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Articolo metodologico

Produzione rapida di ribonucleasi umana ricombinante SLFN14 e analisi stechiometrica tramite fotometria di massa

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DOI:

10.3791/70393

⸱

20 febbraio 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la produzione di ribonucleasi umana ricombinante SLFN14 e la sua analisi stechiometrica tramite fotometria di massa.

Abstract

Le ribonucleasi sono una classe specializzata di proteine di legaggio all'RNA che catalizzano la scissione dell'RNA e contribuiscono a diversi processi biologici, inclusa la regolazione genica. Tuttavia, la struttura, la funzione e la regolazione di molte ribonucleasi umane rimangono scarsamente caratterizzate a causa delle sfide nella produzione di proteine ricombinanti. Questo metodo descrive un approccio efficiente per l'espressione transitoria, purificazione e analisi stechiometrica della ribonucleasi umana Schlafen 14 (SLFN14). SLFN14 contrassegnato con Flag ricombinante è stato espresso nelle celle di sospensione HEK293 e isolato utilizzando un flusso di lavoro di purificazione rapida in due fasi che consiste in cromatografia di affinità anti-Flag seguita da cromatografia di esclusione di dimensione a bassa risoluzione. La fotometria di massa, una tecnica sensibile a singola molecola, ha rivelato che in condizioni fisiologiche saline SLFN14 forma un omodimero stabile legato all'RNA cellulare, mentre un alto livello di sale favorisce la dissociazione dell'RNA preservando l'organizzazione degli omodimeri. La proteina umana ricombinante SLFN14 risultante è adatta per studi strutturali a valle e saghi biochimici qualitativi. Questo approccio rapido per l'isolamento e la caratterizzazione di proteine umane ricombinanti è ampiamente applicabile alla produzione di altre ribonucleasi mammiferi e proteine di legame all'RNA destinate alla caratterizzazione biofisica e biochimica.

Introduzione

Schlafen 14 (SLFN14) è una ribonucleasi poco studiata e fattore di restrizione degli ospiti mammiferi 1,2,3. La proteina umana SLFN14 appartiene a una famiglia di sei membri di regolatori genici SLFN, che esercitano ruoli nell'immunità, nell'attività antivirale, nella chemiosensibilità e nella differenziazionecellulare 4,5,6,7,8. La comprensione meccanicistica del ruolo dei regolatori genici SLFN rimane incompleta; tuttavia, molti membri ospitano attività ribonucleasi essenziale per il controllotraslazionale 7,9. Le ribonucleasi SLFN vengono attivate durante l'omodimerizzazione proteica, formando una fessura composita di legame RNA esperta nella clivellazionedel substrato 10,11. Per proteggere le cellule dalla scissione spuria dell'RNA, la maggior parte delle ribonucleasi SLFN esiste prevalentemente come monomero e attende l'attivazione tramite segnali molecolari specifici per ciascun membrodella famiglia 5,7,11,12.

La produzione ricombinante di SLFN14 umano ha permesso studi molecolari completi su questa ribonucleasi precedentemente poco studiata, fornendo nuove intuizioni sulla sua funzione eregolazione 2,13,14. La proteina SLFN14 ricombinante purificata ha caratterizzato accelerato la sua attività di clivagatura RNA dipendente dalla struttura utilizzando saggi in vitro 2,14. Gli studi di criomicroscopia elettronica (cryoEM) sulla proteina purificata SLFN14 rivelano anche una disposizione di omodimeri SLFN14, dove l'RNA duplicato si carica in una fessuracentrale 2,13,14. L'assemblaggio di ordine superiore di SLFN14 è stato ulteriormente caratterizzato dalla fotometria di massa, una tecnica a singola molecola per misurare la massa molecolare. Inaspettatamente, questa tecnica sensibile dimostra che SLFN14 forma prevalentemente un omodimero resistente al sale, ma può anche formare un omotetramero sensibile al sale di funzionesconosciuta 2,13,14. Collettivamente, la capacità di ottenere la proteina umana purificata di SLFN14 è stata una tappa fondamentale, che ha permesso intuizioni molecolari precoci che senza dubbio alimenteranno una nuova e entusiasmante fase di ricerca sul controllo traslazionale mediato da SLFN14.

