismi alla base della BPCO, l'uso combinato di broncodilatatori e corticosteroidi è rimasto il trattamento principale. Sebbene questo approccio abbia fornito un sollievo relativamente evidente dai sintomi, non può impedire il progressivo declino della funzione polmonare. Inoltre, l'uso prolungato dei corticosteroidi aumenta inevitabilmente l'incidenza delle reazioni avverse, influenzando ulteriormente l'efficacia a lungo termine dei farmaci e la tolleranzadei pazienti 3. Gli studi hanno dimostrato che anche con la tripla terapia, il 28%–31% dei pazienti sperimenta ancora esacerbazioni acute o peggioramento dei sintomi. Pertanto, lo sviluppo di farmaci efficaci per la BPCO rimane una questione chiave e primaria nelle ricerche attuali sullaBPCO 4.
Per rispondere a queste esigenze, sono state sviluppate formule classiche della MTC come Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin e Bu Fei Tang. Tra questi, il BTHTT è stato particolarmente noto per i suoi effetti significativi nella tonificazione dei polmoni, nell'aumento dell'energia e nella risoluzione del catarro per alleviare la tosse 5,6,7,8. Il BTHTT è stato ampiamente utilizzato nel trattamento clinico della BPCO, non solo per la sua notevole efficacia e i minimi effetti collaterali, ma anche per il suo potenziale di invertire il progressivo declino della funzione polmonare. Aveva grande promessa in contesti clinici e sociali e aveva il potenziale per uno "sviluppo secondario" come farmaco principale, con un significativo valore scientifico edeconomico 9,10,11,12. Tuttavia, a causa della mancanza di ricerche scientifiche sistematiche e a lungo termine, gli studi sul BTHTT hanno generalmente sofferto di una comprensione poco chiara della sua base componente e di obiettivi fondamentali non identificati. Fondamentalmente, ciò è dovuto a carenze significative nella ricerca sul meccanismo principale e sulla potenziale base terapeutica della BTHTT.
In risposta a questa caratteristica, integrando molteplici tecnologie omiche come metabolomica e trascritomica, nonché metodi di mining multi-algoritmico, concentrandosi sulle principali correlazioni tra geni chiave caratteristici e vie metaboliche chiave nel microambiente del corpo 13,14,15 non può solo esplorare l'essenza del trattamento, ma anche valutare l'efficacia sinergica dei componenti attivi. Un'attenzione particolare è posta sull'asse ormonale tiroideo, poiché ricerche emergenti indicano che la disfunzione tiroidea è una frequente comorbidità nella BPCO, spesso correlata a un aumento dell'infiammazione sistemica e a una funzione muscolare respiratoria compromessita. Modulare questo asse potrebbe rappresentare una nuova via per ripristinare l'omeostasi metabolica nelle malattiepolmonari 16,17.
In sintesi, questo studio ha adottato un approccio a tre fronti che combina l'integrazione multi-omica con la biologia computazionale, basato sul presupposto della corrispondenza tra sindrome e formula. Da un lato, utilizzava tecniche di farmacochimica sirica della MTC per identificare i componenti ematici del BTHTT in condizioni efficaci. D'altra parte, concentrandosi sui geni caratteristici chiave della BPCO, ha utilizzato una metabolomica tissutale completa per scoprire biomarcatori di malattie provenienti da piccole molecole endogene e per costruire una valutazione precisa degli effetti complessivi della formula. Nel frattempo, combinato con l'estrazione multi-algoritmo e l'analisi di identificazione trascrivomica, ha identificato i geni caratteristici chiave regolati da BTHTT in condizioni efficaci e ha condotto un'analisi di correlazione tra i geni caratteristici chiave e le vie metaboliche chiave. La potenziale base della sostanza terapeutica è stata selezionata tramite aggancio molecolare e analisi della dinamica molecolare.
