Generazione di colture organoidi tumorali dalla linea cellulare dell'adenocarcinoma polmonare

Sommario

Qui presentiamo un metodo rapido, puro ed economico per stabilire organoidi tumorali dalla linea cellulare A549, adatti a test preliminari e scopi educativi.

Abstract

Qui descriviamo un protocollo per generare organoidi tumorali derivati da linee cellulari (CDTO) dalla linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano A549. Il protocollo prevede l'inserimento di cellule A549 espanse in 2D in Matrigel e il loro mantenimento in un mezzo di coltura 3D per la coltura a lungo termine. La densità di semina raccomandata di 500 cellule/μL è stata determinata a supportare una formazione organoide coerente. I CDTO risultanti sono stati caratterizzati da colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) e immunofluorescenza (IF). Gli organoidi hanno mantenuto un'alta espressione dei marcatori adenocarcinoma polmonare Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1), proteina di adesione E-Cadherin (ECAD) e proteina del citoscheletro Keratin 7 (KRT7). Inoltre, l'espressione della proteina a giunzione stretta Zona Occludens 1 (ZO-1) ha mostrato una polarità disregolata degli organoidi tumorali. Questo protocollo offre una piattaforma organoide tecnicamente semplice, economica e puramente tumorale per la ricerca sull'adenocarcinoma polmonare. La sua semplicità e riproducibilità lo rendono anche adatto all'insegnamento in laboratorio universitario, dove può aiutare gli studenti ad acquisire tecniche fondamentali di coltura di organoidi tumorali 3D in un programma di laboratorio limitato.

Introduzione

Gli organoidi sono in vitro. strutture tridimensionali auto-organizzate (3D) che provengono da cellule staminali e sono in grado di ripetere complessità biologiche di organi reali in misura^{considerevole 1}. Le cellule che costituiscono organoidi possono derivare da cellule staminali pluripotenti indotte o cellule derivate dal tessuto, queste ultime includendo cellule staminali/progenitrici normali, cellule differenziate e cellule^{tumorali 2}. Rispetto ai tradizionali sistemi di coltura bidimensionale e ai modelli animali, gli organoidi possono imitare più da vicino le caratteristiche fisiologiche del corpo umano offrendo al contempo una maggiore flessibilità sperimentale. Di conseguenza, la tecnologia degli organoidi è stata ampiamente applicata nello sviluppo di farmaci³, nella medicina^{personalizzata 4} e nella modellazione delle^{malattie 5}.

Numerosi studi hanno stabilito modelli organoidi per un ampio spettro di tumori, tra cui^{colorettale 6}, prostata⁷,^{pancreas 8},^{gastrico 9}, epatico¹⁰,^{biliare 11},^{seno 12} e tumori neuroendocrini. Tuttavia, una delle principali sfide nella ricerca sugli organoidi tumorali è il mantenimento della purezza. Ad esempio, uno studio sul cancro polmonare a cellule non piccole ha rivelato che solo il 17% degli organoidi costituiti era puramente tumorale, poiché i campioni tumorali spesso contengono una miscela di cellule normali e maligne difficili da separare completamente prima della^{coltura 13}. Questo problema di impurità può causare l'eliminazione delle cellule tumorali per l'escrescimento di cellule non tumorali, interferire con le letture dei test di suscettibilità ai farmaci e portare ad analisi molecolari imprecise, come RT-qPCR o Western blot, dove RNA e proteine delle cellule tumorali vengono diluiti da proporzioni incontrollabili di cellule contaminanti.

Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno esplorato la progettazione di mezzi di coltura selettivi che sfruttano la riduzione della dipendenza delle cellule tumorali da determinati fattori di crescita, inibendo così la crescita cellulare normale e favorendo l'espansione delle cellule^{tumorali 14}. Inoltre, si stanno sviluppando strategie come la selezione cellulare o l'identificazione monoclonale per costruire organoidi tumorali puri.