La ribonucleasi ricombinante SLFN14 è stata storicamente difficile da acquisire utilizzando strategie standard di produzione proteica. Il rapporto originale che descriveva l'attività enzimatica di SLFN14 evidenziava la scarsa ressa, la stabilità ridotta e la bassasolubilità. La proteina umana SLFN14 è caratterizzata da una lunga catena polipeptidica, una pronunciata idrofobia e una citotossicità dipendente da ribonucleasi, che insieme ostacolano in gran parte l'uso dei sistemi di espressione battericaconvenzionali 1,13,14. Tuttavia, sofisticati meccanismi eucariotici di traduzione e accompagnatori offrono un'alternativa potente che produce efficacemente la proteina umanaSLFN14 15 a lunghezza intera. Sistemi di espressione sia di baculovirus-insetti che mammiferi sono stati impiegati per ottenere proteine umane SLFN14 a lunghezza intera per studi crioEM e saggibiochimici 2,13,14. Tuttavia, in alcuni casi la proteina SLFN14 derivata da insetti ha richiesto mutazioni stabilizzanti per prevenire l'aggregazione delcampione 2. La somministrazione genetica mediata dal baculovirus è anche associata a un impegno sostanziale e a un lungo tempo di anticipazione che ritardano i progressi dellaricerca 15,16. D'altra parte, la proteina ricombinante SLFN14 isolata da un ospite di espressione mammifero offre il vantaggio della velocità ed evita la necessità di ingegneria proteica nell'ottimizzazione del campione.

Questo metodo è progettato per fornire un approccio relativamente rapido e a basso sforzo per produrre proteine ricombinanti di tipo selvatico SLFN14 adatte a studi molecolari a valle. L'uso di cellule mammiferiche fornisce un ambiente quasi nativo per preservare il correttono ripiegamento proteico senza la necessità di ingegneria proteica SLFN1413. Un metodo di somministrazione genetica basato su sostanze chimiche, a differenza di una strategia a vettore virale, accelera anche la tempistica di produzione da mesi agiorni 15. Per bilanciare il costo relativamente elevato della coltura cellulare di mammiferi, questo metodo utilizza il reagente di trasfezione polietilenimina (PEI) economico e cellule umane embrionali renali 293 (HEK293) efficienti in trasfezione coltivate insospensione 17,18. Per minimizzare la perdita di proteine durante la lavorazione del campione, questa procedura sfrutta anche strategie a basso consumo di campioni per la purificazione delle proteine SLFN14 e l'analisi stechiometrica per il controllo della qualità del campione. Questo protocollo di quattro giorni fornisce dettagli specifici su come eseguire 1) espressione genica transitoria nelle cellule HEK293, 2) un flusso di lavoro cromatografia in due fasi utilizzando colonne di spin, e 3) determinazione della stechiometria proteica tramite fotometria di massa. Il prodotto finale di questa procedura è una proteina umana selvatica SLFN14 che ospita un tag Myc-Flag duale C-terminale (SLFN14Myc-Flag) che può essere utilizzato per studi crioEM a valle e caratterizzazione biochimicaqualitativa 13. Questo approccio versatile può essere applicato per isolare e caratterizzare altre proteine di legame dell'RNA umano poco studiate, in particolare geni ribonucleasi grandi e citotossici che spesso sono difficili da sovraesprimere nei sistemi di espressione eterologo. Pertanto, questo protocollo abbassa la barriera per una caratterizzazione molecolare completa del proteoma umano.

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Protocollo

Gli esperimenti che coinvolgono la coltura cellulare HEK293 devono essere eseguiti in condizioni di Biosafety Level 2 (BSL-2) in conformità con i protocolli di biosicurezza istituzionali approvati.