Basandosi sul nostro framework multi-omico e sul profilo farmacologico del BTHTT, questo studio propone le seguenti previsioni testabili. Modulazione antinfiammatoria: L'intervento BTHTT ridurrà significativamente i marcatori di infiammazione sistemica e polmonare, in particolare normalizzando l'asse di espressione IL-1β/IL-1R2 per mitigare i danni tissuti. Restauro metabolico: il BTHTT altererà i segnali nella via di sintesi dell'ormone tiroideo, portando a una correzione misurabile dei livelli di T3/T4 e a un successivo miglioramento dello stato metabolico del microambiente polmonare. Restauro Metabolico: Il BTHTT altera i segnali nella via di sintesi dell'ormone tiroideo, portando a una correzione misurabile dei livelli di T3/T4 e a un successivo miglioramento dello stato metabolico del microambiente polmonare.
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NOTA: I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Acquisizione e preelaborazione dei dati clinici
Per indagare le firme molecolari della BPCO, sono stati recuperati dataset trascrittomici dal database Gene Expression Omnibus (GEO). Sono stati selezionati in totale cinque dataset: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 e GSE222965. I dati grezzi e i file di annotazione della piattaforma sono stati scaricati per la mappatura sonda-gene. Quando più sonde miravano un singolo gene, il valore massimo di espressione veniva mantenuto. Le matrici di espressione genica risultanti (righe come geni, colonne come campioni) sono state unite in un unico dataset di scoperta. Per tenere conto delle variazioni tecniche tra diverse piattaforme di microarray e coorti di studio, è stata eseguita la correzione a batch-effect utilizzando l'algoritmo ComBat del pacchetto sva R. L'efficacia della correzione è stata convalidata tramite grafici di Analisi dei Componenti Principali (PCA). Dopo la correzione batch, il dataset di discovery fuso è stato utilizzato per l'analisi differenziale. I geni differenzialmente espressi (DEG) tra pazienti con BPCO e controlli sani sono stati identificati utilizzando il pacchetto limma. Le soglie di significato sono state fissate a |logFC| ≥ 1 e p ≤ 0,05.
Per identificare i geni caratteristici più robusti, sono stati integrati tre algoritmi indipendenti di apprendimento automatico. Per garantire l'affidabilità dei modelli e prevenire perdite di dati, il processo di selezione delle caratteristiche veniva annidato all'interno dei cicli di validazione incrociata, dove applicabile, e il dataset di discovery era strettamente separato dai set di validazione indipendenti. Il modello LASSO veniva applicato ai DEG utilizzando il pacchetto glmnet. Abbiamo utilizzato una validazione incrociata a 10 volte per determinare il parametro di penalità ottimale. Il valore ottimale del parametro di penalità corrispondente all'errore minimo di validazione incrociata è stato selezionato come soglia per identificare i geni delle caratteristiche fondamentali. La SVM è stata utilizzata per classificare i geni in base al loro potere discriminativo. È stata implementata una strategia di validazione incrociata a 10 volte per identificare il punto di minimo errore di generalizzazione, determinando così il numero ottimale di geni caratteristici. Il pacchetto randomForest veniva utilizzato per classificare i DEG in base alla loro Accuratezza Media Diminuita e al loro indice Gini. I geni con i punteggi di importanza più elevati sono stati selezionati come caratteristiche correlate alla malattia.
L'intersezione delle caratteristiche identificate da LASSO, SVM e randomForest è stata presa per definire i geni caratteristici finali di base. Le prestazioni diagnostiche di questi geni sono state valutate utilizzando l'analisi della curva Receiver Operating Characteristic (ROC). L'Area Sotto la Curva (AUC) e gli Intervalli di Confidenza (IC) al 95% associati sono stati calcolati utilizzando il pacchetto pROC. Un gene era considerato di alto valore diagnostico se l'AUC > 0,70. Infine, i livelli di espressione e l'accuratezza diagnostica di questi geni sono stati ulteriormente validati in un set di validazione indipendente per garantire la generalizzazione dei risultati.
Utilizzando PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) e drugbank (https://go.drugbank.com/), sono stati ottenuti in totale 12 profili specifici di farmaci, come LABA, LAMA, SABA, SAMA, Fluticasone propionate, Budesonide, Beclomethasone, Fluticasone, Salmeterolo, Umeclidinium, Vilanterol, Teofilina. I target compilati sono stati calibrati utilizzando il database Uniprot (https://www.uniprot.org/), durante il quale i geni non umani sono stati rimossi e i target duplicati non validi sono stati eliminati per ottenere nomi genici standardizzati. Inserendo la parola chiave "cronica ostruttiva pneumopneumologica", "BPCO" nei database GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) e DisGENET (https://www.disgenet.org/), sono stati recuperati i target correlati alla malattia. Tutti i target dei tre database sono stati consolidati in un file Excel, i geni duplicati sono stati rimossi e i dati sono stati calibrati utilizzando il database Uniprot per ottenere le informazioni finali sul gene target della malattia.