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi tumorali derivati da linee cellulari (CDTO) utilizzando la linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano A549, che è stata segnalata come parziale proprietà simili a cellule staminali tumorali, oltre a un aumento della clonogenicità, del potenziale proliferativo e della tumorigenicità in vitro.¹⁵. I CDTO risultanti hanno mantenuto l'espressione dei biomarcatori specifici per la linea di linea Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1)¹⁶, la proteina di adesione E-Cadherin (ECAD⁾¹⁷ e la proteina del citoscheletro Keratin 7 (KRT7)¹⁶ e hanno mostrato caratteristiche fisiologiche caratteristiche degli organoidi tumorali. Questo modello è facile da stabilire e contiene componenti cellulari tumorali definite, rendendolo adatto a ricercatori nuovi nel campo degli organoidi tumorali o a chi è sfidato dalla perdita dell'identità tumorale nelle colture primarie di organoidi tumorali. Le applicazioni potenziali includono test preliminari di suscettibilità ai^{farmaci 18}, studi sul microambiente^{tumorale 19} e formazione educativa sulle tecniche di coltura 3D.

Protocollo

La temperatura ambiente in laboratorio è di 22–24 °C ed è chiamata RT. Si consiglia l'uso di una centrifuga a secchio oscillante. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Istituzione di organoidi primari A549

1. Preparazione e prelievo delle cellule A549
   1. Prepara una piastra da 6 cm contenente cellule A549 al 70% di confluenza. Preriscaldare TrypLE e PBS a 37 °C. Calcola la quantità di cellule e il volume di Matrigel secondo il disegno sperimentale e la Tabella 1.
      1. Lo scongelamento ha richiesto aliquote Matrigel con ridondanza per almeno due pozzi sul ghiaccio per almeno 60 minuti. Prepara le placche trattate con polistirene e TC per permettere alle cupole di rimanere emisferiche.
      2. Preparare fresco un mezzo 2D (Dulbecco's Modified Eagle's Medium contenente il 10% di siero bovino fetale) e un medium 3D (Medio organoide per adenocarcinoma polmonare umano). Il materiale 3D può essere generato da kit commerciali o, secondo i lavori di Sachs, N. et al. dal laboratorio²⁰ di Hans Clever.
         NOTA: Un piatto da 6 cm può solitamente produrre circa 5.000.000 di cellule dopo la digestione. Ridurre il numero di celle di ingresso per il disegno sperimentale. Le piastre progettate per l'imaging confocale con fondo in vetro non sono adatte a Matrigel per formare una forma 3D adeguata.
   2. Aspirare il mezzo 2D esaurito e lavare le cellule una volta con 1 mL di PBS per rimuovere il siero residuo. Aspirare PBS, aggiungere 1 mL di TrypLE preriscaldato e incubare la piastra a 37 °C per 4 minuti.
   3. Osserva le cellule al microscopio. Quando il citoplasma si ritrae e le cellule perdono le connessioni intercellulari, si aggiunge un volume uguale (1 mL) di nuovo mezzo 2D per terminare la reazione enzimatica.
   4. Pipetta delicatamente per staccare e risospendere le cellule aderenti dalla superficie della cultura. Trasferire la sospensione delle celle in tubi centrifughe da 1,5 mL e centrifugare a 300 × g. per 3 minuti a RT per pelletare le celle.
   5. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet cellulare in un mezzo 2D di 1 mL. Diluire la sospensione cellulare da 10 μL a 100 μL e contare il numero cellulare con un emocitometro. Calcola il volume richiesto secondo il passaggio 1.1.1 e aspira su un tubo centrifuga da 1,5 mL con punte già risciacquate.
2. Semina delle cellule raccolte in Matrigel
   1. Prepara il ghiaccio e preraffredda le punte della pipetta in frigorifero a -20 °C per 1 minuto e usa punte a bassa ritenzione se possibile. Assicurati che non rimangano cristalli nelle aliquote di Matrigel e che non si formino bolle quando la punta entra nella soluzione.
   2. Centrifugare il tubo contenente le cellule raccolte a 300 × g a RT e scartare il soprandante. Metti il tubo sul ghiaccio. Usa punte di pipette preraffreddate per aspirare lentamente il volume richiesto di Matrigel e aggiungerlo al pellet sul ghiaccio. Risospendi lentamente usando solo il primo stop della pipetta sul ghiaccio. Si prega di non lasciare ghiaccio per più di 10 secondi se è necessaria osservazione.
   3. Usa punte di pipette preraffreddate e tieni la miscela sul ghiaccio. Distribuisci una aliquota della miscela al centro di ogni pozzo. Ritira lentamente la pipetta durante la dispensazione, usando solo il primo stop per evitare la formazione di bolle.
      NOTA: La miscela dovrebbe formare una struttura tridimensionale a cupola al centro. Sospezione nuovamente la miscela prima di procedere verso il pozzo successivo. Se possibile, evita di usare i pozzi di bordo e aggiungi PBS a questi pozzi.
   4. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 40 minuti per consentire la polimerizzazione del gel. Dopo che il Matrigel si è solidificato, aggiungere con attenzione un mezzo 3D lungo la parete del pozzo e continuare la coltura a 37 °C.
      NOTA: Evita di generare bolle durante la dispensazione. Se si generano bolle, evita di usare quella parte della miscela.
   5. Durante la coltura, sostituire il mezzo 3D ogni 3 giorni o ogni volta che si osserva un cambiamento di colore (da rosa a giallo). Esaminare la crescita organoide al microscopio rovesciato ad ogni cambiamento di mezzo e documentare la morfologia fotograficamente per monitorare lo sviluppo strutturale.
      NOTA: Gli organoidi dovrebbero essere densi e contorti con diametri superiori a 30 μm invece di essere disintegrati o frammentati come indicato da 5000 celle/μL (Figura 1D).