1. Espressione transitoria diMyc-Flag di SLFN14 nelle cellule di mammiferi

  1. Cellule di sospensione HEK293 di mammiferi semina a 0,5 x 106 cellule/mL in un mezzo di crescita siero privo di siero preriscaldato per un volume finale di 320 mL in una fiaschetta da 1 L ventilata e con deflessi.
  2. Incubare le cellule a 37 °C, 125 rpm, 8% CO2, 75-80% di umidità per 24-32 ore.
  3. Verifica che il conteggio cellulare sia 1,2-1,8 x 106 cellule/mL e la vitalità superiore al 90% usando la colorazione blu di tripano e un contatorecellulare 19.
  4. Decantare 40 mL di coltura in otto tubi conici.
  5. Prelevare le cellule tramite centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 20-25 °C.
  6. Scarta il mezzo di crescita.
  7. Sospendere delicatamente ogni pellet cellulare in 38 mL di mezzo di trasfezione preriscaldato e senza siero per un volume finale di 304 mL.
    NOTA: I restanti 16 mL del volume di coltura originale descritto nel passo 1.1 saranno forniti dalla miscela di trasfezione descritta nel passaggio 1.12.
  8. Trasferire le celle in una nuova fiaschetta ventilata da 1 L.
  9. In un tubo conico, aggiungere 320 μg di DNA plasmidico purificato che codifica il genericombinante SLFN14 Myc-Flag a 8 mL di mezzo di trasfezione senza siero e incubare per 5 minuti a 20-25 °C.
    NOTA: La concentrazione di plasmidi è tipicamente di 500 ng/μL a un volume finale di 640 μL.
  10. Contemporaneamente al passo 1.9, aggiungere 960 μg di PEI sterilizzato con filtro da 0,22 μm a 8 mL di mezzo di trasfezione senza siero e incubare per 5 minuti a 20-25 °C.
    NOTA: Il materiale operativo è tipicamente di 1 mg/mL a un volume finale di 960 μL.
  11. Aggiungi lentamente la miscela PEI (vedi passo 1.10) a goccia alla soluzione di DNA plasmidico ricombinante (vedi passo 1.9) e incuba 15 minuti a 20-25 °C.
  12. Aggiungi lentamente 16 mL della miscela DNA/PEI a goccia alle cellule preparate nel passo 1.8.
  13. Incubare le cellule a 37 °C, 125 rpm, 8% CO2, 75-80% di umidità per 48 ore.
  14. Svuotare 40 mL di cellule trasfectate in otto tubi conicali.
  15. Prelevare le cellule trasfectate tramite centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 20-25 °C.
  16. Escantare il sovrantato e conservare le otto pellet cellulari a -80 °C.