Sviluppo di modelli di machine learning
Un framework di machine learning multi-algoritmico è stato costruito utilizzando sequenzialmente i pacchetti R glmnet, e1071 e randomForest. In particolare, è stata eseguita una regressione LASSO per la riduzione della dimensionalità basata su penalità, l'analisi Support Vector Machine (SVM) è stata utilizzata per valutare gli errori di validazione basati sul raggruppamento del campione, e la Foresta Random è stata utilizzata per filtrare le caratteristiche in base ai punteggi di importanza. Questo processo ha prodotto visualizzazioni diagnostiche corrispondenti, incluse curve di validazione incrociata e grafici a bolle di importanza genica. Dopo la costruzione del modello, è stata eseguita un'analisi del diagramma di Venn sui set genici identificati da questi algoritmi multipli per estrarre i geni delle caratteristiche di "intersezione" sovrapposti, aumentando così l'affidabilità dei potenziali biomarcatori. La matrice di espressione di questi geni di intersezione è stata poi estratta per visualizzare le differenze di espressione tra gruppi tramite grafici di violino. Infine, le curve ROC sono state generate tramite anelli iterativi per ogni gene per calcolare l'Area Sotto la Curva (AUC), convalidando il loro valore diagnostico come biomarcatori candidati.
Induzione per modelli animali
Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico Animale della Guizhou Medical University (2303411) e ha seguito le linee guida ARRIVE e i regolamenti sul benessere animale. Un totale di 72 maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) di grado SPF (230 ± 20 g). Dopo 1 settimana di alloggiamento adattivo in condizioni standard (25 ± 1 °C, 50 ± 5% di umidità, 12 ore di ciclo chiaro-buio), i ratti sono stati divisi casualmente in gruppo di controllo (gruppo C) (n = 24) e gruppo modello (gruppo M) (n = 48).
Il gruppo M è stato sottoposto a modellazione a doppio fattore: esposizione intermittente al fumo di sigaretta (9 settimane, 6 giorni a settimana, 3 sigarette di grado scientifico al giorno divise in 2 sessioni, 30 min per seduta) e instillazione intratracheale di LPS (200 μg per instillazione, una volta ogni due settimane)18,19. Il gruppo C riceveva un volume equivalente di soluzione salina normale. Dopo una modellazione di successo, i gruppi sono stati divisi casualmente in gruppo M (n = 12), gruppo BTHTT ad alta dose (gruppo H) (alta, 1× dose clinica, n = 12) e gruppo BTHTT a bassa dose (gruppo L) (bassa, 1/2× dose clinica, n = 12), con intervento gavage continuo per 2 settimane. I gruppi C e M sono stati dati con acqua distillata in modo sincrono.
I parametri di peso corporeo e attività spontanea sono stati registrati settimanalmente. Al termine della modellazione e del trattamento, sono stati raccolti tessuto polmonare, siero e siero e liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF). I livelli di marcatori infiammatori (cioè TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN e MCP-1) sono stati misurati utilizzando ELISA secondo le istruzioni del kit. Sono state inoltre effettuate analisi di patologia tissutale e multi-omica.
Somministrazione del trattamento
Buti Huatan Tang (BTHTT) è composto da nove erbe medicinali tradizionali cinesi: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix di Astragali, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.), J. Presl (Cinnamomi Cortex, 15 g), Angelica sinensis (Oliv). Diels (Angelicae Sinensis Radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Semin di Raphani, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Seme, 10 g), e Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). Le erbe sono state immerse in acqua a 10 volte il loro peso combinato per 30 minuti e successivamente decoctate per 1 ora. Il decocto veniva filtrato, il filtrato veniva raccolto e diviso in tre porzioni uguali per la somministrazione orale.