2. Fissazione, inserimento e sezionamento degli organoidi

1. Prepara colture organoidi tra i giorni 6 e 9. Rimuovi il mezzo di coltura dalla piastra di coltura cellulare. Distoglie delicatamente gli organoidi pipettando con 1 mL di PBS freddo e trasferiscili in un tubo da 1,5 mL pre-risciacquato con il 5% di BSA per evitare l'adesione. Lascia che gli organoidi si depositino naturalmente per gravità sul ghiaccio e rimuovi con cura il soprandante.
2. Aggiungi 1 mL di PBS freddo per risospendere il pellet. Lascia che gli organoidi si depositino naturalmente per gravità per almeno 5 minuti e rimuovi con cura il surnadante. Se alcuni organoidi non sedimentano, centrifugare brevemente a 200 × g per 1 minuto a 4 °C per raccoglierli. Questo passaggio verrà eseguito più volte e sarà chiamato 'small wash'.
3. Esegui il piccolo lavaggio due volte per rimuovere i residui di Matrigel. Se persiste residuo di Matrigel, aggiungi una concentrazione finale di 10 mM di EDTA al PBS freddo durante il lavaggio.
   ATTENZIONE: Trasferire i campioni nella cappa di evacuazione. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) sufficiente a coprire gli organoidi e fissare il ghiaccio per 1 ora in una cappa a pompa. Scartare il fissativo e eseguire il piccolo lavaggio due volte. Procedi con il passo 4.1 per la macchia IF.
4. Dopo che gli organoidi si sono depositati sul fondo del tubo, si elimina il sovrantante e si preriscaldano i campioni in un bagno metallico a 70–75 °C per 5 minuti per evitare una rapida solidificazione dell'agarosio durante il passaggio 2.7.
5. Prepara il 3% (p/v) di agarosio in 1× PBS e riscalda la miscela in un bagno d'acqua a microonde fino a quando non è completamente sciolta e trasparente. Evita l'ebollizione per evitare perdite di volume o variazioni nella concentrazione di agarosio.
6. Sospendere rapidamente gli organoidi fissi in 30–50 μL di agarosio al 3%, garantendo una distribuzione uniforme, e raffreddare sul ghiaccio per 20–30 minuti fino alla solidificazione, evitando la formazione di bolle.
7. Una volta che la miscela di agarosio-organoide si è solidificata, rimuovere con cura il blocco di agarosio dal tubo usando un ago e trasferirlo in una cassetta di tessuto marcato che incorpora il fazzoletto.
8. Immergi sequenzialmente la cassetta contenente il blocco di agarosio in soluzioni di etanolo classificate (30%, 50%, 70% [può essere conservato durante la notte a 4 °C], 80%, 90%, 95%, 100% e 100%) per la disidratazione. Incuba ogni passo su una piattaforma di scuotimento a 20 giri per 30 minuti.
9. Presciogli i blocchi di cera di paraffina in forno prima di usarlo a 65 °C. Trasferire gli organoidi disidratati incorporati nell'agarosio nello xilene per la liberazione. Immergi due volte, ciascuna per 15–20 minuti, per rimuovere residui di etanolo.
10. Trasferisci le cassette di tessuto in sequenza nel bagno di paraffina 1 per 45 minuti, e poi nel bagno di paraffina 2 per altri 45 minuti.
11. Posizionare le cassette tissue e gli stampi metallici nella camera di paraffina fusa della stazione di incassionamento. Rimuovi l'organoide o il campione di tessuto dalla cassetta e posizionalo al centro dello stampo metallico. Posiziona lo stampo su una piastra fredda per fissare l'orientamento del campione.
12. Posiziona la cassetta di tessuto sopra lo stampo metallico, riempi con paraffina fusa aggiuntiva e lascia raffreddare sulla piastra fredda per almeno 60 minuti. Una volta che il blocco di paraffina è completamente solidificato, rimuovere lo stampo metallico e conservare il blocco organoide incorporato nella paraffina a 4 °C fino alla sezione.
13. Separare i blocchi organoidi immersi in paraffina utilizzando un microtomo. Assicurati che lo spessore di ogni sezione sia uniforme per facilitare la colorazione e l'imaging successivi.
14. Lascia galleggiare le sezioni tagliate in un bagno d'acqua mantenuto a 40 °C per consentire l'espansione completa dei nastri di paraffina. Assicurati che ogni sezione si distenda come un unico strato senza pieghe; Scartare eventuali sezioni piegate o sovrapposte.
15. Montare le sezioni espanse su vetrine adesive del microscopio immergendo il vetrino a un leggero angolo sotto la sezione e sollevandolo verticalmente per catturare il tessuto. Etichetta le vetrine con una matita per preservare l'identificazione del campione durante la lavorazione successiva.