2. Purificazione ricombinante a due fasi di SLFN14Myc-Flag

  1. Cromatografia di affinità anti-bandiera.
    Esegui il protocollo di cromatografia di affinità anti-Flag in duplicato, utilizzando quattro pellet cellulari del passaggio 1.16 per ogni preparazione.
    1. Preparazione alla resina.
      1. Bilanciare la resina di agaroso anti-Flag a 20-25 °C per 15 minuti.
      2. Sospendere delicatamente la resina invertendo la bottiglia immediatamente prima di trasferire 40 μL di sospensione al 50% di resina in un tubo microcentrifuga da 2 mL.
        NOTA: Taglia l'estremità della punta della pipetta per raccogliere facilmente la suspense viscosa.
      3. Risospendere la resina in 1 mL di tampone ad alto salare (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20).
      4. Incubare per 45 minuti a 4 °C.
      5. Centrifuga la pasta di resina a 8.000 x g per 2 minuti a 4 °C.
      6. Aspira e elimina il tampone ad alto salare facendo attenzione a non disturbare la resina.
    2. Chiarificazione sul lisato cellulare.
      1. Risospendere ogni pellet cellulare trasfettizzato con 225 μL di Tampone di Risospensione raffreddato (50 mM di Tris pH 7,4, 600 mM di NaCl, 5 mM diMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,5% Triton-X-100, 1 mM PMSF, 5 μg/mL di Leupettina, 1 mM di Benzamidina, 0,7 μg/mL di Pepstatina A, 0,25 U/mL di nucleasi Genius) per un volume totale di 900 μL distribuiti su quattro pellet cellulari.
      2. Trasferire le celle in un tubo microcentrifuga da 2 mL che è stato pre-raffreddato sul ghiaccio.
      3. Incubare il tubo della microcentrifuga orizzontalmente su un nutatore per 30 minuti a 4 °C.
        NOTA: Conservare un'aliquota di 20 μL di lisato totale a -20 °C per la risoluzione dei problemi in caso di scarsi livelli di espressione proteica.
      4. Chiarire il lisato cellulare centrifugando a 21.300 x g per 20 minuti a 4 °C.
    3. Acquisizione e lavaggio di affinità proteica.
      1. Combinare il lisato chiarificato (vedi passo 2.1.2.4) con la resina anti-Flag equilibrata (vedi passo 2.1.1.6).
      2. Incubare la miscela lisato-resina in un tubo microcentrifuga posizionato orizzontalmente su un nutatore per 60 minuti a 4 °C.
      3. Centrifuga la miscela lisato-resina a 8.000 x g per 2 minuti a 4 °C per formare un pellet di resina.
      4. Scartare circa 700 μL di sovrantantante facendo attenzione a non disturbare la pellet di resina.
        NOTA: Conservare un'aliquota di 20 μL di sovrantantante a -20 °C dopo il binding della resina per la risoluzione dei problemi in caso di scarsa efficienza di cattura.
      5. Risospendere la miscela residua di sovrantanti e trasferire la soluzione in una colonna di spin vuota con una capacità di 800 μL, inserita in un tubo microcentrifuga vuoto da 2 mL.
      6. Centrifuga la colonna di rotazione a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C e elimina il flusso di rotazione.
      7. Risciacquare il tubo vuoto della microcentrifuga del passaggio 2.1.3.5 con 500 μL di tampone ad alto contenuto di sale e trasferire la soluzione alla colonna di rotazione.
        NOTA: Questo passaggio aiuta a recuperare eventuali residui di resina rimasti nel tubo della microcentrifuga.
      8. Centrifuga la colonna di rotazione a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C e elimina il flusso di rotazione.
      9. Aggiungi 500 μL di tampone ad alto salare alla colonna di rotazione. Centrifuga la colonna di rotazione a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C e elimina il flusso di rotazione. Ripeti questo passaggio per un totale di quattro lavaggi ad alto contenuto di sale.
      10. Aggiungi 500 μL di tampone a basso contenuto di sale (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20) alla colonna di spin. Centrifuga la colonna di rotazione a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C e elimina il flusso di rotazione. Ripeti questo passaggio per un totale di due lavaggi a basso contenuto di sale.
      11. Aggiungere 500 μL di ATP Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 10 mM ATP) alla colonna di rotazione. Tappa la parte inferiore della colonna di spin e incuba per 5 minuti a 4 °C. Scollega la colonna di rotazione e la centrifuga a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C e scarta il flusso di rotazione. Ripeti questo passaggio per un totale di quattro lavaggi con ATP.
      12. Esegui un lavaggio finale aggiungendo 500 μL di Low Salt Wash Buffer alla colonna di rotazione. Centrifuga la colonna di rotazione a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C e elimina il flusso di rotazione.
    4. Eluzione proteica tramite 3xFlag Peptide.
      1. Tampona la parte inferiore della colonna di centrifuga con una lavetta a basso pelucco per rimuovere il liquido in eccesso e tappa la parte inferiore della colonna di centrifuga.