In base alla sicurezza clinica e all'efficacia, la dose standard di BTHTT per adulti era di 1,57 g∙kg-1∙day-1 secondo le linee guida cliniche sui farmaci. Considerando il fattore di conversione della dose per i ratti, che indicava che la dose standard del farmaco per ratti era 6,3× la dose standard umana, il corrispondente gruppo H per i ratti era fissato a 9,9 g∙kg-1∙day-1, mentre il gruppo L era fissato a metà di questa dose (4,95 g∙kg-1∙day-1). Dato che il volume concentrato finale di BTHTT era di 50 mL, il volume somministrato per il gruppo H nei ratti era di circa 1,6 mL, mentre per il gruppo L circa 0,8 mL. Il farmaco veniva somministrato una volta al giorno tramite gavage orale.
Collezione di tessuti e BALF
Ai punti finali sperimentali (Settimana 9 e Settimana 11), i ratti sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 5% (1 mL/100 g). Il sangue veniva raccolto dalla vena porta, lasciato riposare per 30 minuti a temperatura ambiente, e poi centrifugato a 13.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Il sovrantantante veniva immagazzinato a -80 °C. I tessuti polmonari venivano rapidamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 °C. Il BALF veniva raccolto tramite tre lavaggi consecutivi con PBS freddo.
Analisi della trascritomica
L'RNA totale è stato estratto dal tessuto polmonare e controllato dalla qualità utilizzando (A260/A 280 > 1,8) (RIN ≥ 7,0. Furono costruite librerie di sequenziamento dell'RNA: l'mRNA veniva arricchito con oligo(dT), frammentato e usato per sintetizzare cDNA doppio filamento, che poi veniva legato agli oligonucleotidi adattatori e amplificato tramite PCR. Le librerie venivano quantificate e controllate di qualità prima del sequenziamento. Inclusi l'ispezione della distribuzione dei contenuti, l'analisi della distribuzione della densità FPKM di ciascun campione e l'analisi complessiva della valutazione della qualità dell'RNA-seq20.
I dati grezzi di trascritomica generati dalla piattaforma di sequenziamento venivano processati utilizzando script Perl per rimuovere sequenze adattatori e letture di bassa qualità (letture con Q ≤ 25 basi che rappresentavano > 60% o N rate > 5%). Dopo questo processo di filtraggio sono state ottenute letture pulite. Le letture pulite sono state allineate al genoma di riferimento utilizzando HISAT2 e i livelli di espressione genica sono stati quantificati per calcolare i valori FPKM. È stata effettuata un'analisi di espressione differenziale (con criteri di screening di |log2FC| > 1 e p-adj < 0,05). L'annotazione dei fattori di trascrizione si basava su database Animal TFDB o Pfam/DBD, che corrispondevano agli ID geni e alle informazioni sui dominiproteici 21.
È stata impiegata una strategia di mappatura genica ortologa per garantire rigore metodologico nella validazione tra specie. Questa strategia prevedeva il recupero di ortologhi nei ratti per i geni umani fondamentali (ad esempio, SRPX2, IL-1R2, TFF3) utilizzando i database NCBI HomoloGene e Ensembl BioMart. La selezione è stata limitata a coppie di geni che mostravano una chiara relazione di mappatura "uno-a-uno" e un'elevata identità di sequenza proteica. Nei casi in cui erano presenti più candidati, è stata data preferenza alle coppie ortologiche certificate dall'HGNC. Per garantire un'elevata precisione di rilevamento, sono stati progettati specifici primer RT-qPCR basati sulle sequenze di mRNA degli ortologhi identificati sui ratti. I criteri di validazione sono stati definiti dalla coerenza nella direzione dell'espressione e dalla verifica funzionale. Coerenza nella direzione dell'espressione: In un modello di BPCO indotto dal fumo nel ratto, la RT-qPCR ha mostrato che le tendenze di espressione dei geni target nel tessuto polmonare del ratto erano pienamente coerenti con quelle osservate nei dataset clinici GEO umani. I geni che mostrano la stessa polarità di cambiamento tra specie erano considerati conservatori come biomarcatori di malattia. Verifica patologica: Una volta espressa la coerenza dell'espressione, è stata eseguita un'analisi di correlazione per verificare il coinvolgimento di questi geni nell'evoluzione patologica della BPCO.