3. Colorazione di ematossilina ed eosina (H&E)

1. Cuocere le vetri contenenti tessuto o sezioni organoidi in un forno a 60 °C per 1–2 ore per garantire una corretta adesione e rimuovere residui di paraffina.
2. Dewax le sezioni in sequenza immergendole nello xilene I per 15 minuti, nello xilene II per 15 minuti, e poi reidratare attraverso una serie di etanolo classificato di 100%, 100%, 95%, 90%, 80% e 70%, ciascuno per 5 minuti. Poi, risciacqua i vetri in acqua doppia distillata (ddH₂O) due volte, ciascuna per 5 minuti.
3. Tingi le sezioni con ematossilina per 5 minuti, risciacqua con acqua del rubinetto corrente per 1–2 minuti, e poi differenzia con alcol acido all'1% per 2 seconde. Lava di nuovo con acqua del rubinetto per 1–2 minuti, poi sbianca i nuclei in acqua ammoniaca all'1% per 5 secondi, seguito da un ultimo risciacquo in acqua del rubinetto per 1–2 minuti.
4. Disidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo classificata di 70%, 80%, 90% e 95% ciascuna per 3 minuti, poi controcolorare con eosina in una soluzione a base di alcool per 10 minuti.
5. Sciacquare le sezioni due volte con etanolo assoluto, ciascuna per 5 minuti.
   NOTA: Per l'eosina a base di alcol, assicurati di disidratare fino al 95% di etanolo prima della colorazione. Per l'eosina solubile in acqua, esegui la colorazione prima della disidratazione.
6. Libera le sezioni immergendole due volte nello xilene, ciascuna per 5 minuti, e tienile nello xilene fino al montaggio.
7. Montare le veglie immediatamente dopo la rimozione dallo xilene usando un mezzo di montaggio in resina neutra, evitando con attenzione le bolle d'aria.
8. Asciugare all'aria i vetri montati a RT per 30–60 minuti, poi osservare al microscopio ottico.
   NOTA: Il montaggio immediato dopo la pulizia dello xilene previene l'ossidazione e garantisce chiarezza ottica.