      2. Aggiungi 55 μL di 3xFlag Elution Buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0.5 mM β-ME, 0.1% Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag peptide) direttamente sulla resina.
      3. Sigilla l'apertura della colonna di rotazione con parafilm e posiziona la colonna in un tubo microcentrifuga da 1,7 mL.
      4. Incubare la colonna di rotazione verticalmente su un nutator per 60 minuti a 4 °C.
        NOTA: Per mantenere la colonna di rotazione verticale, montare un rack per tubi per microcentrifuga sul nutatore con elastici.
      5. Rimuovi il parafilm e il tappo della colonna di rotazione. Raccogliere la proteinaMyc-Flag ricombinante eluata SLFN14 in un tubo microcentrifugo pulito da 1,7 mL tramite centrifugazione a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C.
      6. Mantenere 50 μL di resina anti-Flag eluata per la cromatografia di esclusione di dimensione successiva e 5 μL per l'analisi SDS-PAGE.
  2. Cromatografia a esclusione di dimensioni.
    Eseguire il protocollo di cromatografia a esclusione di dimensione utilizzando il Low Salt Desalting Buffer (150 mM NaCl) per l'analisi standard delleproteine Myc-Flag di SLFN14 o il High Salt Desalting Buffer (500 mM NaCl) per la caratterizzazione apo SLFN14Myc-Flag .
    1. Combinare due eluati di resina anti-Flag da 50 μL dal passo 2.1.4.6 per un totale di 100 μL di campione.
    2. Prepara una colonna di desalinizzazione a spin da 0,5 mL con un taglio del peso molecolare di 40 kDa allentando il tappo, rimuovendo la chiusura inferiore e inserendo la colonna in un tubo microcentrifuga da 2 mL.
    3. Centrifuga la colonna di desalinizzazione dello spin a 700 x g per 1 minuto a 4 °C per rimuovere la soluzione di stoccaggio della colonna. Scartare il flow-through.
    4. Aggiungi 300 μL di tampone di desalinizzazione a basso o alto contenuto di sale (20 mM Tris pH 7,4, 150/500 mM NaCl, 1 mMMgCl 2, 1 mM TCEP) alla colonna di desalinizzazione dello spin. Centrifuga la colonna di rotazione a 700 x g per 1-2 minuti a 4 °C e elimina il flusso di rotazione. Esegui questo passaggio tre volte per bilanciare completamente la colonna.
    5. Tampona la parte inferiore della colonna di desalinizzazione con una lavetta a bassa quantità di lanugine.
    6. Trasferire la colonna di desalinizzazione dello spin in un tubo pulito da microcentrifuga da 1,7 mL.
    7. Aggiungere 100 μL di resina anti-Flag combinata eluata (vedi passo 2.2.1) al centro del letto della colonna senza disturbare la resina.
    8. Eludi la proteinaMyc-Flag ricombinante SLFN14 centrifugando la colonna di desalinizzazione dello spin a 700 x g per 2 minuti a 4 °C.
    9. Conservare 95 μL di proteina ricombinante recuperata per la caratterizzazione molecolare e 5 μL per l'analisi SDS-PAGE.
  3. Caratterizzare il campione di proteinaMyc-flag di SLFN14 ricombinante purificata.
    1. Eseguire elettroforesi in gel di dodecil-solfato di sodio poliacrilammide (SDS-PAGE).
      1. Combinare 5 μL di 2 campioni di Laemmli con 5 μL aliquote raccolte in fasi distinte lungo il protocollo di purificazione.
      2. Riscaldare a 95 °C per 5 minuti.
      3. Risolvi una scala proteica a ampio intervallo insieme a 10 μL di miscela tampone di campione e Laemmli per il 4-15% di SDS-PAGE a 200V per 30 minuti.
      4. Visualizza le bande proteiche colorando il gel con la soluzione di colorazione Coomassie G-250 per 30 minuti su uno shaker orbitale e rimuovi il gel con acqua deionizzata su uno shaker orbitale finché lo sfondo non è libero.
      5. Ispezionare le bande proteiche risultanti per assicurarsi che il campione recuperato dal passo 2.2.9 sia una singola banda proteica corrispondente al peso molecolare teoricoMyc-Flag di SLFN14 di 107,5 kilodalton (kDa).
    2. Quantificare proteine e acidi nucleici tramite spettrofotometria UV/vis.
      1. Svuotare uno spettrofotometro di microvolume con 2 μL di tampone di desalinizzazione a basso o alto salo, in corrispondenza con il tampone di stoccaggio proteico.
      2. Misurare l'assorbanza a 260 nm e 280 nm da 2 μL di proteina ricombinante recuperata di SLFN14Myc-Flag (vedi passo 2.2.9) utilizzando uno spettrofotometro di microvolume.
      3. Calcola la concentrazione della proteinaMyc-Flag ricombinante SLFN14 usando l'assorbanza registrata a 280 nm e il suo coefficiente di estinzione (93330 M-1 cm-1) usando la leggedi Beer-Lambert 20.
      4. Calcola il rapporto di assorbanza del campione A260/280 dividendo il valore di assorbanza registrato a 260 nm per il valore di assorbanza misurato a 280 nm per determinare se l'acido nucleico sta co-purificando con la proteinaMyc-Flag ricombinante SLFN14.
        NOTA: Un rapporto A260/280 superiore a 0,7 indica probabilmente la presenza di acidonucleico 21.
    3. Quantificare l'RNA cellulare tramite fluorometria.
      1. Quantificare il contenuto di RNA utilizzando 1-3 μL di proteina ricombinante recuperata dal passaggio 2.2.9 utilizzando un colorante fluorescente ad alta sensibilitàspecifico per RNA 22.