Flusso di lavoro metabolomico
Il tessuto polmonare (20–50 mg) è stato omogeneizzato in metanolo-acetonitrile-acqua preraffreddata (2:2:1, v/v) e sonicizzato in un bagno di ghiaccio. L'omogeneato è stato centrifugato a 13.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Il soprantantante è stato concentrato nel vuoto, ridisciolto in acetonitrile-acqua (1:1, v/v) e filtrato attraverso una membrana di 0,22 μm per l'analisiLC-MS 22.
La separazione cromatografica è stata ottenuta utilizzando una colonna UPLC a base di amide (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm). La temperatura della colonna fu mantenuta a 25 °C. La fase mobile consisteva in (A) acqua contenente 25 mM di acetato di ammonio e 25 mM di ammoniaca, e (B) acetonitrile. La portata era impostata a 0,5 mL/min e il volume di iniezione era di 2 μL. Il programma di eluzione del gradiente era il seguente: 0–0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, diminuzione lineare di B dal 95% al 65%; 7–8 minuti, diminuzione lineare di B dal 65% al 40%; 8–9 min, B mantenuto al 40%; 9–9,1 min, aumento lineare di B dal 40% al 95%; 9,1–12 min, B è rimasto al 95%. Durante tutta l'analisi, i campioni sono stati mantenuti a 4 °C nell'autocampionatore. Per garantire la stabilità del sistema e l'affidabilità dei dati sperimentali, i campioni venivano analizzati in sequenza casuale, con campioni di controllo qualità (QC) intervallati nella coda. L'analisi della spettrometria di massa è stata effettuata utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad ultra-alte prestazioni (UHPLC) collegato a uno spettrometro di massa. I campioni sono stati ionizzati tramite ionizzazione elettrospray (ESI) sia in modalità ionica positiva che negativa. Le impostazioni della sorgente ESI e della MS erano le seguenti: gas nebulizzatore (Gas 1) impostato a 50, gas ausiliario (Gas 2) a 2, temperatura della sorgente ionica a 350 °C e tensione di spruzzatura (ISVF) a 3.500 V in modalità ionica positiva e 2.800 V in modalità ionica negativa. L'intervallo di massa per MS1 fu impostato da 70 a 1.200 Da, con una risoluzione di 60.000 e un tempo di accumulo di scansione di 100 ms. Per MS2 è stata utilizzata acquisizione dipendente dai dati (DDA) con energia di collisione a gradini. L'intervallo di massa per MS2 fu anch'esso impostato da 70 a 1.200 Da, con una risoluzione di 60.000 e un tempo di accumulo di scansione di 100 ms. Il tempo di esclusione dinamica era fissato a 4 secondi.
I dati grezzi di metabolomica venivano convertiti nel formato mzXML e poi processati per l'allineamento dei picchi, la correzione dei tempi di ritenzione e l'estrazione dell'area dei picchi. Il flusso di lavoro di preprocessing dei dati includeva i seguenti passaggi: Innanzitutto, i picchi ionici con un tasso mancante > il 50% venivano rimossi. In secondo luogo, i valori mancanti rimanenti sono stati imputati utilizzando l'algoritmo KNN. In terzo luogo, le caratteristiche metaboliche con deviazione standard relativa (RSD) >50% sono state scartate. La qualità dei dati sperimentali è stata valutata utilizzando analisi a componenti principali (PCA) e clustering dei campioni di QC. Le analisi successive hanno incluso statistiche univariate (ad esempio, t-test), statistiche multivariate (PLS-DA), screening differenziale dei metaboliti (VIP > 1 e p < 0,05) e analisi di arricchimento delle vie KEGG (test ipergeometrico)23,24.
Stabilimento di metodi analitici per componenti in vivo e in vitro
Preparazione dei campioni di BTHTT per test in vitro : il BTHTT è stato estratto tramite decoction in acqua (2 x 30 min), concentrato a 1,1–1,2 g/mL, e poi liofilizzato. Prima dell'analisi, 600 μL della soluzione in polvere liofilizzata venivano miscelati con 400 μL di metanolo, ridisciolti al 40% di metanolo e centrifugati per raccogliere il soprandante.