4. Colorazione immunofluorescenza a montaggio intero

1. Continua dal passo 2.4. Aggiungere 1 mL di soluzione di blocco e permeabilizzazione (5% BSA + 0,3% Triton X-100) al pellet e incubare a RT per 60 minuti o a 4 °C come punto di arresto per 1–2 giorni.
2. Diluire gli anticorpi primari e secondari seguendo il rapporto raccomandato dal produttore nella soluzione di blocco e permeabilizzazione. Lava una piccola volta e aggiungi 200 μL di anticorpi primari diluiti al pellet. Incubare a 4 °C durante la notte.
3. Esegui il piccolo lavaggio 3 volte e aggiungi 200 μL di anticorpi secondari diluiti al pellet. Incubare a RT per 60 minuti.
4. Successivamente, esegui il piccolo lavaggio 3 volte. Aggiungere 15 μL di mezzo di montaggio per risospendere il pellet e far cadere il mezzo contenente organoidi su una vetrata di vetro. Applica lentamente una copertura sul substrato e sigilla la copertura con lo smalto. Non comprimere manualmente lo slittamento del coperchio e non lasciare che il mezzo di montaggio si diffonda per tensione superficiale.

Risultati

Il processo generale di questo protocollo include l'espansione delle celle 2D A549 nella fase esponenziale (Figura Supplementare 1A) e il passaggio in 3D Matrigel per formare organoidi (Figura 1A). Al momento dell'incapsulamento in Matrigel, le cellule proliferavano e si auto-assemblavano, formando prevalentemente organoidi monoclonali (Figura 1B). La sua morfologia densa e contorta era uniforme lungo il passaggio (Figura Supplementare <...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo per generare organoidi tumorali derivati da linee cellulari di adenocarcinoma polmonare A549, ottimizzati per semplicità tecnica, riproducibilità e uso educativo. Tre parametri determinano criticamente il successo: stato cellulare iniziale, formulazione del mezzo e composizione della matrice. Inoltre, la durata della coltura non è raccomandata di superare i 14 giorni. Di seguito sono elencati i parametri chiave e la risoluzione dei problemi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.5 mL Micro Centrifuge tube	Biofil	CFT003015
A549 [A-549]human non-small cell lung cancer cells	ZQXZbio	ZQ0003	STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma was negetive when purchased was tested every 2 weeks. Passage number within 10 passages from the P1 aliquots of the purchased batch was used.
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Anti-E Cadherin antibody	Abcam	ab231303
Anti-Fade Mounting Medium	YEASEN	36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibody	Abcam	ab51608
Biological Safety Cabinet	Nuaire LABGARD	NU-540
Biological Tissue Embedding Machine	KEDEE	KD-BM
BSA	Sigma	A1933
Cell-Grade BSA	Sigma	A1933-100G
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5702 R	Swing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tube	Biofil	CFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)	ZSGB-BIO	ZLI-9065
Cryostage	KEDEE	KD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode  Reader	Biotek	Cytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAb	Abclonal	A4357
DMEM	Gibco	11965092
DMSO	Solarbio	D8371
Donkey Serum	Solarbio	SL050
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11965118
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)	Servicebio	G1001
FBS	Nobimpex	B118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 Incubator	Thermo Scientific	i60
Hematoxylin Bluing Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Staining Solution	Servicebio	G1004
Hemocytometer	Solarbio	YA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)	PMO Bio	HC1001
Immunohistochemistry (IHC) Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305	Store in 4°C
Laser Confocal Microscope  FV3000	Olympus	FV3000	Usual parameter range: PMT Voltage: 500 ± 200 V; Laser Transmissivity: 5 ± 3%; Offset: 3 %
Manual Rotary Microtome	Leica	RM2235
Metal Bath	ALLSHENG	MK-3000
Microwave Oven	Galanz
Nail Polish	Lete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)	Beyotime	C0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix Gel	PMO Bio	BM1001
PBS	WISENT	311-010-CL
Peroxidase Blocking Solution	Beyotime	P0100A
Pipettes	Eppendorf	312300063/312300020/312400083
Pipettes tips	Axygen	14-222-692/14-222-723/14-222-869	Consider using low retention tips if possible.
Three-Dimensional Shaker	SCILOGEX	SK-D3309-Pro	Low speed.
Tissue Flotation Water Bath	KEDEE	KD-P
Triton X-100	VWR	92046-34-9
Trypan Blue	Gibco	15250061
TryPLE	Gibco	12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal Antibody	HUABIO	HA720067