3. Analisi della massa molecolaredi Myc-Flag di SLFN14 tramite fotometria di massa

  1. Configurazione dello strumento del fotometro di massa.
    1. Accendi il laser usando l'interruttore sul retro della scatola elettronica del fotometro di massa.
    2. Accendi il deck di isolamento e clicca sul pulsante "isolamento" per minimizzare le vibrazioni degli strumenti.
    3. Apri il software AcquireMP.
    4. Aspetta 1 ora che lo strumento raggiunga l'equilibrio termico.
  2. Preparazione della diapositiva di copertura.
    1. Tieni una copertura di vetro in posizione verticale usando una pinzetta a punta morbida.
    2. Risciacquo entrambi i lati del vetrino del vetro con acqua ultrapura di tipo I seguita da alcol isopropilico. Ripeti questo passaggio per un totale di tre volte.
    3. Risciacqua ciascun lato del vetrino del coperchio di vetro un'ultima volta con acqua ultrapura di tipo I per 45 secondi.
    4. Rimuovere delicatamente le gocce d'acqua in eccesso dal vetrino del coperchio del vetro tramite aspirazione usando una punta di pipetta pulita collegata a una linea di vuoto.
    5. Conserva il vetrino pulito del coperchio in vetro in una scatola di plastica foderata con carta per lenti per il trasporto al fotometro di massa.
  3. Monta la slitta del copricapo sullo strumento.
    1. Posiziona una guarnizione in silicone a 6 pozzi sullo strumento di allineamento metallico usando pinzette a punta morbida.
    2. Posiziona la slitta pulita del coperchio in vetro del passo 3.2.5 sopra la guarnizione in silicone e usa la pinzetta a punta morbida per premere leggermente intorno alla guarnizione in silicone.
      NOTA: Non applicare pressione sui pozzi campioni.
    3. Metti una goccia di olio a immersione sull'oculo del fotometro di massa.
    4. Gira la slitta del coperchio in vetro in modo che la guarnizione in silicone ripona verso l'alto e posiziona delicatamente la slitta del coperchio di vetro sull'oculus usando pinzette a punta morbida.
    5. Fissa gli angoli in alto a sinistra e in basso a destra del coperchio in vetro usando magneti.
    6. Sotto controllo laterale, seleziona il pozzo in alto a sinistra nel software AcquireMP per allineare il laser con il centro del pozzo.
  4. Analizza gli standard proteici a vasta scala.
    1. Prepara una soluzione calibrante a intervallo ampio 50x (90 kDa a 1 MDa) diluendo 1 μL di un calcio calibrante 500x in soluzione salina tamponata fosfato da 9 μL.
    2. Prepara una base di lavoro calibrante 5x combinando 2 μL della soluzione calibrante a 50x wide range dello step 3.4.1 in 18 μL 1x fosfato-tamponato-salino.
    3. Aggiungere 10 μL di tampone di desalinizzazione a basso o alto sale filtrato da 0,22 μm nel pozzo vuoto.
      NOTA: È importante abbinare il buffer filtrato in questo passaggio con il buffer utilizzato per preparare il campioneMyc-Flag SLFN14 nel passo 2.2.9.
    4. Chiudi il coperchio.
    5. Sotto Trova focus, clicca su "diluizione delle gocce" nel software AcquireMP per determinare la messa a fuoco corretta del pozzo campione.
    6. Aggiungi 10 μL del materiale di lavoro calibrante 5x alla goccia tampone (vedi passo 3.4.3) e pipetta delicatamente su e giù per mescolare la soluzione.
    7. Chiudi il coperchio.
    8. Esamina le impostazioni dello strumento per confermare che i valori di movimento, segnale, saturazione e nitidezza siano stabili e ottimali.
      NOTA: I valori ottimali appariranno blu e gli outlier sono colorati in arancione.
    9. Clicca su "registra" nel software AcquireMP per registrare un video di 60 secondi.
    10. Salva il file di risultato (.mpr) con un titolo descrittivo e un timestamp.
  5. Crea una curva di calibrazione.
    1. Apri il software DiscoverMP.