Preparazione dei campioni di BTHTT per test in vivo : Il siero è stato deproteinizzato mescolando con metanolo (1:1) e precipitando a −20 °C per 30 minuti, seguito da centrifugazione per 20 minuti. Il soprantantante è stato essiccato sottovuoto e ridisciolto al 40% di metanolo per ottenere il campione finale. Per la preparazione di campioni di siero a vuoto + BTHTT, è stata applicata una quantità adeguata di siero a vuoto con il soprandanante in vitro BTHTT, e le fasi rimanenti sono state eseguite come descritto.
I campioni venivano separati utilizzando un sistema UHPLC dotato di una colonna UPLC a fase inversa (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm). La temperatura della colonna fu mantenuta a 35 °C e la portata fu impostata a 0,3 mL/min. La fase mobile era composta da (A) 0,1% di acido formico in acqua e (B) 0,1% di acido formico in acetonitrile. L'eluzione a gradiente è stata eseguita come mostrato nella Tabella 1.
Un spettrometro di massa fu utilizzato per l'acquisizione sia degli spettri MS1 che MS2. Lo spettrometro di massa era accoppiato al sistema UHPLC e operava sia in modalità ESI positiva che negativa. I parametri ESI erano i seguenti: tensione di spruzzatura 3.800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), pressione del gas nella guaina 45 arb, pressione ausiliaria del gas 20 arb, temperatura del tubo di trasferimento ionico 320 °C e temperatura del vaporizzatore 350 °C. La modalità di rilevamento era impostata su scansione completa/MS2 dipendente dai dati (Full-MS/dd-MS2) con risoluzioni di 60.000 per MS1 e 15.000 per MS2. I primi 10 ioni MS1 sono stati selezionati per la frammentazione MS/MS con energie di collisione normalizzate a gradini di 20, 40 e 60. L'intervallo di massa per MS1 è stato impostato da 90 a 1.300 Da.
Per l'analisi in vivo , inclusi campioni di gruppo bianco, campioni di gruppo dosato e campioni di gruppo bianco + BTHTT, sono stati iniettati con precisione 6 μL di ciascun campione. Per l'analisi in vitro del BTHTT, sono stati iniettati 2 μL del campione. Ogni lotto di campioni a vuoto e di gruppo dosato è stato iniettato una volta, mentre i campioni di gruppo bianco + BTHTT sono stati iniettati in triplice, e i campioni BTHTT sono stati iniettati in quintuplicato.
I dati nel formato mzXML venivano elaborati e i composti identificati sulla base di un database locale commerciale di spettrometria di massa TCM ad alta risoluzione. I criteri di identificazione sono stati stabiliti come segue: un errore di massa di <25 ppm per MS1 e un punteggio di corrispondenza > 0,7 per MS2 (dove il punteggio rifletteva la somiglianza degli ioni frammentati, con ≥0,7 come soglia affidabile)25,26. L'analisi statistica includeva il conteggio e la classificazione dei composti (ad esempio, flavonoidi, alcaloidi), che veniva eseguita in combinazione con annotazioni dal database di spettrometriadi massa 27.
Docking molecolare e simulazione MD
Per indagare i potenziali modi di legame tra le proteine caratteristiche identificate e i loro corrispondenti ligandi, è stato effettuato un aggancio molecolare in silico . Le strutture tridimensionali delle piccole molecole sono state recuperate dal database PubChem e le loro configurazioni geometriche ottimizzate. Le strutture cristalline delle proteine target sono state ottenute dal RCSB Protein Data Bank (PDB). Utilizzando PyMOL, molecole d'acqua ed eteroatomi sono stati rimossi e sono stati estratti liganti co-cristallizzati per definire le coordinate del sito attivo. Venivano aggiunti atomi di idrogeno e cariche di Gasteiger assegnate tramite software. Furono eseguite simulazioni di attracco, generando 15 conformazioni indipendenti per ogni run. La conformazione con l'energia di legame più bassa è stata selezionata per ulteriori analisi. Per caratterizzare rigorosamente le interazioni non covalenti, i complessi recettore-ligando sono stati analizzati utilizzando il Profiler di Interazione Proteina-Ligando (PLIP). NOTA: È importante sottolineare che questi risultati di attracco forniscono supporto strutturale per potenziali interazioni molecolari e costituiscono una base per ulteriori raffinamenti dinamici; tuttavia, non costituiscono prove autonome di efficacia biologica.