    2. Sotto misurazioni, clicca sul pulsante "+ apri" e accedi al file dei risultati del calibrante dal passo 3.4.10.
    3. Fai doppio clic sul file degli standard proteici elencato per visualizzare i risultati.
    4. Nella configurazione del grafico, si aggiustare i confini di contrasto rispettivamente a 0,00000 e -0,03000.
    5. Definisci manualmente una curva gaussiana per i primi quattro picchi standard proteici trascinando il cursore su ciascun singolo picco.
    6. Clicca su "Crea" e seleziona "calibrazione di massa".
    7. Sotto l'intestazione calibrante, assegna ogni picco calibrante adattato dal passo 3.5.5 alla sua massa molecolare nota di 86, 172, 258 e 344 kDa, rispettivamente.
    8. Verifica che la curva di calibrazione abbia unaR2 vicina a 1,0 e un errore massimo di massa (MME) inferiore al 2%.
    9. Clicca su "conferma calibrazione" e salva il file della curva di calibrazione (.mc).
      NOTA: Il fotometro di massa dovrebbe essere ricalibrato ogni ora.
  6. Analizzare la proteinaMyc-flag ricombinante SLFN14 in condizioni di basso e alto contenuto di sale.
    1. Preparare una soluzione da 50 μL di proteinaMyc-Flag ricombinante SLFN14 da 50 nM (vedi passo 2.2.9) utilizzando il Low Salt Desalting Buffer per l'analisi standard del campione in condizioni fisiologiche di sale o High Salt Desalting Buffer per la caratterizzazione del campione apo proteico.
    2. Centrifugare la miscela proteica ricombinante SLFN14Myc-Flag da 50 nM a 21.300 x g per 10 minuti a 20-25 °C per rimuovere potenziali aggregati proteici e polvere.
    3. Sotto controllo laterale, clicca su "pozzo successivo" nel software AcquireMP.
    4. Carica 10 μL di tampone filtrato a basso o alto salare filtrato da 0,22 μm nel pozzo e chiudi il coperchio.
      NOTA: È importante abbinare il buffer filtrato in questo passaggio con il buffer utilizzato per preparare la diluizione del campioneMyc-Flag SLFN14 nel passo 3.6.1.
    5. Sotto la sezione trova messa a fuoco, clicca su "diluizione delle gocce" per determinare la messa a fuoco corretta del nuovo pozzo campione.
    6. Carica 10 μL della soluzione proteica ricombinante SLFN14Myc-Flag da 50 nM dal passaggio 3.6.2 alla goccia tampone e pipetta delicatamente per mescolare il campione.
    7. Chiudi il coperchio e assicurati le impostazioni ottimali dello strumento come descritto nel passo 3.4.8.
    8. Clicca su "registra" nel software AcquireMP per registrare un video di 60 secondi.
      NOTA: La risoluzione ottimale di massa viene ottenuta da un video di 60 secondi con circa 1.000-4.000 conteggi totali.
    9. Salva il file di risultato (.mpr) con un titolo descrittivo e un timestamp.
  7. Calcola la massa molecolare e la stechiometria della proteinaMyc-Flag ricombinante SLFN14.
    1. Sotto misurazioni all'interno del software DiscoverMP, clicca sul pulsante "+ apri" per selezionare il file di risultato dal passo 3.6.9.
    2. Sotto calibrazioni, fai doppio clic sul file della curva di calibrazione creato nel passo 3.5.9 per applicare la calibrazione.
    3. Definisci manualmente una curva Gaussiana per ogni specie osservata di SLFN14Myc-Flag trascinando il cursore su ogni picco per ottenere un valore calcolato della massa molecolare.
    4. Calcola la massa molecolare media per ciascuna specie oligomerica da tre misurazioni indipendenti, insieme alla corrispondente deviazione standard.
    5. Determinare la stechiometria della proteinaMyc-Flag ricombinante SLFN14 valutando la massa molecolare media calcolata con interi del valore di massa teorico del protomeroMyc-Flag di SLFN14.
      NOTA: La massa teorica di un monomeroMyc-Flag di SLFN14 è di 107,5 kDa, di un dimero di 215 kDa, di un trimer di 322,5 kDa e di un tetramero di 430 kDa.

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Risultati

Un vettore mammifero progettato per l'espressione genica transitoria della proteinaMyc-Flag umana ricombinante SLFN14 è illustrato nella Figura 1. Un flusso di lavoro di purificazione in due fasi rappresenta l'isolamento della proteinaMyc-Flag di SLFN14 dalle cellule HEK293 (Figura 2A). Un gel denaturante rappresentativo di successo della proteinaMyc-Flag purificata di SLFN14 è mostrato nella

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Discussione

Diversi passaggi critici sottolineano le prestazioni e la versatilità di questo protocollo di produzione proteica. Per massimizzare la resa di proteine ricombinanti, utilizziamo cellule HEK293 che hanno un elevato assorbimento di DNA plasmidico estraneo e possono essere coltivate in sospensione per massimizzare la densità cellulare in tutto il volume23 del medio. Il reagente di trasfezione PEI è utilizzato in questo protocollo di somministrazione su larga scala pe...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio Pillon per la loro lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Extramurale del National Institute of Health degli Stati Uniti, dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS; R35GM147123 a M.C.P.) assegnata al Baylor College of Medicine e trasferita alla State University of New York a Buffalo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-mercaptoetanolo (b-Me)SigmaM3148-500ML14.3 Soluzioni M tock
AcquireMP 2024 R2Refeyn/Software per acquisizione dati
Adenosina-5'-trifosfato triidrato di sale disodio (ATP)Chem-Impex International00015-100Gregolare la soluzione a pH 7.0
Gel di affinità anti-bandiera M2MilliporeA2220Resina di affinità anti-bandiera
Benzamidina cloridratoSigmaB6506-25GInibitore della proteasi
Standard proteici a larga gamma (10-250 kDa)Bio-RadP7719SStandard proteici preformati
Contessa 3InvitrogenA49862Contatore cellulari automatico
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/Software di analisi dei dati
Soluzione salina tamponata fosfato di DulbeccoCorning21-031-CVCalcio a soluzione 1x
Peptide DYKDDDDKThermo Fisher ScientificA36805Peptide 3xFlag
Celle FreeStyle 293-FThermo Fisher ScientificR79007Cellule di sospensione dei mammiferi
Nucleasi Geniust M DMF archiviataSanta Cruzsc-391121BNucleasi universale
HyClone CDM4HEK293 mediaCytivaSH3085802Mezzo di crescita privo di siero
Supporti HyClone SFM4Transfx-293CytivaSH3086002Mezzo di trasfezione transitorio
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Olio a immersione
Alcool isopropilicoMacron Fine Chemicals3032-02
Buffer campione di LaemmliBio-Rad1610737Calcio 2x soluzione
LeupeptinVWRJ580-25MGInibitore della proteasi
Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 RefeynMP-CON-41033Calcio calibrante 500x
Kit di preparazione per campioni UC MassGlassRefeynMP-CON-21022Carrello e guarnizione
Micro colonna bio-spinBio-Rad7326204Colonna di spin vuota in polipropilene
Sistema Milli-Q IQ 7000MilliporeZIQ7000T0CAcqua ultrapura di tipo I
Mini gel TGX senza colorazioniBio-Rad45680864-15% SDS-PAGE
Minitron con umidità, raffreddamento e CO2Infors72175Shaker a incubatore
Kit di allineamento MPRefeynMP-CON-21019Strumento di allineamento, pinzetta a punta morbida, calamita
NanofotometroImplettoNP80Spettrofotometro UV-vis
NutatorClay Adams Brand421105
Pepstatina ASanta Cruzsc-45036BInibitore della proteasi
Fenilmetilsolsolfinilfluoro (PMSF)Prodotti di Ricerca InternazionaleP20270-25.0Inibitore della proteasi
Fiaschetta per shake in policarbonato Duran Wheaton KimbleWPFBC1000SFiaschetta a base ventilata e soffletante
Polietilenimina (PEI) MW 40.000Poliscienze24765Reagente di trasfezione
Fluorometro Qubit 4Thermo Fisher ScientificD33226
Kit di analisi ad alta sensibilità per RNA di qubitThermo Fisher ScientificQ32852quantificazione usando colorante specifico per RNA
SemplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
DNA plasmidiale di espressione di SLFN14OrigeneRC226257clone ORF taggato umano
Cloruro di sodio (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7,4Thermo Fisher ScientificJ60202. K2Materiale di soluzione tamponata da 1 M
Tris (2-carbossilile) fosfina cloridrato (TCEP)Biotecnologia dell'OroTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1Ldetersivo
Colorazione blu di tripanoThermo Fisher ScientificT102820,4% azioni di soluzioni
Preadolescenti 20VWR0777-1Ldetersivo
TwoMPRefeynMP-PRO-00001Fotometro di massa
Colonna Zeba 40K DesaltinThermo Fisher ScientificA57759Cromatografia a esclusione di dimensione

Riferimenti

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