Per valutare la stabilità e l'evoluzione conformazionale dei complessi proteina-ligando previsti in condizioni fisiologicamente rilevanti, sono state effettuate simulazioni di dinamica molecolare utilizzando il pacchetto software GROMACS. I file topologici sia per le proteine che per i liganti sono stati generati sulla base del campo di forza GROMOS96 43a1. Ogni complesso era posizionato al centro di una scatola dodecaedra, mantenendo una distanza minima di 1,0 nm dai bordi della scatola, e solvato utilizzando il modello ad acqua SPC. Per garantire la neutralità elettrica, sono stati aggiunti ioni sodio o cloruro al sistema secondo necessità. La minimizzazione dell'energia veniva eseguita utilizzando l'algoritmo di discesa più ripida fino a quando la forza massima era inferiore a 1.000,0 kJ∙mol-1∙nm-1. Il sistema veniva quindi bilanciato in due stadi: per prima cosa, veniva impiegato un insieme NVT per riscaldare il sistema a 300 K su 100 ps usando un termostato a V-rescale; in secondo luogo, un insieme NPT veniva utilizzato per stabilizzare la pressione a 1 bar su 100 ps utilizzando un barostato di Parrinello-Rahman. Le simulazioni di produzione sono state eseguite per una durata totale di 10 ns con un intervallo temporale di 2 fs. Le interazioni elettrostatiche a lungo raggio venivano calcolate utilizzando il metodo Particle Mesh Ewald (PME), mentre le interazioni di van der Waals a corto raggio e le interazioni elettrostatiche venivano gestite con un raggio di taglio di 1,2 nm. Per garantire l'affidabilità delle simulazioni, furono eseguite tre esecuzioni indipendenti dove possibile. La stabilità dei complessi è stata valutata quantitativamente calcolando la deviazione quadratica media (RMSD) e la fluttuazione quadratica media (RMSF) degli atomi della spina dorsale proteica rispetto alla struttura iniziale. Il raggiungimento di un plateau nel profilo RMSD è stato utilizzato come criterio principale per l'equilibrio del sistema e la stabilità strutturale.
Analisi statistica generale
In questo esperimento, i calcoli di gruppo sono stati effettuati utilizzando test t o analisi unidirezionale della varianza (ANOVA).
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Previsione dei geni caratteristici chiave nella BPCO
Dopo la correzione a effetto batch dei dati clinici provenienti da più piattaforme di microarray (File Supplementare 1–Figura Supplementare S1), è stata eseguita un'analisi di espressione differenziale. Sono stati identificati 34 geni candidati (32 alzati e 2 downregolati), tra cui SRPX2, CLDN10 e TFF3 (Figura 1A
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La sintesi e il mantenimento dei livelli di ormone tiroideo sono significativi per i pazienti con BPCO e vanno ben oltre la semplice funzione endocrina, influenzando profondamente la progressione della malattia, lo stato nutrizionale, la funzione polmonare e la prognosicomplessiva 31,32,33. Soprattutto durante le esacerbazioni acute, i pazienti con BPCO spesso manifestavano uno stato simile all'...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo lavoro è stato supportato dal Programma Nazionale Chiave di R&S della Cina (Grant No. 2022YFC2503003), dal Progetto del Fondo Giovanile della National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82405036) e dal Programma Provinciale di Talenti Innovatori di Alto Livello del Guizhou (Grant No. GCC[2023]048). Ulteriori finanziamenti sono stati forniti dai progetti Presentazione e Guida del Laboratorio Chiave Statale per la Scoperta e l'Utilizzo dei Componenti Funzionali nella Medicina Tradizionale Cinese (Grant No. JBGS-FAMP202304), il fondo aperto del Laboratorio Chiave Statale per la Scoperta e l'Utilizzo dei Componenti Funzionali nella Medicina Tradizionale Cinese (Grant n. Qian Jiao Ji [2023] n. 112), e il Programma di Scienza e Tecnologia della Commissione Provinciale della Salute del Guizhou (Grant n. gzwkj2024-516). È stato inoltre ricevuto supporto dal lancio dei Talenti di Alto Livello presso la Guizhou Medical University (Grant No. XBH J [2022] No. 008), il Progetto Chiave del Programma di Ricerca e Sviluppo (Grant n. LSLSKL20240101) del Laboratorio Nazionale Chiave di Formule Classiche e Integrazione e Innovazione della MTC moderna, e del Programma Nazionale e Provinciale di Sviluppo del Team di Talento per l'Innovazione Scientifica e Tecnologica dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guizhou (Grant No. TD Hopes [2023] 005). Questo studio è stato anche parzialmente finanziato dalla Guizhou Provincial Natural Science Foundation (Grant No. ZK [2024] 404).
Ringraziamo con gratitudine i database pubblici utilizzati in questo studio, tra cui GEO, TCMSP, Uniprot, GeneCards, OMIM, DisGENET, GNPS, ReSpect, MassBank, PubChem e ChemSpider, per aver fornito preziose risorse dati. Ringraziamo inoltre il supporto tecnico delle strutture principali e dei colleghi coinvolti nelle analisi UPLC-MS, trasscrittomica e dinamica molecolare.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile (di grado cromatografico) | Merck, Germania | 1499230-935 | |
| Bioanalizzatore Agilent 4150 | Agilent Technologies, USA | ||
| Acetato di ammonio | SIGMA, Germania | SRE0035-20230321 | |
| Angelica sinensis (Oliva) Diels (Angelicae Sinensis Radix), | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240807 | |
| Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix Astragali), | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240601 | |
| ChemOffice | Software per disegno della struttura chimica e modellazione molecolare | ||
| Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex), | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240901 | |
| Centrifuga Eppendorf 5430 R | Eppendorf, Germania | ||
| Sigarette sperimentali | Harbin Taihua, Cina | 20230208 | |
| GraphPad Prism 8 | Software per analisi statistica e grafica | ||
| Sigarette Huangshan | Esperimenti di sigarette di grado scientifico per l'esposizione al fumo | ||
| IL-1 e beta; Kit ELISA | Biotecnologia Collegata agli Enzimi di Shanghai, Cina | E-EL-R0012c-20230522 | |
| Piattaforma di sequenziamento Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | ||
| Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Seme) | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240201 | |
| Lepidium sativum L. (Sperma di Raphani) | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240301 | |
| Lipopolisaccaride (LPS) | Shandong Huino Pharmaceutical, Cina | 20230315 | |
| Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium mahooniae) | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240301 | |
| Metanolo (di grado cromatografico) | Fisher, USA | DK745764 | |
| Spettrofotometro Nanodrop ND-2000 | Thermo Scientific, USA | ||
| Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium) | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240510 | |
| Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix), | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20250201 | |
| Fluorometro Qubit 4.0 | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Kit per la costruzione della biblioteca RNA | ABclonal, USA | RK20301-20230415 | |
| SMINA | Software di attracco molecolare | ||
| Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma) | Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Cina | 20240902 | |
| Registratore di attività spontanea per piccoli animali (KW-ZF) | Nanchino Karlvin Biotechnology, Cina | ||
| Pentobarbital sodico | Società di Procura di Reagenti Sperimentali di Shanghai, Cina | 20230412 | |
| TNF-α Kit ELISA | Biotecnologia Collegata agli Enzimi di Shanghai, Cina | E-EL-R2856c-20230522 | |
| Database della sclerosi multipla di medicina tradizionale cinese (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.) | Database spettrale di spettrometria di massa della medicina tradizionale cinese commerciale | ||
| Reagente Trizol | Magen, Cina | 20230508 | |
| Colonna AMIDE BEH UPLC | Colonna analitica UHPLC basata su amidi | ||
| Colonna UPLC HSS T3 | colonna analitica UHPLC a fase inversa (tipo T3) | ||
| Sistema Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS | Thermo Scientific, USA | ||
| Vanquish sistema MS UHPLC-Q-Exactive HF-X | Thermo Scientific, USA |
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